细菌框架图(IF5+)助力耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌研究

2021
11/25

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派森诺生物
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派森诺与福建医科大学附属协和医院李彬老师课题组合作,在微生物基因组领域的《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》

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期刊:《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》

 影响因子:5.239

派森诺与福建医科大学附属协和医院李彬老师课题组合作,在微生物基因组领域的《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》发表新研究成果!本研究针对头孢他啶/阿维巴坦(CAZ/AVI)耐药和敏感的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌进行研究,利用基因组和分子遗传学方法鉴定和验证了产生CAZ/AVI耐药性的原因。

研究背景

耐碳青霉烯肠杆菌科(CRE)的出现和流行引起了广泛关注,其中碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CR-KP)是世界上非常常见的。CR-KP可导致多种感染,如肺炎、血液感染和尿路感染,导致了高发病率和死亡率。多粘菌素、替加环素、氨基糖苷类和磷霉素这些抗生素因为有效性和安全性的限制,致使CR-KP感染的患者几乎没有有效的治疗选择。

头孢他啶/阿维巴坦(CAZ/AVI)是头孢他啶和β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦的新组合,具有抗A、C类和一些D类碳青霉烯酶的活性,是目前治疗肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的一种有价值的替代策略。但CAZ/AVI对B类碳青霉烯酶没有活性,如NDM。到目前为止,全球共检测到31个突变体,在这些突变体中NDM-5于2011年在英国的大肠杆菌中被首次发现,并因其迅速传播而引起了全世界的关注。此外,从人类、动物和医院环境的污水中也都发现产生NDM-5肠杆菌菌株,与其他突变体一样,NDM-5可导致CAZ/AVI耐药性。许多研究发现在CAZ/AVI治疗过程中发生抗性,例如blaKPC突变、基因拷贝数增加和基因过表达等,但是在CAZ/AVI治疗过程中获得NDM基因的病例尚未见报道。在本研究中,报道了治疗KPC-2肺炎克雷伯菌的过程中,由于NDM基因而导致CAZ/AVI耐药的出现,并利用基因组和分子遗传学方法鉴定和验证了产生CAZ/AVI耐药性的原因。

研究材料与方法

实验材料:

福建医科大学协和医院分离到的耐CAZ/AVI和CAZ/AVI敏感的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌。

测序平台:

Illumina NovaSeq

分析内容:

细菌框架图测序、接合实验和质粒稳定性实验、药敏实验、基因克隆和qPCR实验等。

研究结果

 病例报告

在一次交通事故后,一名67岁男子因肺部感染住进ICU,支气管镜下痰培养后开始用替加环素和多粘菌素治疗产生了CR-KP菌株。然而,经支气管镜检查痰培养的菌株在治疗16天后仍然为CP-KP(KP135194)阳性,对CAZ/AVI敏感,对碳青霉烯类抗生素耐药。对患者进行CAZ/AVI治疗11d,在结束治疗的7d后检测显示KP135194再次呈现阳性,并且对CAZ/AVI和碳青霉烯类抗生素均耐药。另外,在KP135194和KP137060之间未分离到其他CR-KP菌株。在入院第19d、21d、37d和42d,在支气管镜检查后痰培养中均发现了嗜麦芽窄食单胞菌,患者随后出院并转往另一家医院。微生物学细节、时间表和使用的抗生素治疗如图1所示。

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图1 CR-KP感染和治疗的时程分析

碳青霉烯类基因克隆和药敏实验

ERIC-PCR分析表明,两株CR-KP分离株具有克隆性关系。KP137060菌株对CAZ/AVI和TGC的MIC值均高与KP135194菌株,MEM、ETP和IMP的MIC相同。两种CP-KPs的药敏图谱如表1所示。克隆实验在两个分离株中都检测到blaKPC-2基因,在菌株KP137060中检测到了blaNDM-5基因。

表1 药敏实验结果

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blaKPC-2,ompK35和ompK37基因的突变和表达研究

PCR扩增和一代测序结果表明,在两株CR-KP分离株中均未发现blaKPC-2基因突变 。使用Resfinder检测ompK35和ompK37也未发现突变,同时ompK36在两株分离株中并未检测到。而blaKPC-2、ompK35和ompK37在两个分离株的表达差异无统计学差异。

表2 两株CR-KP菌株的遗传特性及来源

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 接合实验、质粒稳定性检测和成本评估实验

在研究中发现blaNDM-5基因以1.14x10-4的接合频率成功地转入大肠杆菌J53,而blaKPC-2则失败了,但在PCR检测中证实了blaKPC-2和blaNDM-5的存在。受体细胞和接合子的药敏试验结果如表1所示。质粒稳定性试验表明,携带质粒blaKPC-2和blaNDM-5的质粒在CR-KP中仍能稳定存在150代,而两株CR-KP菌株的生长没有显著差异。体外生长竞争实验结果表明,其相对适宜成本为1.01。

全基因组测序和分析

MLST分析发现这两株CR-KP分离株菌株ST11型,含有β-内酰胺酶基因。全基因组分析表明,KP135194和KP137060菌株高度同源,ANI值为99.99%。核心基因组SNPs分析结果表明,两个菌株的核心基因组中存在23个非同义SNPs。在本研究中,KP137060菌株含有blaNDM-5基因。表2中还检测到其他抗性基因,如rmtB、foA、catA2、sul2、tet(A)和dfrA14基因;毒力基因(rmpA和rmpA2)与超强毒力K相关的荚膜类型(K1和K2)基因相关的hvKp并未检测到。

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图2:质粒图谱

与菌株KP135194相比,KP135194菌株多了一个IncX3质粒。此外,全基因组测序结果表明blaKPC-2(IncFII/IncR)和blaNDM-5(IncX3)分别位于两个不同的质粒上,blaKPC-2和blaNDM-5质粒的全核苷酸序列及质粒大小如图2所示。关于blaKPC-2基因的遗传环境,blaKPC-2基因上游有Tn1331元件,下游有一个可能的ISKpn6类似元件,紧随其后的是korC基因,一个编码假定蛋白基因和一个klcA基因。对于blaNDM-5基因则定位于IS26元件、编码双精氨酸转位途径信号序列域蛋白的基因、编码假定蛋白的基因和编码磷酸化氨基硅酸异构酶基因trpF之间。此外,还有一个IS5元件位于blaNDM-5下游。

研究结论

本研究发现,产KPC-2肺炎克雷伯菌在治疗过程中产生了携带blaNDM-5的质粒,导致对CAZ/AVI耐药性。同时携带NDM-5的质粒具有可转移性,接合频率为1.14x10-4。此外,在携带blaNDM-5的质粒上没有发现明显的适合性成本。因此,通过细菌培养和药敏试验仔细监测耐药性的发展是重要的,并且需要持续监测以避免CAZ/AVI的CR-KP传播。

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关键词:
碳青霉烯,克雷伯菌,AVI,基因组,耐药性,肺炎,细菌,助力,质粒,菌株,药敏

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