科研| 复旦大学：葡萄糖介导的肠道共生细菌的增殖可通过增加蚊子中肠的pH来促进疟原虫感染（国人佳作）

编译：微科盟咖啡里的茶，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

为了确定疟原虫感染是否影响蚊子的代谢，我们分析了斯氏按蚊整体的代谢组学变化。在伯氏疟原虫感染后第1天 (1 dpi) 使用核磁共振 (nuclear magnetic resonance，NMR) 光谱分析。这是动合子侵入中肠上皮并引发基因表达整体变化的阶段。伯氏疟原虫感染导致斯氏按蚊的代谢发生深刻变化。总共有21种代谢物在感染和未感染的蚊子之间显示出不同的丰度 (图1；表S1)。其中包括与葡萄糖代谢相关的代谢物，如海藻糖、葡萄糖、琥珀酸和柠檬酸，它们显著降低了1 dpi，而丙酮酸和乙酸的丰度显著增加 (图1B)。为了检查葡萄糖的减少是否可能是由于蚊子摄入的血液的差异，我们将有和没有寄生虫感染的小鼠的每日血糖水平从0到7 dpi进行了比较。在5 dpi时，直到寄生虫血症达到约15%时，血糖水平才观察到显著差异。这远远高于我们用于蚊子代谢组分析的寄生虫血症 (6%) (图S1)。因此，这些数据表明疟原虫侵入破坏了斯氏按蚊体内葡萄糖代谢的稳态。

接下来，我们专门研究了中肠组织中总葡萄糖和海藻糖的水平，疟原虫在中肠组织中经历了主要的发育转变，包括配子发生、受精和卵母细胞形成。同样地，伯氏疟原虫感染与感染血液1 dpi时中肠内总葡萄糖和海藻糖水平的显著降低有关 (图1C)。因为蚊子的中肠与共生细菌持续相关，为了确定肠道微生物群是否在观察到的疟原虫感染期间的糖减少中发挥作用，我们还测量了用抗生素混合剂处理过的蚊子中肠的总葡萄糖和海藻糖水平。有趣的是，当大部分肠道菌群被移除时，伯氏疟原虫感染不会导致中肠总葡萄糖或海藻糖水平降低 (图1C)。这些结果表明，肠道微生物群有助于疟原虫介导的蚊子葡萄糖代谢的改变。

图1. 伯氏疟原虫感染改变斯氏按蚊的糖代谢。 (A) OPLS-DA评分图 (左) 和相应的加载图 (右) 显示，在感染后1天 (1 dpi)，以正常血液 (NB) 和传染性血液 (IB) 为食的蚊子提取物中的代谢物发生了显著变化。R2X = 0.430，Q2 = 0.857。代谢物关键字与表S1中的相同。(B) 关键糖代谢物的相对含量。对于每个光谱，所有的积分区域都标准化为蚊子的干重。(C) 未经 (正常) 或经抗生素 (Abx) 1 dpi处理的蚊子中肠内总糖水平 (葡萄糖和海藻糖) 的相对浓度。葡萄糖和海藻糖的浓度标准化为从中肠提取的基因组DNA。通过交叉验证的方差分析 (cross-validated ANOVA，CV-ANOVA)方法确定 (A) 中的显著性，p < 0.05为显著性水平。(B) 的显著性由滑动t检验决定。用Tukey检验的方差分析确定 (C) 的显著性。误差线表示扫描电镜 (n = 5)。NS，不显著，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，***p < 0.0001。另见图S1。

为了研究葡萄糖和海藻糖对疟原虫感染的影响，我们首先将新出现的蚊子饲养在含有葡萄糖 (glucose，G)、海藻糖 (trehalose，T) 或10%蔗糖 (sucrose，HS)的2%蔗糖溶液中5天，然后以伯氏疟原虫和恶性疟原虫感染的血液为食 (图2A)。与仅含蔗糖的对照组 (S和HS)，0.1 M葡萄糖和海藻糖组的伯氏疟原虫卵囊数量显著增加 (图2B和S2A)。与蔗糖对照组相比，0.1 M海藻糖组也显示恶性疟原虫卵囊强度增加 (图2C)。然而，蔗糖浓度的简单增加未能增加伯氏疟原虫或恶性疟原虫的感染 (图2B、2C和S2B)。蔗糖浓度的增加没有影响蚊子的血液摄入量或繁殖 (图S2C和S2D)。在通过抗生素处理去除微生物群的蚊子中，蔗糖浓度并不影响疟原虫感染结果 (图S2E)。说明蔗糖水平 (2% ~ 10%) 对蚊虫生理和疟原虫感染的影响不大。通过糖饮食对蚊子感染后血 (IB) 餐口服葡萄糖 (G) 对寄生虫感染没有影响 (图S2F)，这表明葡萄糖和海藻糖影响疟原虫感染的代谢变化(或机制)是在卵囊形成之前开始的。

伯氏疟原虫感染介导的葡萄糖下降和丙酮酸升高表明寄生虫侵入中肠上皮可能增加糖酵解活性。在疟原虫感染前，我们将糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖 (2-DG) 与葡萄糖一起喂给蚊子。饲喂2-DG完全消除了葡萄糖对伯氏疟原虫感染的影响，将其恢复到对照组水平 (图2D)。然而，感染伯氏疟原虫后给予2-DG的蚊子对寄生虫的传染性没有影响(图S2F)。这些结果表明，这些结果表明，在疟原虫感染之前，斯氏按蚊葡萄糖和海藻糖摄取的增加促进了疟原虫的感染。

疟原虫依赖宿主葡萄糖作为能量来源，所以我们接下来研究了葡萄糖介导的伯氏疟原虫感染增强是否可能是由于糖的可用性增加。分别在喂食受感染血液的(-1dpi) 和1dpi后检测中肠和血淋巴中海藻糖+葡萄糖的总水平 (图2E)。通过在高脂饮食、低脂饮食和高脂饮食中喂养蚊子来增加糖的吸收，都显著增加了血液喂养前中肠和血淋巴中的糖水平 (图2E)。用2-DG处理也导致总糖水平增加，特别是在疟原虫感染前的中肠 (图2F)。然而，在喂食HS和2-DG的蚊子中增加的糖水平未能增加疟原虫感染强度。总之，这些数据表明，葡萄糖和海藻糖介导的斯氏按蚊对疟原虫感染敏感性的增加不是由于蚊子体内葡萄糖或海藻糖的可用性增加。

图2. 葡萄糖/海藻糖摄取增加促进斯氏按蚊中肠疟原虫感染。(A) 对按蚊进行糖处理的工作流程。(B和C) 喂食S、G、T和HS饲料的蚊虫中伯氏疟原虫和恶性疟原虫卵囊的密度。(D) 以S、G、2-DG和HS为食的蚊子体内的伯氏疟原虫卵囊密度。(E和F) 分别饲喂 (B) 和 (D) 糖饲料的蚊子感染前一天(- 1 dpi)和1 dpi的中肠 (上)和血淋巴 (下)总糖 (葡萄糖和海藻糖) 的相对浓度。葡萄糖和海藻糖的浓度分别标准化为从中肠和血淋巴中提取的基因组DNA的量。每个点代表一只蚊子，水平线代表中线。(B)–(D)中显示的结果来自至少两个独立实验。显著性由方差分析和Dunn’s检验确定。在 (E) 和 (F) 中的显著性通过方差分析和Dunnett检验来确定。误差线表示扫描电镜 (n = 5)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，***p < 0.0001。s，2%蔗糖；g，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖；t，2%蔗糖+0.1 M 海藻糖；2-DG，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖+5mM 2-DG；HS，10%蔗糖。另见图S2。

几项研究表明，蚊子肠道微生物群影响疟原虫的媒介能力。对于伯氏疟原虫诱导的总碳水化合物的减少依赖于肠道微生物群的发现的启发，我们检查了微生物群是否参与了葡萄糖介导的寄生虫感染的调节。蚊子在感染前被喂食补充了抗生素混合物的S和G，以抑制肠道微生物群。葡萄糖补充导致败血性蚊子中伯氏疟原虫卵囊数量显著增加，但在抗生素处理的无菌蚊子中未能这样的效果 (图3A)。无菌斯氏按蚊的糖含量明显高于未经抗生素处理的组，进一步证实肠道微生物群是糖消耗的原因 (图S3A)。

为了确定负责糖分解代谢的特定细菌，我们使用16S rRNA焦磷酸测序法分析了以S和G为食的蚊子的肠道微生物群落结构 (图3B和S3)。共获得729898个reads，中位长度为415.9 bp，鉴定了1879个细菌操作分类单位 (operational taxonomic units，OTUs)。主成分分析表明，以G饮食为食的蚊子肠道微生物群与以S饮食为食的蚊子肠道微生物群分开聚集 (图S3B)。与S组相比，补充葡萄糖显著增加了在斯氏按蚊中肠的Asaia sp的相对丰度(图3B 和 S3C)，斯氏按蚊的葡萄糖饮食中富集的细菌种类是Asaia bogorensis。实时定量聚合酶链反应的结果证实，补充葡萄糖和海藻糖显著增加了Asaia bogorensis的数量 (图3C)。在斯氏按蚊的中肠也观察到荧光信号增强。通过荧光原位杂交 (fluorescent in situ hybridization ，FISH) 分析 (图3D)，与对照组相比，在饲喂G饲料的斯氏按蚊的中肠中也观察到荧光信号增加。

我们接下来用A. bogorensis对抗生素处理过的蚊子进行了定殖，并分析了它们对伯氏疟原虫感染的易感性。两个dpi，A. bogorensis的丰度明显高于无菌蚊子，认为它成功地在中肠定居 (图S3D)。与抗生素处理组相比，仅A. bogorensis的再定植不能改变感染强度 (图3E)。然而，葡萄糖的加入显著地增加了与A. bogorensis单相关蚊子的卵囊数量中位数，从32个增加到61个 (图3E)。此外，在A. bogorensis的定植显著降低了中肠碳水化合物水平 (图S3E)。总之，这些数据表明，对蚊子施用葡萄糖和海藻糖会促进A. bogorensis在中肠的增殖，这种繁殖使蚊子更容易受到寄生虫感染。

图3. Asaia bogorensis促进斯氏按蚊的伯氏疟原虫感染。(A) 抗生素处理对恶性疟原虫感染的影响。(B) 用16S rRNA焦磷酸测序法研究了以S和G为食的斯氏按蚊中肠主要细菌属的相对丰度。一列代表三个集合的中肠。(C) 用qPCR法测定了斯氏按蚊中肠中的A. bogorensis的丰度。(D) 利用A. bogorensis特异性探针，在以S和G为食的斯氏按蚊中肠定位A. bogorensis (红色)。细胞核用DAPI (蓝色) 染色。方框中的放大图显示在图的右侧。图像代表了至少五只蚊子的中肠。(E) A. bogorensis再定植对恶性疟原虫感染结果的影响。每个点代表一只蚊子，水平线代表中线。(A) 和 (E) 中显示的结果是从两个独立实验中汇集的。显著性由方差分析和Dunn’s检验确定。用单因素方差分析和Dunnett检验确定 (C) 中的显著性。误差线表示扫描电镜 (n = 12)。NS，不显著，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.0001。S，2%蔗糖；G，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖；Abx，抗生素治疗；A.b.，A. bogorensis。另见图S3。

为了确定葡萄糖是如何促进恶性疟原虫感染的，我们首先在喂食S和G的-1和1 dpi的斯氏按蚊中肠之间进行了基于核糖核酸测序 (RNA-seq) 的转录组比较。总共有460和97个基因分别在-1 dpi和1 dpi差异表达 (表S2)。补充葡萄糖显著上调了在-1 dpi时与葡萄糖和一般糖代谢以及转运相关的基因表达。然而，大多数这些基因在1 dpi时下调 (图4A)。值得注意的是，补充葡萄糖和海藻糖显著抑制了Imd途径相关基因的活性 (图4A和S4A)。Imd途径的负调节因子尾侧肽的表达水平显著上调，而肽聚糖识别蛋白pgrp-lc和抗菌肽防御素和杀菌肽在IB餐前后均显著下调 (图4A)。对恶性疟原虫感染敏感性的增加可能部分是由于免疫缺陷 (Imd) 途径的下调。接下来，我们通过拆卸尾部来刺激Rel2调节的免疫基因的表达。用双链RNA靶向绿色荧光蛋白 (double-stranded RNA targeting green fluorescent protein，dsGFP) 处理的蚊子作为对照 (图S4B)。然而，在这些蚊子中补充糖食和葡萄糖导致与S饮食的蚊子相似的感染易感性增加 (图S4C)。尾部沉默也不影响A. bogorensis的丰度 (图S4D)。因此，Imd途径似乎不是葡萄糖介导的恶性疟原虫感染增加的唯一原因。

此外，我们观察到一组编码液泡型ATPase (V-ATPase) 亚基的基因，如H_N1，_H_N2，_H_N3，_H_N4，_G1，_G2，和 _C，在两个时间点G和S分组之间受到差异调节 (图4A)。V-ATPase水解ATP并通过膜转运质子。这种酶对于控制细胞内和细胞外的pH至关重要。为了检验V-ATPase是否与葡萄糖诱导的载体能力增加有关，我们通过特异性敲除编码细胞质V1结构域亚单位H (V-ATPase_H_N3) 的VATPase基因或通过在正常S-饲养的蚊子中用V-ATPase抑制剂巴非霉素A1补充糖食来损害V-ATPase的功能 (图4B)。与以S为食的蚊子中的dsGFP对照相比，沉默该基因显著增加了染色体数目 (图4C和图4E)。同样，与未处理的对照组相比，口服巴非霉素A1至斯氏按蚊显著增加了恶性疟原虫的卵囊数量 (图4D)。这些结果表明葡萄糖诱导的恶性疟原虫感染增强可能是调节V-ATPase活性的结果。

由于V-ATPase参与维持蚊子中肠的pH平衡，我们接下来研究了破坏V-ATPase表达是否会影响中肠pH。正如预期的那样，通过基因沉默或补充巴非霉素A1抑制V-ATPase活性，与对照组相比，中肠pH增加，如m-甲酚紫pH染色分析所示 (图4E和4F)。因此，这些结果表明抑制V-ATPase活性会导致中肠pH升高。我们接下来研究了补充葡萄糖是否会影响中肠pH。用S、G、T、HS或2DG喂养蚊子5天，解剖中肠进行pH分析 (图4G)。与对照组相比，添加葡萄糖和海藻糖显著增加了中肠的pH (图4G)。2-DG对糖酵解的抑制将葡萄糖诱导的pH变化恢复到对照组水平 (图4G)。因此，我们的结果表明，葡萄糖和海藻糖的给药失调了V-ATPase的表达，而V-ATPase又负责维持中肠pH的稳态。

为了研究pH升高是否会增强疟原虫的感染，我们接下来用含有不同浓度碳酸氢钠的2% S喂养斯氏按蚊 (图4H和4F)。添加0.1 M碳酸氢钠会显著增加中肠的pH，并显著增加对感染的易感性，这是通过与对照蚊子相比卵囊数量的增加来衡量的 (图4I、S4F和S4G)。在这些蚊子中，我们还观察到恶性疟原虫感染前后Imd信号活性显著降低，这表明免疫活性的下调可能是pH升高的结果 (图S4H)。为了进一步验证pH影响疟原虫感染，我们用多种酸通过2%的糖食喂养斯氏按蚊 (图4H)，与对照组相比，发现乙酸、乳酸和琥珀酸酸化了中肠，并显著减少了卵囊数量 (图4J)。综上所述，这些发现表明，在蚊子体内施用葡萄糖/海藻糖会扰乱中肠的pH稳态，从而促进疟原虫感染。

图4. 中肠pH值决定斯氏按蚊对恶性疟原虫感染的易感性。(A) 饲喂S和G 在 -1 dpi和1 dpi的蚊子中肠差异表达基因的层次聚类分析。上调的基因以红色显示；下调基因以绿色显示。(B) 斯氏按蚊的双链RNA注射流程 (C) 和BAF A1处理 (D)。(C和D) 在dsRNA (C)和BAF A1 (D)处理下的恶性疟原虫卵囊数量。(E和F) 用pH指示剂间甲酚紫对经dsRNA (E)和BAF A1 (F)处理的蚊虫中肠进行pH染色。pH指示器显示在右边。图像是至少五只蚊子中肠的三个代表。(G) 间甲酚紫对S、G、T、HS和2-DG饲料喂养的蚊虫中肠pH染色。日常喂食S、G、T、HS和2-DG测定蚊虫pH的工作流程 (左)。不同饮食中中肠的pH值染色 (右图)。这些图片代表了至少5只蚊子的中肠。(H) 斯氏按蚊NaCHO₃(I) 和酸处理 (J) 的工作流程。(I) 补充NaCHO₃对恶性疟原虫感染的影响。NaCHO₃处理后，喂食NaCHO₃的中肠的pH染色 (左) 和疟原虫卵囊数量 (右)。图像是至少五只蚊子中肠的三个代表。(J) 补充酸对恶性疟原虫感染的影响。用pH指示剂酚红(左)显示不同饮食中肠的pH染色。底部显示了pH指示物。酸处理后的疟原虫卵囊数量如图(右)。图像是至少五只蚊子中肠的三个代表。每个点代表一只蚊子，水平线代表中线。(C)、(D)、(I) 和 (J) 中显示的数据来自两个独立的实验。显著性由(C)、(D) 和 (I) 中的Mann-Whitney检验和 (J) 中的Dunn’s检验通过方差分析确定。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p< 0.0001。S，2%蔗糖；GG，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖；T，2%蔗糖+ 0.1 M海藻糖；2-DG，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖+5mM 2-DG；HS，10%蔗糖，氯化钠，2%蔗糖+ 0.1 M氯化钠。另见表S2和图S4。

鉴于我们发现葡萄糖和半乳糖的添加促进了肠道共生菌A. bogorensis的增殖并增加了中肠的pH，我们很想知道是否A. bogorensis可能是控制中肠酸碱平衡的主要原因。采用间甲酚紫色染料测定了以S和G为食的A. bogorensis单定殖且经抗生素处理的蚊虫中肠pH值。用抗生素处理过的蚊子，饮食和定殖相同肠道细菌的蚊子被用作对照。葡萄糖饮食和A. bogorensis的再定殖都不能增加中肠的pH (图5A)。能有效抑制疟原虫感染的肠杆菌的定殖不会影响中肠pH值 (图S4I和S4J)。与未喂食抗生素的蚊子相比，只有喂食抗生素的蚊子中肠的pH显著增加 (图5A)。结合我们之前发现的葡萄糖选择性增殖A. bogorensis，这些结果表明A. bogorensis的葡萄糖分解代谢活性可能有助于蚊子中肠的pH变化。

由于在分析蚊子中肠的A. bogorensis代谢物方面存在技术困难，我们使用核磁共振分析比较了A. bogorensis在添加0.1 M葡萄糖或海藻糖的2%蔗糖存在下生长3天的条件培养基的糖代谢物。不同的糖成分不影响A. bogorensis的生长 (图5B)。然而，补充葡萄糖和海藻糖显著改变了15种代谢物的水平，两种葡萄糖代谢物（柠檬酸和琥珀酸）显著降低 (图5C；表S3)。这些酸的减少可能导致培养基中pH值的增加。我们接下来检查了条件培养基的pH，发现添加葡萄糖和海藻糖的培养基pH值高于单独添加蔗糖的培养基 (图5D)。这些数据表明，A. bogorensis能够调节其代谢活动，以响应不同的碳水化合物，导致中肠pH的变化。

图5. A. bogorensis的葡萄糖代谢活性决定了中肠的pH。(A) A. bogorensis再定殖对蚊子中肠pH的影响。图像是至少五只蚊子中肠的三个代表。 (B) A. bogorensis在S、G和T生长的细菌数量。(C) 三种条件培养基中关键糖代谢产物的相对含量。(D) A. bogorensis生长后3天，含S (蓝色)、G (红色) 和T (绿色) 培养基的pH值。(B) - (D)中的显著性由用单因素方差分析和Dunnett检验确定。误差线表示扫描电镜 (n=5)。NS，不显著，*p<0.05，***p<0.001. S，2%蔗糖；G，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖；T，2%蔗糖+ 0.1 M海藻糖。另见图S4。

当疟原虫从哺乳动物宿主 (pH = 7.2) 传递到蚊子中肠 (pH = 8) 时，pH值的增加会触发疟原虫-雄配子发生。基于我们的发现，即A. bogorensis的增殖增加了中肠的pH，我们假设这种pH的升高可能有利于中肠恶性疟原虫的性发育。疟原虫进入蚊子中肠后15分钟左右，配子就会发育。我们首先定量分析了在感染后10分钟喂食四种糖食 (S、G、2DG和HS) 的斯氏按蚊中肠中与疟原虫雄配子体形成相关的六个疟原虫基因的mRNA丰度 (图6A)。这些基因是钙依赖性蛋白激酶1 (cdpk1)、蛋白磷酸酶1 (ppm1)、基体蛋白SAS-6 (sas-6)、性阶段特异性肌动蛋白亚型肌动蛋白2 (actin 2)、配子输出和子孢子穿越蛋白 (gest) 和雄性发育基因1 (mdv-1)。

正如预期的那样，六个基因中的五个 (cdpk1、ppm1、sas-6、gest和mdv-1) 在葡萄糖喂养的蚊子的中肠中显著上调，而以2DG或HS为食并不影响这些基因中大多数的表达水平 (图6A)。接下来，我们分析了以S和G为食在感染后10分钟相同的6个基因在A. bogorensis重新定殖到斯氏按蚊中肠中的表达水平 (图6B)。葡萄糖喂养的蚊子体内A. bogorensis的定殖显著提高了与小配子发育相关的6个基因中4个基因的表达 (图6B)。类似地，添加NaCHO₃诱导了大多数这些基因的表达，而没有改变恶性疟原虫的线粒体能量代谢 (图S5)。为了进一步证实pH的增加会促进雄配子体的形成，我们使用Giemsa染色法对蚊子中肠的血团进行染色，以此来观察外鞭毛的形成。G和T喂养的蚊子比S喂养的蚊子有明显更多的外鞭毛和更高的外鞭毛率 (图6C和6D)。这些结果表明，中肠pH升高上调了配子发生相关基因的表达，从而促进了中肠雄配子的形成。

图6. pH的增加诱导雄配子体的形成。(A) 用S、G、2-DG和HS喂养的蚊子雄配子发生相关基因mRNA丰度的定量分析。(B) 用S和G饲养A. bogorensis再定殖蚊子的雄配子发生相关基因mRNA丰度的定量分析。(C和D) 以S、G和T为食的蚊子的鞭毛数和鞭毛率。在感染10分钟后监测鞭毛数。每10⁵个红细胞的平均鞭毛数如图(C)所示，鞭毛率为每10⁵个红细胞中鞭毛数/配子细胞的百分比 (D)。在 (A) 和 (B) 中的显著性由单因素方差分析和Dunnett检验确定。误差线表示扫描电镜 (n = 5)。每个点代表一只蚊子，水平线代表 (C) 和 (D) 中的中位数。(C) 和 (D)中显示的数据来自两个独立的实验。显著性由单因素方差分析和Holm Sidak’s检验确定。NS，不显著，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。S ，2%蔗糖；G，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖；T，2%蔗糖+ 0.1 M海藻糖；2-DG，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖+5mM 2-DG；HS，10%蔗糖。另请参见图S5。

研究表明，天然植物的多样性影响按蚊传播疟原虫的能力。我们假设不同植物蜜腺的糖成分可能以影响按蚊媒介能力的方式不同地促进A. bogorensis的增殖。我们比较了蚊子体内以糖为食的A. bogorensis的丰度，糖食模拟了在肯尼亚西部发现的五种植物 (Tecoma stans、Senna didymobotrya、Ricinus communis、Parthenium hysterophorus和Lantana camara)在血食前的花蜜 (图7A)。T. stans和S. didymobotrya的花，R. communis 和P. hysterophorus的叶和茎是肯尼亚西部冈比亚按蚊最喜爱的糖源，而L. camara叶和茎的植物汁液是最不受欢迎的。根据五种植物的组成和水分含量，根据既定配方配制糖溶液 (图7A)。与葡萄糖一样，T. stans和S. didymobotrya显著增加了A. bogorensis的丰度 (图7B)。我们接下来检查了这些蚊子对恶性疟原虫感染的易感性。与对照组相比，A. bogorensis增殖了的蚊子具有明显更高的卵囊数量 (图7D)。通过方差分析，葡萄糖的丰度与A. bogorensis数 (图7E) 和卵囊数 (图7F) 呈正相关。虽然T. stans，S. didymobotrya，R. communis和P. hysterophorus是按蚊最喜欢的四种植物物种，但它们对A. bogorensis的增殖能力各不相同。那些促进A. bogorensis增殖的物质也有助于蚊子感染疟原虫。

图7. 糖成分影响A. bogorensis的丰度和伯氏疟原虫感染结果。(A) 模拟天然植物花蜜的糖溶液配方。(B) 斯氏按蚊的糖处理流程。(C) 喂食不同糖饲料的蚊虫中A. bogorensis水平的定量分析。(D) 饲喂不同糖食的蚊子卵囊数量。(E和F) 每个糖成分组中的 A. bogorensis载量 (E) 和卵囊数 (F) 的箱线图 (蔗糖= 0表示该组蔗糖含量不大于0.022 g/ mL; 蔗糖= 1表示该组蔗糖含量高于0.022 g/mL;葡萄糖= 0表示含量不大于0.44 g/mL; 葡萄糖= 1表示含量高于0.44 g/mL)。(C) 中的显著性由单因素方差分析和Dunnett检验确定。误差线表示扫描电镜 (n = 12)。每个点代表一只蚊子，水平线代表 (D) 中的中位数。(D)中显示的数据来自两个独立的实验。由单因素方差分析和Dunn’s检验确定 (D) 的显著性。用方差分析估计 (E) 和 (F) 的显著性。(E) 和 (F) 中的蔗糖和葡萄糖含量均按其中位数(分别为0.022 g/mL和0.44 g/mL) 划分为分类变量。NS =不显著，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，***p < 0.0001。S，2%蔗糖；G，2%蔗糖+ 0.1 M葡萄糖；P.h., P. hysterophorus; R.c., R. communis; L.c., L. camara; T.s., T. stans; S.d., S. didymobotrya。

糖是蚊子的主要能量来源，但它对蚊子传播病原体能力的影响尚不清楚。在这项研究中，我们证明了疟原虫感染破坏了斯氏按蚊体内葡萄糖代谢的稳态。这种干扰依赖于共生细菌A. bogorensis的存在。这种细菌的增殖会改变葡萄糖代谢，增加中肠的pH，从而促进疟原虫配子体的形成和感染。

与哺乳动物阶段的快速增殖不同，疟原虫在蚊子感染的早期阶段会急剧减少。即使数量减少，恶性疟原虫感染仍然引起斯氏按蚊代谢的显著变化，特别是葡萄糖和海藻糖的水平在1 dpi时显著降低。在此，我们证明了疟原虫感染期间葡萄糖和海藻糖的减少是由于肠道微生物群的存在。吸血后24小时肠道微生物群的指数增殖可能调节蚊子的新陈代谢，这种调节可能会随着疟原虫感染而变化。虽然我们证明了蚊子体内葡萄糖和海藻糖的变化不是由小鼠血浆中葡萄糖的变化引起的，但我们不能排除蚊子体内其他代谢物的水平可能通过摄入传染性小鼠血液而受到影响的可能性。这些代谢物也可能在调节蚊子的媒介能力方面发挥作用。将来研究小鼠血浆中的代谢物对疟原虫从宿主传播到蚊子的影响将是有意义的。

葡萄糖是所有生物的重要能量来源。海藻糖是昆虫主要的血淋巴糖，转化为葡萄糖后可以利用。我们的数据显示，补充海藻糖会增加伯氏疟原虫和恶性疟原虫的感染。然而，葡萄糖对恶性疟原虫感染没有影响。在这项研究中，恶性疟原虫是在与人血完全不同的血液培养基中体外培养的。这种差异，尤其是培养基中葡萄糖浓度和pH的增加，可能会影响恶性疟原虫，使其对葡萄糖处理无反应。为了模拟体内感染过程，我们主要使用从小鼠自然传播给蚊子的伯氏疟原虫。

我们接下来证明了A. bogorensis参与中肠pH的调节。A. bogorensis将乙酸盐和乳酸盐氧化成二氧化碳和水，但不将乙醇氧化成乙酸。我们的代谢组学数据显示，在补充了葡萄糖和海藻糖的条件培养基中，柠檬酸盐和琥珀酸盐显著减少。这些结果证实，与肠道中的其他细菌相比，A. bogorensis的产酸能力较低。这解释了为什么在补充了葡萄糖和海藻糖的蚊子中，A. bogorensis的增殖会导致中肠pH的增加。然而，在用这种细菌重新繁殖的抗生素处理过的蚊子中，没有观察到海藻糖和葡萄糖促进A. bogorensis的增殖。同样，A. bogorensis在S、T和G培养基中的生长速度也是相当的。一种解释是，其他肠道共栖动物可能会与A. bogorensis争夺糖食蚊子体内的碳。当添加葡萄糖或海藻糖时，A. bogorensis通过利用这两种碳水化合物而优于其他细菌。当A. bogorensis是唯一存在的细菌时，其生长不受葡萄糖、海藻糖或蔗糖的影响，但其代谢受到差异调节。这里的另一个限制是，由于核磁共振需要大量样品，我们很难检测蚊子中肠的代谢物变化。需要利用其他技术进一步研究代谢产物在体内的动力学。

众所周知，pH的增加会在体外引发雄性配子发生。我们证明了中肠的pH增加如预期的那样促进了小配子的形成。与我们的发现一致，冈比亚按蚊共生细菌定殖引起的采采蝇中肠酸化抑制锥虫感染。微碱性条件会增加寨卡病毒的存活率和传染性，并促进其从哺乳动物传播给伊蚊。

蚊子能够区分植物物种。以首选植物为食会增加它们的寿命和繁殖力。来自不同植物物种的糖也会影响按蚊传播疟疾寄生虫的能力。虽然我们没有疟疾流行地区的天然植物，但通过使用含有四种最受欢迎和一种最不受欢迎植物汁液的相同成分的人工糖粉，我们证明了植物汁液的糖组成通过促进A. bogorensis的增殖来决定载体的能力。值得注意的是，P. hysterophorus是一个例外，蚊子经常以它为食，但寿命和繁殖力却下降了。此外，与其他蚊子喜欢的植物相比它也不会促进恶性疟原虫感染。因此，P. hysterophorus可能是一种理想的植物物种，可以减少蚊子传播疟疾的潜力。需要进一步的研究来调查天然植物汁液对野外按蚊微生物群组成的影响，并检查A. bogorensis对野外蚊媒疟原虫感染结果的影响。

总之，我们的研究对说明斯氏按蚊的葡萄糖代谢与其肠道微生物群的一个组成部分A. bogorensis之间的复杂相互作用如何影响疟原虫感染提供了至关重要的分子见解。我们的工作揭示了肠道微生物群影响蚊子代谢和寄生虫感染的机制。我们还提供了证据，表明植物汁液中不同的糖成分可能通过调节A. bogorensis的增殖而影响疟疾的传播。因此，我们的工作为更全面地了解疟蚊、肠道微生物群和疟疾寄生虫之间的代谢相互作用迈出了重要的一步。

我们的数据表明，补充葡萄糖/海藻糖通过增加中肠pH促进疟原虫感染。肠道微生物群、A. bogorensis和蚊子V-ATPase都负责调节中肠pH。然而，这两种成分是独立工作还是协同工作仍然未知。需要进一步的研究来解开V-ATPase和肠道微生物群在中肠pH调节中的相互作用。