科研 | 中国农大:绿茶多酚给药小鼠的肠道菌群改善肠上皮稳态并缓解实验性结肠炎(国人佳作)

2021
11/22

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微生态
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肠道微生物群的这些变化随后导致丁酸等保护性SCFAs的产生增加,进而触发显著的抗氧化、抗炎和屏障增强程序,从而减轻肠道炎症和损伤。

编译:微科盟阿Z,编辑:微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

背景:肠道菌群的改变可能有助于炎症性肠病(IBD)的发展。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶的主要生物活性成分,已知对缓解IBD有益。然而,当EGCG减弱IBD时,肠道菌群是否发挥作用尚不清楚。

结果:我们首先探索了口服或直肠EGCG递送对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。我们的结果表明,口服而非直肠EGCG增强了抗炎作用和结肠屏障完整性。通过增加阿克曼菌(Akkermansia)丰度和丁酸产量,我们观察到EGCG介导的肠道菌群的明显改变。接下来,我们证明了EGCG预补充诱导了与口服EGCG类似的有益结果。在DSS诱导的小鼠中,预防性EGCG可减轻结肠炎并显著增加短链脂肪酸(SCFAs)产生菌,如阿克曼菌及SCFAs的产生。为了验证这些发现,我们采用粪菌移植(FMT)和无菌粪便滤液(SFF)接种DSS处理的小鼠。与对照组小鼠和SFF相比,EGCG给药小鼠的菌群减轻了结肠炎,表现出优越的抗炎作用和结肠屏障完整性,并且还富集了阿克曼菌等细菌和SCFAs。总的来说,口服EGCG减轻结肠炎表明SCFAs产生菌阿克曼菌和SCFAs密切相关,预防处理和FMT进一步证明了这一点。

结论:本研究首次提供了口服EGCG以肠道菌群依赖的方式改善结肠炎症的数据。我们的结果为EGCG介导的IBD缓解和EGCG作为肠道菌群预防和治疗IBD的潜在调节剂提供了新的见解。

论文ID

名:Gut microbiota from green tea polyphenol-dosed mice improves intestinal epithelial homeostasis and ameliorates experimental colitis

绿茶多酚给药小鼠的肠道菌群改善肠上皮稳态并缓解实验性结肠炎

期刊Microbiome

IF:14.650

发表时间:2021.9.7

通讯作者:王军军

通讯作者单位:中国农业大学动物科技学院

DOI号:10.1186/s40168-021-01115-9

实验设计

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图1. 整个实验的研究设计。   EGCG,表没食子儿茶素没食子酸酯;DSS,葡聚糖硫酸钠;FMT,粪菌移植;SFF,无菌粪便滤液。  

结果

1 口服而非直肠EGCG给药减轻了DSS诱导的结肠炎

为了研究EGCG对DSS诱导的结肠炎的缓解作用,在小鼠中连续7天饲喂2.5% DSS水溶液来诱导实验性结肠炎,然后根据我们之前观察到的最佳剂量(数据未显示),连续3天每天口服(图2a)或直肠给药(图S1a)50 mg/kg体重的EGCG。为了探索口服EGCG或肠内递送EGCG如何减轻DSS诱导的结肠炎,测定了两种不同方法处理的小鼠的症状。如图2b-e所示,与DSS组相比,口服EGCG干预显著减轻了DSS诱导的结肠炎,表现为疾病活动指数(DAI,体重减轻、粪便稠度和直肠出血的综合评分)评分显著降低,体重下降减少,结肠缩短缓解。然而,直肠递送EGCG未能改善上述任何测量结果(图S1b、图S1c、图S1d和图S1e)。组织学分析进一步显示,口服EGCG(图2f和g)而非直肠EGCG(图S1f和图S1g)后,结肠中的炎症细胞浸润和粘膜损伤以及整体组织学评分明显减轻

为了进一步评估EGCG对全身和肠道炎症反应的影响,测定了血浆和结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)和促炎细胞因子。口服EGCG后,DSS处理小鼠血浆中IL-1β(图2h)、IL-6(图2i)、IL-8(图2j)和TNF-α(图2k)的浓度显著降低。相反,直肠EGCG未能抑制血浆中的这些细胞因子(图S1h、图S1i、图S1j和图S1k)。类似地,DSS显著提高了小鼠结肠中MPO的浓度,但口服EGCG显著抑制了这种升高(图2l)。此外,口服和直肠EGCG均显著降低了结肠中IL-6的水平(图2m和S1m),TNF-α也表现出明显的下降趋势(图2n和图S1n)。然而,直肠EGCG未能降低DSS处理小鼠结肠中MPO的水平(图S1l)。

总之,这些结果表明,口服EGCG可改善临床结肠炎症状和结肠损伤,但直肠EGCG不能。

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图2. 口服EGCG减轻了DSS诱导的实验性结肠炎。a 本研究中使用的小鼠结肠炎模型示意图。表明了采用口服磷酸盐缓冲液(PBS)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理。b 在整个研究期间每日疾病活动指数(DAI)评分的动力学。c 在整个研究期间每日体重的变化。数据以平均值表示 ± 标准误(n = 7-8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001,相对于Oral-CON组;##P ≤ 0.01,###P ≤ 0.001,相对于DSS+Oral-PBS组。d 结肠的宏观图像和e各组结肠的长度(n = 7-8/组)。f H&E染色结肠切片和g结肠组织学评分(n = 6/组)。血浆中四种具有代表性的促炎细胞因子IL-1β(h)、IL-6(i)、IL-8(j)和TNF-α(k)的浓度。结肠中髓过氧化物酶(MPO)(l)、IL-6(m)和TNF-α(n)的浓度。数据以平均值表示 ± 标准误(n = 7-8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。

  2 口服EGCG抑制DSS诱导的肠粘膜氧化应激并改善屏障功能

为了评估EGCG对氧化应激的影响,测定血浆和结肠中的总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)和丙二醛(MDA)。与正常对照组相比,口服EGCG可显著降低结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT的浓度,增加MDA的水平(图3a、b和c)。然而,与正常对照组相比,DSS诱导的结肠炎小鼠血浆T-SOD和CAT浓度的抑制并未受到直肠EGCG的明显影响,尽管MDA水平也有所降低(图S2a、图S2b和图S2c)。DSS可显著降低结肠T-AOC和T-SOD水平,但口服EGCG可使其降至正常水平(图3d和e)。在口服或未口服EGCG的情况下,在结肠中观察到响应DSS的CAT或GSH-px水平没有显著差异(图3f和g)。口服EGCG可使结肠MDA浓度降至正常水平(图3h)。然而,DSS对T-AOC、T-SOD、CAT或MDA的作用并未受到直肠EGCG的明显影响(图S2d、图S2e、图S2f和图S2h)。值得注意的是,即使与正常组的结肠相比,直肠EGCG也显著增加了结肠中GSH-px的水平(图S2g)。然而,口服和直肠EGCG对减少细胞凋亡没有明显作用(图3i、j、S2i和S2j)。为了评估口服或直肠EGCG对结肠粘膜屏障的影响,采用阿利新蓝染色法测定结肠上皮中分泌粘蛋白的杯状细胞。DSS可显著降低结肠上皮粘膜的厚度,口服EGCG可将这种抑制作用缓解至正常(图3k)。如透射电子显微镜(TEM)所示,口服EGCG在很大程度上逆转了DSS诱导的刷状边缘和紧密连接精细结构的破坏(图3l)。

这些结果表明,口服EGCG而非直肠EGCG能抑制DSS诱导的氧化应激,并减轻DSS损伤的粘膜屏障功能。

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图3. 口服EGCG可减轻氧化应激和结肠损伤。各组血浆中T-SOD(a)、CAT(b)和MDA(c)的浓度。d 结肠T-AOC水平。结肠中T-SOD(e)、CAT(f)、GSH-px(g)和MDA(h)的浓度(n = 7-8/组)。i 结肠切片的细胞凋亡率(n = 6/组)。j 结肠切片TUNEL染色的代表性荧光图像。比例尺代表50 μm。k 结肠切片内黏液层阿利新蓝染色代表图像。比例尺代表50 μm。l TEM显示结肠上皮微观结构的代表性图像。数据以平均值表示 ± 标准误。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。

  3 口服EGCG调节肠道菌群的组成和SCFAs的产生

接下来,我们通过16S rRNA基因测序,进一步探索EGCG对接受口服或直肠EGCG的DSS治疗小鼠肠道微生物群组成的影响。在结肠炎小鼠中,ASV水平的sobs指数显示α多样性不受口服EGCG和直肠EGCG的影响(图4a,图S3a)。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)显示,正常对照组和结肠炎小鼠的肠道菌群结构存在分离(R2=0.337,P=0.001,图4b;R2=0.360,P=0.001,图S3b)。DSS+Oral-EGCG组和DSS+Oral-PBS组之间的肠道菌群结构也出现分离(R2 = 0.124,P = 0.028),表明口服EGCG显著影响结肠炎小鼠的肠道菌群结构。此外,直肠EGCG显著影响粪便微生物群结构(R2=0.13,P=0.011)。

在门水平上,拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是粪便微生物群中的优势门(图4c和图S3c)。在属水平上,粪便微生物群主要由拟杆菌属(Bacteroides)、norank_f_Muribaculaceae和乳杆菌属(Lactobacillus)组成(图4d和图S3d)。通过LEfSe分析鉴定了响应口服或直肠EGCG的DSS处理小鼠中差异丰富的粪便细菌分类群。此外,我们发现口服EGCG对包括阿克曼菌在内的四个细菌属进行了富集,而其他五个分类群仅在DSS组中富集(图4e)。两种细菌属对直肠EGCG的反应特别丰富,而其他五种分类群【例如,乳杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)和罗姆布茨菌属(Romboutsia)】仅在DSS组中富集(图S3e)。

为了进一步探索口服或直肠EGCG对SCFAs产生的影响,我们测定了粪便中乙酸、丙酸和丁酸的浓度。DSS显著减少了所有三种SCFAs,但口服EGCG显著提高了丙酸和丁酸的产量(图4f、g和h),而直肠EGCG无明显改善(图S3f、图S3g和图S3h)。事实上,DSS处理的小鼠对直肠EGCG的反应中丁酸产量进一步显著减少(图S3h)。

进一步进行Spearman相关分析,以了解差异富集微生物与抗氧化、炎症参数或SCFAs谱之间的关联。相关分析表明,阿克曼菌与血浆CAT水平(R >0.52,P<0.05)、结肠T-AOC水平(R >0.63,P<0.05)、粪便乙酸(R>0.56,P < 0.05)、丁酸(R>0.65,P < 0.01)水平均呈较强正相关,与血浆IL-8(R < - 0.61,P < 0.05)呈显著负相关(图4i)。而结肠炎组中富集的乳杆菌属与结肠TNF-α水平呈强负相关(R < -0.59,P < 0.05,图S3i)。

综上所述,结肠炎小鼠肠道菌群的改变和SCFAs产生的增加是口服EGCG而不是直肠EGCG给药的反应,这表明肠道菌群可能在缓解DSS诱导的结肠炎中发挥关键作用。

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图4. 口服EGCG调节肠道菌群的组成和功能。a 以Sobs指数为代表的口服治疗后的α多样性。b 由PERMANOVA评估的口服治疗主坐标分析(PCoA)图。粪便细菌门的相对丰度(c)和属(d)在口服治疗后出现在99.5%的群落中。e 分析口服治疗后LEfSe(线性判别分析(LDA)结合效应大小测量)显示的微生物类群的差异。口服治疗后的粪便乙酸(f)、丙酸(g)和丁酸(h)浓度。数据以平均值表示 ± 标准误(n = 7-8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。i 口服EGCG后DSS处理小鼠肠道菌群与抗炎或抗氧化参数之间的Spearman相关性。红色表示正相关,而蓝色表示负相关。颜色的强度与Spearman相关性的强度成正比。*P ≤ 0.05,***P ≤ 0.001。

  4 预防性补充EGCG可减轻DSS诱导的结肠炎

鉴于绿茶消费在降低IBD风险方面的益处以及口服和直肠递送EGCG对肠道菌群的不同影响,我们随后探索了EGCG对DSS诱导结肠炎的预防作用。小鼠接受每日灌胃给药50 mg/kg体重的EGCG 21天(图5a),并在最后6天接受2.5% DSS水溶液以诱发急性结肠炎,这也是一个成年人每天喝4到8杯茶的模拟实验。每天监测疾病症状和体重,然后处死小鼠并评估结肠病理学,同时还测定了血浆和结肠中几种具有代表性的炎症介质的浓度。显然,预防性EGCG缓解了DSS处理小鼠的结肠炎症状,表现为每日DAI显著减少(图5b)和体重减轻(图5c)以及结肠长度增加(图5d和e)。组织学分析进一步显示,预防性EGCG抑制DSS诱导的炎症细胞浸润和结肠粘膜损伤(图5f和g)。此外,预防性EGCG倾向于降低结肠炎小鼠血浆中IL-1β(图5h)、IL-6(图5i)、IL-8(图5j)和TNF-α(图5k)的水平。值得注意的是,结肠中DSS升高的MPO(图5l)、IL-6(图5m)和TNF-α(图5n)水平在预防性EGCG的作用下大大降低至正常水平。

这些结果共同表明,预防性EGCG能够抑制DSS诱导的结肠炎症状、结肠损伤和炎症。

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图5. 预防性EGCG可减轻DSS诱导的结肠炎症状。a 本研究中采用的实验设计示意图。b DSS处理后DAI评分的动力学。c DSS处理后的每日体重变化。数据表示为平均值 ± 标准误(n = 8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001,相对于CON组;&P ≤ 0.05,&&P ≤ 0.01,&&&P ≤ 0.001,相对于EGCG组;#P ≤ 0.05,##P ≤ 0.01,###P ≤ 0.001,相对于DSS组。d 结肠的宏观图像和e 各组结肠的长度(n = 8/组)。f 结肠组织学评分(n = 6/组)和g H&E染色结肠切片。血浆中四种具有代表性的促炎细胞因子IL-1β(h)、IL-6(i)、IL-8(j)和TNF-α(k)的浓度。结肠中MPO(l)、IL-6(m)和TNF-α(n)的浓度。数据表示为平均值 ± 标准误(n = 8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。

  5 预防性EGCG降低DSS诱导的氧化应激和凋亡并改善粘膜屏障功能

预防性EGCG大大减轻了DSS显著降低的抗氧化酶、T-SOD和CAT的血浆水平(图6a和b)。一致的,DSS显著增加血浆中的MDA,但预防性EGCG使其降低至正常水平(图6c)。类似地,DSS可显著降低结肠T-AOC(图6d)、T-SOD(图6e)、CAT(图6f)和GSH-px(图6g)水平,但预防性EGCG可使其大幅缓解至正常水平。DSS使结肠MDA水平显著升高,但预防性EGCG使其恢复到正常水平以下(图6h)。值得注意的是,EGCG预补充甚至在健康小鼠的血浆和结肠中引起明显的抗氧化反应(图6a-h)。

TUNEL分析进一步显示DSS显著增加结肠粘膜中凋亡细胞的频率,但预防性EGCG在很大程度上扭转了这一趋势(图6i和j)。此外,预防性EGCG还能减轻DSS损伤的结肠粘液和结肠屏障的精细结构(图6k和l)。

这些结果表明,预防性EGCG能够抑制DSS诱导的氧化应激,调节细胞凋亡,并恢复结肠上皮的粘膜屏障功能。

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图6. 预防性EGCG可减轻氧化应激和结肠损伤。血浆中T-SOD(a)、CAT(b)和MDA(c)的浓度。结肠中T-AOC(d)、T-SOD(e)、CAT(f)、GSH-px(g)和MDA(h)的水平(n = 8/组)。i结肠切片中的细胞凋亡率(n = 6/组)。j 结肠切片TUNEL染色的代表性荧光图像。比例尺代表50 μm。k 结肠切片阿利新蓝染色的内粘液层的代表性图像。比例尺代表50 μm。l 透射电镜下结肠上皮微观结构的代表性图像。数据表示为平均值 ± 标准误。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。

  6 预防性EGCG调节肠道菌群组成及其SCFAs的产生

接下来,我们研究了预防性EGCG对DSS处理小鼠肠道菌群组成的影响。与其他三组相比,EGCG组ASV水平的Sobs指数显著增加(P < 0.01,图7a)。PCoA分析显示对照组和DSS处理组之间存在明显的分离(R2 = 0.479,P = 0.001,图7b)。此外,预防性EGCG显著影响CON和EGCG组之间的肠道菌群组成(R2 = 0.173,P = 0.001),以及DSS和EGCG + DSS组之间(R2 = 0.231,P = 0.001)。同时,各组小鼠在门和属水平上的总体粪便细菌组成与第一次试验一致(图7c和d)。值得注意的是,健康小鼠口服EGCG导致了包括阿克曼菌在内的13个细菌属的富集,而在正常对照组中只有4种细菌属富集(图7e)。此外,在通过EGCG预处理的结肠炎小鼠中,阿克曼菌、粪杆菌属(Faecalibaculum)和双歧杆菌属(Bifdobacterium)等八种细菌属富集,但另外六种细菌属仅在DSS组中富集(图7f)。此外,在DSS治疗的小鼠中,预防性EGCG完全逆转包括乙酸(图7g)、丙酸(图7h)和丁酸(图7i)在内的SCFAs的减少。

对于健康小鼠,EGCG富集的阿克曼菌与血浆T-SOD(R > 0.84,P < 0.01)和CAT(R > 0.70,P < 0.05)水平及结肠TNF-α(R > 0.77,P < 0.01)与MPO(R > 0.64,P < 0.01)水平呈强正相关,但与血浆MDA水平(R < - 0.79,P < 0.01)和结肠T-SOD(R < - 0.71,P < 0.01)与CAT(R < - 0.54,P < 0.01)水平呈负相关(图7j)。接受和未接受预防性EGCG的DSS处理小鼠的相关性分析显示,14个差异菌属与血浆和结肠中抗氧化或促炎介质的浓度或粪便中SCFAs的浓度显著相关(P < 0.05)。尤其是阿克曼菌与血浆T-SOD(R > 0.59,P < 0.05)、CAT(R > 0.52,P < 0.05)水平和结肠TNF-α(R > 0.52,P < 0.01)、MPO(R > 0.59,P < 0.05)水平,以及粪便中乙酸(R > 0.55,P < 0.05),丙酸(R > 0.55,P < 0.05)和丁酸(R > 0.50,P < 0.05)的生成量水平呈正相关。与血浆MDA(R < -0.60,P < 0.05)和结肠T-AOC(R < -0.81,P < 0.01)水平呈负相关(图7k)。

最重要的是,这些结果表明,预防性EGCG能调节肠道菌群组成及其代谢,从而有可能减轻DSS诱导的失调。

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图7. 预防性EGCG调节肠道菌群的组成和功能。a α-多样性由第28天的Sobs指数表示。b 在第28天四组经PERMANOVA评估的PCoA图。粪便细菌门(c)和属(d)的相对丰度存在于99.5%的群落中。在第27天接受或不接受EGCG(f)的DSS处理小鼠中,CON组和EGCG组(e)之间微生物分类群的差异分析使用LEfSe(LDA结合效应大小测量)显示。第27天的粪便乙酸(g)、丙酸(h)和丁酸(i)浓度。数据以平均值表示 ± 标准误(n = 8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。健康小鼠肠道菌群与抗炎或抗氧化参数之间的Spearman相关性(j)和DSS处理小鼠(k)对预防性EGCG的反应。红色表示正相关,而蓝色表示负相关。颜色的强度与Spearman相关性的强度成正比。*P ≤ 0.05,***P ≤ 0.001。

  7 EGCG-FMT比CON-FMT和EGCG-SFF更有助于缓解结肠炎

接下来,我们在第三次动物试验中,通过将来自接受EGCG灌胃小鼠的粪便微生物群移植到DSS处理的小鼠中,验证了EGCG介导的微生物群对小鼠结肠炎的影响(图8a)。与之前一样,和其他三组相比,EGCG-FMT处理的结肠炎小鼠体重和结肠长度增加更多,DAI和组织学损伤减少(图8b-g)。同样,与其他三组相比,EGCG-FMT处理的结肠炎小鼠血浆中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平下降(图8h-k),结肠中IL-6和TNF-α水平下降,MPO水平升高(图8l-n)。值得注意的是,与CON-SFF组小鼠相比,EGCG-SFF组小鼠的急性结肠炎症状减轻程度更为显著,表现为体重减轻、DAI评分和组织学评分减少、结肠长度增加(图8b-g)。此外,与CON-SFF相比,EGCG-SFF可降低血浆IL-1β、IL-6、IL-8(图8h-k)和TNF-α水平,以及结肠IL-6和TNF-α水平(图8h,m)。

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图8. EGCG-FMT对DSS诱导的实验性结肠炎的缓解作用优于CON-FMT和EGCG-SFF。a 本研究中使用的小鼠结肠炎模型图。表明了EGCG-FMT和CON-FMT处理。b 整个研究期间DAI评分的动力学。c 整个研究期间每日体重的变化。d 结肠的宏观图像和(f)每组结肠的长度。E H&E染色结肠切片和(g)结肠组织学评分(n = 6/组)。血浆中四种具有代表性的促炎细胞因子IL-1β(h)、IL-6(i)、IL-8(j)和TNF-α(k)的浓度。结肠中MPO(l)、IL-6(m)和TNF-α(n)的浓度。数据表示为平均值 ± 标准误(n = 8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。

  8 EGCG-FMT比CON-FMT和EGCG-SFF更有助于减轻结肠屏障损伤

与其他三组相比,EGCG-FMT观察到结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT浓度升高,MDA浓度下降(图9a-c)。此外,与其他三组相比,EGCG-FMT显示结肠炎小鼠结肠中T-SOD和GSH-PX浓度增加,MDA浓度下降(图9e-h)。同时,与CON-FMT或EGCG-SFF相比,来自EGCG给药小鼠的微生物群促进了结肠炎小鼠结肠中的细胞凋亡,并保持了更好的粘液分布和紧密连接的完整性(图9i-l)。值得注意的是,与CON-SFF相比,EGCG-SFF组小鼠表现出类似的差异,表现为血浆CAT水平升高,结肠T-SOD和GSH-PX水平升高,血浆和结肠MDA水平下降(图9a-h)。并且,EGCG-SFF还促进结肠上皮细胞凋亡(图9i和j)。

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图9. EGCG-FMT比CON-FMT和EGCG-SFF更能减轻氧化应激和结肠损伤。各组血浆中T-SOD(a)、CAT(b)和MDA(c)的浓度。结肠中T-AOC(d)、T-SOD(e)、CAT(f)、GSH-px(g)和MDA(h)的水平(n = 8/组)。i 结肠切片中的细胞凋亡率(n = 6/组)。结肠切片TUNEL染色的代表性荧光图像。比例尺代表50 μm。k 结肠切片阿利新蓝染色的内粘液层的代表性图像。比例尺代表50 μm。l 透射电镜下结肠上皮微观结构的代表性图像。数据表示为平均值 ± 标准误。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,**P ≤ 0.01,***P ≤ 0.001。

9 EGCG-FMT促进了SCFA产生菌的富集和SCFAs的后续产生

本研究还分析了FMT或SFF时肠道菌群的组成。在患有结肠炎的小鼠中,FMT或SFF对ASV水平的Sobs指数没有显著影响(图10a)。PCoA分析显示了所有四组之间(R2 = 0.169,P = 0.003,图10b),两组FMT之间(R2 = 0.094,P = 0.099),两组SFF之间(R2 = 0.065,P = 0.406)以及CON-FMT和CON-SFF小鼠之间(R2 = 0.148,P = 0.015)的结构变化。尤其是EGCG-FMT和EGCG-SFF小鼠之间的结构明显分离(R2 = 0.226,P = 0.001)。各组之间门和属水平的主要组成相似(图10c和d)。值得注意的是,EGCG-FMT显著富集了阿克曼菌属(图10e)。此外,与其他三组相比,EGCG-FMT显著促进了结肠炎小鼠粪便中SCFAs (乙酸、丙酸和丁酸) 的产生,而与CON-SFF相比,EGCG-SFF对SCFAs的产生没有显著影响(图10f、g和h)。此外,相关分析表明,差异微生物阿克曼菌与血浆T-SOD(R > 0.44,P < 0.05)、CAT(R > 0.39,P <0.05)水平,和结肠T-SOD(R > 0.62,P < 0.01)、CAT(R > 0.35,P < 0.05)和谷胱甘肽过氧化物酶(R > 0.54,P < 0.01)水平,以及粪便中丙酸(R > 0.53,P < 0.01)、丁酸产量(R > 0.35,P < 0.05)呈正相关。还展示了与血浆IL-1β(R < -0.38,P < 0.05)、IL-8(R < -0.58,P < 0.01)、TNF-α(R < -0.47,P < 0.01)和MDA(R < -0.42,P < 0.01)水平,以及结肠MDA(R < -0.46,P < 0.01)、TNF-α(R < -0.60,P < 0.01)水平呈负相关(图10i)。

总的来说,EGCG-FMT比CON-FMT或EGCG-SFF更能显著减轻结肠炎小鼠的结肠炎和结肠屏障损伤。与我们的处理和预补充试验一致,EGCG-FMT也能诱导阿克曼菌的富集和SCFAs的增加,这表明EGCG给药小鼠肠道菌群对结肠炎的影响有所缓解。

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 图10. EGCG-FMT促进了SCFAs产生菌的富集和SCFAs的产生。a 以Sobs指数为代表的口服治疗后的α多样性。b 根据PERMANOVA分析评估的FMT或SFF的PCoA图。粪便细菌门(c)和属(d)的相对丰度占群落的99.5%。e FMT中LEfSe(LDA结合效应大小测量)显示的微生物类群差异分析。FMT后粪便乙酸(f)、丙酸(g)和丁酸(h)的浓度。数据表示为平均值 ± 标准误(n = 8/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性,然后进行Tukey检验。*P ≤ 0.05,***P ≤ 0.001。i DSS处理小鼠的FMT或SFF响应中,肠道菌群与抗炎或抗氧化参数之间的Spearman相关性。红色表示正相关,而蓝色表示负相关。颜色的强度与Spearman相关性的强度成正比。*P ≤ 0.05,***P ≤ 0.001。

讨论

除宿主遗传学外,如饮食偏好和肠道菌群等环境因素也与IBD的发生和发展有关。肠道菌群是环境因素和宿主健康之间的重要桥梁,其中微生物群的代谢产物如SCFAs可能发挥抗炎功能。已经有研究证明每日饮茶可降低IBD的风险,其功能成分的保护作用是否与肠道微生物群相关已引起关注。与我们在正常对照和结肠炎小鼠之间的结果一致,肠道菌群失调是肠道疾病的特征,其中调节肠道菌群的治疗策略,如FMT引起了人们的关注。在本文中,我们发现EGCG调节了肠道菌群组成及其代谢产物,即富集阿克曼菌等SCFAs产生菌,增加了SCFAs的产生,从而促进了肠道的抗炎和抗氧化状态。此外,我们还证明了EGCG诱导的肠道菌群及其代谢物在缓解DSS诱导的实验性结肠炎中起到了关键作用,与CON-FMT和EGCG-SFF相比,EGCG-FMT具有更为显著的缓解作用支持了这一点。

为了探索口服或直肠EGCG如何减轻结肠炎,用2.5% DSS诱导小鼠急性结肠炎,然后口服或直肠EGCG处理小鼠。与先前的研究一致,我们证实口服EGCG的治疗应用可以减轻DSS诱导的结肠炎,如DAI和组织学损伤的降低所示。与先前的研究一致,口服EGCG也减轻了结肠炎症,例如DSS处理小鼠血浆和结肠中炎症细胞因子如IL-6和TNF-α的下降。另外,我们发现直肠递送EGCG不能减轻肠道炎症和病理,这是由于其对直肠粘膜的毒性很小。然而,治疗性口服EGCG通过增加T-SOD和CAT等抗氧化酶的合成,减少结肠和血浆中MDA的生成,显著减轻DSS诱导的氧化应激。与此一致,先前的一项研究表明,治疗性EGCG具有类似的抗氧化作用。此外,口服EGCG减轻了DSS诱导的完整性和屏障功能损伤,这可以通过增加的结肠粘液以及增强的结肠粘膜紧密连接和超微结构来证明,这与先前的研究一致,而直肠EGCG没有。最重要的是,EGCG的不同暴露导致了相反的效果,即口服EGCG可减轻结肠炎,而直肠EGCG甚至可加重结肠炎。考虑到直肠EGCG先前已被证明会影响病毒的直肠感染,我们假设这些相反的结果是由于它们对肠道微生物群及其代谢的不同影响。

同时我们需要注意,口服和直肠EGCG对肠道菌群及其代谢有不同的影响。PCoA分析表明,口服EGCG和直肠EGCG对肠道菌群结构有显著影响,尽管通过这两种给药途径对结肠炎小鼠的sobs指数显示的群落丰富度没有明显影响。正如预期的那样,治疗性口服EGCG显著增加了包括阿克曼菌在内的SCFAs产生菌,并随后促进了SCFAs的产生。此外,相关分析表明,阿克曼菌的相对丰度与SCFAs生成、抗氧化酶呈正相关,但与促炎细胞因子呈负相关。另一方面,直肠EGCG不能富集阿克曼菌。同样,先前的研究表明,EGCG有效减少了饮食增加的肥胖,并促进了嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的定植,但它如何影响微生物群代谢产物尚不清楚。此外,最近的一项研究表明,高脂饮食诱导的促炎细胞因子IL-6、IL-1β的mRNA表达水平能被嗜黏蛋白阿克曼菌显著逆转。然而,与仅用DSS处理组相比,直肠EGCG可进一步降低结肠炎小鼠的乳杆菌属水平和丁酸产量。乳杆菌属作为最常见的益生菌,被认为在乳酸可能发挥作用的情况下发挥广泛的抗炎作用。已证明降低的乳杆菌属水平和丁酸产生会诱导小鼠结肠炎的恶化。这些结果表明,两种EGCG暴露方式对结肠炎小鼠肠道菌群的组成和代谢产物有不同的调节作用。口服EGCG有助于形成稳定的微环境,而直肠EGCG则相反。此外,EGCG干预产生的肠道菌群及其代谢物的改变可能在这些逆转中发挥核心作用。

接下来,我们通过长期服用预防性EGCG来进一步验证这些益生菌作用,也模拟了成人每天喝四到八杯茶。还探索了这种暴露途径减轻实验性结肠炎的机制。与治疗性口服EGCG一样,预防性EGCG有效地减轻了结肠炎的症状。预防性EGCG还降低了DSS处理小鼠血浆和结肠中促炎细胞因子的水平,并提高了抗氧化水平。此外,预防性EGCG还能够增加结肠中GSH-px的水平,这可能更显明显地促进抗氧化状态。然而,预防性EGCG可保护完整性和屏障功能免受DSS引起的损伤。有趣的是,预防性EGCG明显降低了健康小鼠肠道的促炎状态并促进了肠道的抗氧化状态,表明食用EGCG有可能改善肠道屏障的潜力

在健康小鼠和结肠炎小鼠中,预防性EGCG也显著调节了其微生物群组成及代谢产物。预防性EGCG对结肠炎小鼠的群落丰富度没有明显影响。有趣的是,我们发现预防性EGCG显著增加了健康小鼠的群落丰富度,这表明EGCG在未来对动物或人类肠道微环境的潜在有益作用。而且,预防性EGCG显著影响健康小鼠和结肠炎小鼠的微生物群落结构,提醒我们,改变的微生物群可能在缓解结肠炎的发展中发挥重要作用。另外,在健康小鼠和结肠炎小鼠中,预防性EGCG显著影响了微生物群落结构,提醒我们改变的微生物群可能在缓解结肠炎的发展中发挥重要作用。此外,预防性EGCG显著增加了包括阿克曼菌在内的SCFAs产生菌,进而促进了SCFAs的产生,这与治疗性口服EGCG一致。同样,在EGCG预防作用下,小鼠SCFAs产生菌阿克曼菌与SCFAs产生和抗氧化酶呈正相关,与促炎细胞因子呈负相关。预防性EGCG处理的结肠炎小鼠也富集了潜在的益生菌双歧杆菌属和粪杆菌属。以往的研究表明,嗜黏蛋白阿克曼菌能释放两种SCFAs(乙酸和丙酸),嗜黏蛋白阿克曼菌与丁酸产生菌的交叉饲喂促进了丁酸的产生。此外,双歧杆菌属和丁酸生产菌之间也存在类似的交叉喂养。小鼠肠道中的内源性Faecalibaculum rodentium已被证明可促进肠道肿瘤发生,其中SCFAs起着至关重要的作用。这些结果表明,产生SCFAs的细菌和随后产生的SCFAs可能在结肠炎的减轻中起作用。

接下来,我们试图证明EGCG介导的SCFAs产生菌和SCFAs后续产生的作用,并验证受影响的肠道菌群和代谢物是减轻结肠炎的结果还是原因。诱导实验性结肠炎小鼠模型,并对正常对照组或EGCG给药小鼠进行FMT或SFF。有趣的是,EGCG-FMT成功缓解了急性结肠炎。与EGCG本身一致,EGCG-FMT比CON-FMT更能明显缓解结肠炎症状,这表明EGCG介导的肠道菌群在缓解结肠炎方面起着主导作用。此外,EGCG-SFF比CON-SFF表现出更好的缓解症状,表明代谢产物的作用不可忽视。EGCG-FMT可显著减弱DSS诱导的炎症反应和氧化应激,其表现与口服EGCG和预防性EGCG相似。基于这些结果,我们证明了EGCG介导的肠道菌群及其代谢物是缓解作用的原因。结合预防性EGCG对健康小鼠微生物群落的显著影响以及EGCG-FMT的成功缓解作用,我们认为EGCG促进了正常对照组中其他低丰度的微生物,从而改善了结肠炎。

然后,我们探索了EGCG-FMT和EGCG-SFF之间的差异。FMT和SFF对群落丰富度没有显著影响。EGCG-FMT对微生物群落结构有显著影响,而EGCG-SFF则没有,这可能是由于SFF的无菌性。正如预期的那样,EGCG-FMT显著增加了阿克曼菌等SCFAs产生菌,进而促进了SCFAs的产生。阿克曼菌与口服EGCG和预防性EGCG的炎症和氧化指标也显示出相似的相关性。这些结果表明EGCG-FMT的缓解效果与EGCG本身相似。值得注意的是,EGCG-FMT显著促进了SCFAs的产生,而EGCG-SFF则没有,这表明SCFAs的释放依赖于SCFAs产生菌。根据我们的研究结果和之前的研究,在肠道菌群和绿茶多酚之间的相互作用中,SCFAs和SCFAs产生菌阿克曼菌也可能在肠道菌群和绿茶多酚之间的相互作用中发挥有益的作用,以治疗或预防疾病

尽管之前已经证明EGCG直接上调抗氧化功能并影响体外细胞增殖。我们认为这些直接作用在体内并没有发挥主要作用,我们的研究结果表明,直肠EGCG治疗的结肠炎小鼠有加重结肠炎的趋势。作为绿茶中最丰富的茶多酚,EGCG的有益作用可能是通过多种机制介导的。除了功能性SCFAs外,先前的研究表明,EGCG降解产生的一些酚类代谢物可能与EGCG的其他有益活性一起在减少肠道炎症疾病方面发挥关键作用。不可否认,口服EGCG或预防性EGCG处理的小鼠不仅受益于肠道菌群和功能性SCFAs,还受益于其他酚类代谢物。根据我们的研究结果,我们认为EGCG的这些功能性次级代谢物在缓解症状中不起主要作用。这主要是因为EGCG的主要酚类代谢物,如苯基-γ-戊内酯在EGCG被肠道细菌降解后,很容易被人体吸收,并通过尿液排出。此外,当我们为FMT和SFF收集粪便时,EGCG已在供体中代谢和吸收,表明这些代谢物的粪便浓度非常低。然而,产生SCFAs的细菌可以依靠基础碳源和氮源持续产生功能性SCFAs。可能正因为如此,与CON-SFF相比,EGCG-SFF也显示出了抗炎和抗氧化作用,而CON-SFF似乎与EGCG-FMT相似。此外,EGCG-FMT比CON-FMT和SFF更好地缓解急性结肠炎,这表明EGCG调节的肠道菌群在缓解结肠炎方面发挥了重要作用。此外,与EGCG-SFF相比,EGCG-FMT富集了产生SCFAs的细菌,如阿克曼菌,并进一步提高了SCFAs的粪便水平,这表明EGCG-FMT在小鼠结肠炎中发挥了更有益的作用。基于此,我们认为EGCG富集的SCFA产生菌的抗炎和抗氧化作用主要由功能性SCFAs介导。此外,与SFF相比,额外添加的肠道菌群进一步促进了SCFAs的后续生产。

总之,我们的结果表明,EGCG介导的微生物群落,特别是阿克曼菌的富集在缓解结肠炎中发挥了关键作用,这可能是EGCG口服和直肠给药逆转结果的主要驱动力。EGCG给药诱导SCFAs产生菌及其代谢产物数量的增加也可能通过改善结肠上皮完整性和粘膜免疫来维持结肠内的稳态平衡。这些结果如图11所示。综上所述,我们得出结论,EGCG诱导的SCFAs产生菌,特别是阿克曼菌,以及随后产生的保护性SCFAs有助于抗氧化和抗炎状态,并进一步保护结肠免受损伤

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图11. 口服而非直肠递送EGCG缓解DSS诱导的结肠炎的机制的示意图模型肠道菌群、氧化应激、炎症和屏障完整性都受到影响。口服EGCG诱导肠道菌群发生改变,以富集阿克曼菌等益生菌,随后导致丁酸等SCFAs产生增加,引发抗氧化、抗炎和屏障保护反应级联。最终,肠上皮内稳态减弱,结肠炎减弱。

结论

总之,口服而非直肠给药EGCG可减轻DSS诱导的结肠炎,其对肠道菌群组成和代谢产物的不同影响暗示肠道菌群在介导有益作用方面的中心作用。鉴于EGCG给药小鼠的微生物群的缓解作用,EGCG缓解IBD进展的有益作用被认为主要通过SCFAs产生菌介导的,尤其是阿克曼菌和随后产生的功能性SCFAs。肠道微生物群的这些变化随后导致丁酸等保护性SCFAs的产生增加,进而触发显著的抗氧化、抗炎和屏障增强程序,从而减轻肠道炎症和损伤。图11总结了所提出的机制。这些发现为EGCG介导的IBD缓解提供了新的见解,并将促进IBD和其他炎症疾病的治疗和预防策略的发展。

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关键词:
显著,结肠炎,口服,小鼠,直肠

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