中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在肿瘤进展和转移中的作用

2021
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古麻今醉
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中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是由活化的中性粒细胞释放的DNA组蛋白和蛋白质组成的网状结构,其在中性粒细胞介导的固有免疫反应中占据了主导地位。

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中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是由活化的中性粒细胞释放的DNA组蛋白和蛋白质组成的网状结构,其在中性粒细胞介导的固有免疫反应中占据了主导地位。NETs也与自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病等,以及其他的非传染性病理过程,如凝血障碍、血栓形成、糖尿病,动脉粥样硬化、血管炎和癌症的发病机制相关。近年来,已有大量动物模型和肿瘤患者数据表明,NETs参与了肿瘤的进展和转移。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞募集的中性粒细胞(肿瘤相关中性粒细胞)和NETs的形成有密切的联系。这种联系在原发性肿瘤和肿瘤转移灶中均有发现。NETs能捕获循环中的肿瘤细胞并促进肿瘤的转移。NETs能够唤醒休眠的肿瘤细胞,促进肿瘤的复发和转移。Maria Teresa Masucci于2020年在《Frontiers in immunology》上发表综述关注了NETs促肿瘤发生的原理,及其成为肿瘤治疗潜在靶点的可能。 

介绍  

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是由Volker-Brinkmann和Arturo Zychlinsky在2004年发现的炎性细胞死亡方式,它能够诱捕细菌、真菌、原虫和病毒。NETs由活化的中性粒细胞分泌,由DNA纤维、组蛋白和抗菌蛋白组成,可以固定病原体并将其暴露于局部高致死性浓度的效应蛋白。Zychlinsky等人证明了NETs可以杀死细菌,从而定义了一种新的抗菌固有反应。

除了作为机体的防御机制外,NETs在非传染性疾病中也起着关键作用,如系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎,囊性纤维化和银屑病。NETs还参与了其他病理过程,如凝血障碍,血栓形成,糖尿病,动脉粥样硬化,血管炎,伤口愈合和牙周炎等。近年来,许多研究将目光转向NETs在恶性肿瘤中的作用,包括NETs与肿瘤免疫、进展、转移、以及与其相关的血栓形成的关系。NETs有抗肿瘤和促肿瘤的双面作用。NETs的成分,如髓过氧化物酶(MPO)、蛋白酶和组蛋白可以杀死肿瘤细胞,抑制肿瘤生长和转移。NETs的蛋白酶能降解细胞外基质,促进肿瘤细胞扩散和转移。

既往研究显示,NETs能够包裹并黏附肿瘤细胞,进一步促进肿瘤的播散转移。有研究在动物模型以及肿瘤患者外周血和肿瘤组织中找到NETs,其作用仍未完全明确。循环中的NETs可损伤肿瘤患者的器官,其机制类似于自身免疫性疾病,还有研究证明NETs可以唤醒休眠的肿瘤细胞。

这篇综述主要关注NETs的促肿瘤发生的原理,及其作为癌症治疗潜在靶点的可能。 

NETs的形成  

中性粒细胞分泌NETs的过程被称为NETosis,即为中性粒细胞的炎性细胞死亡方式。该过程涉及不同的信号和机制。Grayson和Kaplan提出活性氧(ROS)的产生,中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)向核迁移、抗髓过氧化物酶抗体(MPO)、组蛋白修饰和染色质降解是形成NETs的核心机制。Sørensen和Borregaard提出了体外和体内NETs形成的不同途径,组蛋白瓜氨酸化的肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)和核小体降解是体内NETs形成的核心步骤。

不同于细胞凋亡和坏死,NETs的形成是一种细胞死亡。前者是染色质降解和颗粒物释放到细胞外空间的过程。NETs的形成通常需要中性粒细胞的激活以及NADPH氧化酶产生ROS。有研究阐述了线粒体DNA可形成NETs,由于细胞核DNA的数量是线粒体DNA的100000倍,并且线粒体在中性粒细胞中很少,这种差异是否有作用,有待进一步研究。

除了传染病和非传染病,在肿瘤微环境中也有NETs的形成。恶性肿瘤中NETs形成的诱因包括肿瘤细胞集落刺激因子(G-CSF)和内皮细胞IL-8。肿瘤中G-CSF的过表达可升高血液中中性粒细胞数量,生成ROS并致NETs形成。Gupta等人发现了活化内皮细胞(ECs)和中性粒细胞能通过IL-8部分介导NETs形成。胰腺癌(PaCa)细胞能够直接或者间接诱导NETs形成。 

NETs在肿瘤中的作用  

动物模型以及肿瘤患者的血液以及肿瘤组织中都有NETs的存在。NETs具有促肿瘤和抗肿瘤的双面作用,取决于免疫系统的状态以及肿瘤微环境的相互作用。有研究致力于NETs的形成与肿瘤发生、进展和转移之间的关系,并揭示了NETs通过蛋白酶或激活信号对肿瘤细胞增殖的直接作用。肿瘤细胞可以在体内以及体外诱导NETs的形成,此外,有研究证实了肿瘤微环境中的肿瘤相关中性粒细胞(TANs)与NETs形成有关。

下文将重点关注NETs在肿瘤模型以及肿瘤患者的影响。 

肿瘤模型与NETs  

研究表明肿瘤细胞可以诱导中性粒细胞释放NETs。相较于正常对照组,在慢性粒细胞白血病,乳腺癌和肺癌的小鼠模型循环中的中性粒细胞更易释放NETs。肿瘤对机体系统性影响导致了中性粒细胞形成NETs的活性升高。

有研究者在转基因小鼠肿瘤模型(RIP1-Tag2胰岛素瘤与MMTV-PyMT乳腺癌)中发现高度的血管病变,心脏以及肾脏中性粒细胞浸润,以及类似于肿瘤诱发的系统性损伤。此外,在肾脏中发现的血小板-中性粒细胞复合物,侧面反应了NETs的形成。NETs导致的荷瘤小鼠血管功能受损可以通过DNA酶治疗使肾血管功能达到健康小鼠的水平。NETs和血小板在诱发胰腺癌(C57/Bl6小鼠模型和患者)相关高血糖中扮演着关键的角色,并与静脉血栓和癌症相关血栓有关。

体外研究显示,胰腺癌细胞系(AsPC-1)可以通过剂量依赖性诱导NETs形成。NETs形成主要归因于AsPC-1条件培养基(CM)的蛋白质组分。NETs能增强内源性正常血浆凝血酶电位(ETP),与肿瘤细胞迁移、浸润和血管生成有关。Lewis肺癌(LLC)细胞外RNA(exRNA)也可以诱导NETs形成。

自发性肠道肿瘤的发生与具有促肿瘤N2表型的低密度中性粒细胞的积聚,补体C3a的受体上调和NETs形成有关。

NETs在促肿瘤转移中的作用非常重要。研究显示,NETs可以捕获循环肿瘤细胞(CTCs)并促进肿瘤的转移。在模拟手术后的炎症环境的肿瘤小鼠模型中,发现了NETs黏附CTCs的基础是:NETs黏附肿瘤细胞,β1-整合素表达上调以及β1-整合素对肿瘤细胞和NETs的作用。DNA酶可以降低肿瘤细胞与NETs的粘附作用。在小鼠模型中,NETs形成和捕获循环肺肿瘤细胞导致肝脏微转移灶增多。此外,NETs能够促进手术后肝转移的发生。 

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图1展示了肿瘤细胞、TANs和NETs之间的关系。  

Tohme等人发现NETs可以通过增强自身线粒体功能促进肿瘤细胞生长。皮下移植瘤在WT组小鼠生长快于PAD4-KO组小鼠,PAD4-KO组小鼠与WT组小鼠比较,肝转移较少。WT小鼠腹腔注射DNA酶后得到了类似的结果。与WT小鼠相比,PAD4-KO肿瘤组织的免疫荧光染色后,肿瘤组织显示非常低的中性粒细胞浸润。体外研究观察查到,在乏氧肿瘤细胞环境下,通过高滴度的趋化因子和HMGB1可介导中性粒细胞募集体,诱导肿瘤微环境中NETs形成。总而言之,这些研究强调了中性粒细胞募集和NETs的形成在肿瘤生长和进展过程中的核心地位。

Park等人强调了肿瘤细胞的转移与中性粒细胞募集以及NETs形成的密切关系。他们发现,转移性乳腺癌细胞能够刺激NETs生成。CXCL1介导了原位种植4T1(转移性)和4T07(非转移性)小鼠乳腺癌细胞小鼠肿瘤组织中的中性粒细胞募集。原发性4T1肿瘤相较于4T07肿瘤,中性粒细胞更多。降低4T1细胞中CXCL1水平可以减少肿瘤组织中中性粒细胞的浸润。小鼠肺组织切片NETs的免疫荧光染色标本中,NETs形成发生在尾静脉注射4T1细胞后。此外,G-CSF能够介导转移性肿瘤细胞在扩散部位诱导NETs形成;而抗G-CSF阻断抗体则大大降低了4T1细胞介导的NETs形成。

除了上述机制外,NETs还能“唤醒”休眠的肿瘤细胞并介导肿瘤转移。最近,Albrengues等人证明了NETs在肿瘤复发中作用。在小鼠模型中阐明了休眠肿瘤细胞苏醒并发生转移的机制。由吸烟或脂多糖滴鼻引起的肺部炎症,导致NETs形成,可诱导肺转移,这种现象可以通过体内或体外给予DNA酶降解NET-DNA得到抑制。此外,NETs通过整合素激活与FAK/ERK/MLCK/YAP信号转导结合细胞外基质,导致层粘连蛋白断裂以及新的肽链结合位点重塑唤醒休眠细胞。

多种技术可以用于检测NETs与肿瘤细胞间的粘附作用。Monti等人阐述了各种肿瘤细胞系(HT1080、U 87 MG、H1975、DU 145、PC-3和A-431)在体外通过细胞表面α5β1, αvβ3,和αvβ整合素的表达,粘附于中性粒细胞样细胞形成NETs。循环中高水平RGD肽可以抑制肿瘤细胞与NETs的粘附,抑制率与DNA酶治疗的结果相似。这种方法可以用于对表达RGD整合素的肿瘤细胞对于NETs的粘附能力筛选。 

癌症患者与NETs  

NETs在人类肿瘤中也与肿瘤进展和转移相关肿瘤患者(包括肺,胰腺,膀胱癌)血浆中NETs的水平高于健康对照组。在肺癌患者中,Li等人发现NETs存在于在肺组织、外周血和痰液。此外,在结直肠癌患者中,中性粒细胞体外刺激后产生的NETs量显著高于健康对照组,且与不良临床预后相关。

Park等人通过免疫荧光染色发现了乳腺肿瘤组织中的NETs。在三阴性乳腺癌肺转移灶中NETs阳性率最高。Tohme等人发现,与正常肝脏相比,TANs和NETs在结直肠癌肝转移患者根治性切除术后肿瘤组织样本中阳性率更高。同样,肿瘤组织表达高水平的瓜氨酸组蛋白,提示了NETs的形成。与健康对照组相比,肿瘤患者术前MPO-DNA水平(一项可靠的系统性NETs形成程度标志物)更高。并与更差的DFS和OS相关。因此,血清MPO-DNA水平可以作为预测这些患者预后的生物标志物。

在患者肿瘤组织中,TANs与NETs形成的关系及其在肿瘤免疫编辑中的作用一直受到关注,尤以小儿尤文肉瘤为甚。Berger Achituv等人在小儿尤文肉瘤的活检标本中发现了TANs。其中两个NETs由TANs活化而来的。这两个病人大剂量化疗后出现转移和早期复发,提示了NETs在尤文肉瘤进展中的作用。

研究也强调了癌症患者中NETs与凝血功能的关系。研究表明,NETs可以诱发肿瘤相关的血栓形成,与肿瘤患者不良预后相关。目前,可以通过NETs标记物(DNA组蛋白复合物,双链DNA,中性粒细胞弹性蛋白酶)评估肝细胞肝癌患者循环NETs水平。同样,可以通过激活系统标记物进行检测。肝细胞肝癌患者循环中NETs和接触系统激活标记物显著高于健康对照组。Jung等人测量了胆管恶性肿瘤患者循环NETs水平和高凝标记物,发现NETs和高凝标记物密切相关。与健康对照组相比,晚期肿瘤患者血浆瓜氨酸组蛋白H3(H3Cit)水平更高,肿瘤患者中性粒细胞H3Cit水平更高。肿瘤患者血浆H3Cit水平与NETosis激活剂:NE、MPO、IL-6和IL-8相关。 

NETs与肿瘤治疗 

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NETs被认为是肿瘤治疗中很有前途的潜在新兴靶点(图2)。

NETs能够诱导肿瘤细胞的转移,可以通过抑制肿瘤组织中NETs的形成和/或激活来治疗肿瘤。但目前的临床试验尚未发现以NETs作为治疗靶点的最佳方式。作为一种可能的肿瘤治疗方法,Gonzalez-Aparicio等人建议通过结合免疫治疗和药物以干扰中性粒细胞趋化和NETs的形成。目前缺乏一个良好的针对NETs治疗反应的生物标记物。可用于预测NETs形成的标记物是H3Cit和MPO-DNA,对预测肿瘤患者预后有一定价值。有研究提示检测肿瘤活检组织中NETs和G-CSF作为患者靶向治疗效果标准,但这些研究没有得到明确的结论。根据Jorch和Kubes的综述,大多数实验和临床研究都致力于NETs在癌症以外的疾病中的作用,如自身免疫性疾病、肺部疾病和自身免疫性疾病相关并发症。

研究证明,系统性红斑狼疮(SLE)中,血清核酸内切酶是降解NETs染色质的必需酶。在某些系统性红斑狼疮患者中,DNase功能异常会导致严重的肾功能损伤,证明了维持NETs形成和降解平衡的重要性。介于DNA酶可以降解NETs结构,NETs可以作为DNA酶治疗的靶点。根据以上结论,DNA酶已在肿瘤模型中进行了试验。如DNA酶治疗可降低乳腺癌小鼠模型的肿瘤负荷。此外,在模拟肿瘤炎症环境的术后腹腔内脓毒症小鼠模型中,DNA酶可以降低体内NETs捕获和黏附循环肿瘤细胞的作用。研究显示,通过全身给药,DNA酶可减少转移性肺癌小鼠模型的转移灶。使用纳米颗粒包裹DNA酶可以稳定DNA酶链,使循环中的DNA酶更稳定高效。DNA酶纳米颗粒可在体外降解NETs并阻断乳腺癌肺转移灶的生成,但它们不能抑制原发性肿瘤的生长。这些动物模型研究结果,由于没有临床毒性,鼓励了DNA酶在人类癌症治疗中的应用。FDA批准了DNA酶用于治疗囊性纤维化患者,这些患者肺部合成过多的NETs导致支气管中粘液增多。用于非肿瘤患者干扰NETs形成的分子抑制剂也可用于肿瘤患者。用于慢性阻塞性肺部疾病的NE抑制剂和PDA4抑制剂可改善肿瘤患者的临床预后。目前临床使用的PAD4抑制剂Cl-氨基血浆半衰期较短的。 Domingo-Gonzalez等人证明PGE2通过EP2或EP4路径对移植造血干细胞的小鼠和患者的NETs形成产生负性调节作用。该研究揭示了另一种抑制NETs形成的方法。另一项研究发现,PGE1能通过诱导细胞内cAMP和减少细胞内钙离子抑制肿瘤细胞和PMA诱导的NETs形成。抗凝血酶可显著减少由癌细胞诱导的NETs的形成。此外,NET抑制剂氯喹可降低负瘤小鼠的血小板聚集,循环组织因子含量,以及缓解高凝状态。该方法在病人身上也同样有效。Hector Salazar-Gonzalez等人在其综述中讨论了NETs在肾脏疾病中的作用,强调了阻断NETs的形成可以干扰包括炎症性、非炎症性以及肿瘤的发病机制。NETs作为肿瘤治疗的潜在靶点已不再是假说,NETs可作为直接治疗靶点用于膀胱癌治疗中。在免疫治疗早期阶段由卡介苗(BCG)诱导的NETs有免疫调节作用,可以通过募集T细胞和单核巨噬细胞预防肿瘤增长。此外,BCG诱导的NETs可诱导细胞凋亡和暂停细胞周期,从而抑制肿瘤细胞迁移。

“论肿道麻”述评

        肿瘤微环境内肿瘤细胞、TANs和NET之间的密切关系突出了NETs在肿瘤进展和转移中的作用。NETs能够唤醒休眠的肿瘤细胞,促进肿瘤的复发和转移。此外,他们还可以诱捕循环中的肿瘤细胞,促进肿瘤的扩散转移。   另一个需要考虑的因素是NETs与免疫系统的复杂交互作用。尽管对这一主题的详细讨论超出了本综述的范围,但值得注意的是,尽管最初被视为一种高度保守的病原体防御机制,但NETs也在先天免疫系统和适应性免疫系统之间有着重要联系。宿主来源的游离DNA表明细胞内稳态的破坏,因此对生物体构成一个强有力的“危险”信号。它可以通过单核细胞和树突状细胞等表达的Toll样受体9激活免疫系统。有趣的是,与LL-37(一种被困在NETs中的抗菌肽)复合的DNA比“裸”DNA更稳定,更有效地激活树突状细胞,触发它们产生促炎性干扰素。因此,NETs可以刺激浆细胞样树突状细胞和巨噬细胞释放细胞因子,导致T细胞活化和免疫细胞募集的扩增。此外,NETs可以共同刺激T细胞,使它们对特定刺激产生反应。因此,我们可以想象NETs在肿瘤免疫中发挥的作用。   目前,仍需进一步研究NETs作为肿瘤治疗靶点的可能性,以及药理学上干扰NETs形成以及降解NETs。虽然相关研究在肿瘤模型中获得了满意的结果,但针对肿瘤患者的研究并不尽如人意。有必要将进一步的研究重点放在平衡NETs调节与形成,将NETs作为治疗靶点的同时不影响免疫功能。   

编译:陈婉南;述评:翁梅琳   审校:张军,缪长虹    

参考文献:   Masucci MT, Minopoli M, Del Vecchio S, Carriero MV. The Emerging Role of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) in Tumor Progression and Metastasis.    Front Immunol   . 2020;11:1749.     

  

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关键词:
粒细胞,肿瘤,中性,可以,形成

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