综述 | 同济大学医学院&附属上海市肺科医院：微生物在肺癌开始、治疗和结果中的作用:是福还是祸？（国人佳作，下）

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

提出了免疫系统和癌症之间的动态相互作用，称为肿瘤免疫编辑，包括三个阶段：消除、平衡和逃逸。在这一过程中，微生物群可通过以下三种途径促进免疫平衡以消除：（1）由于对细菌和肿瘤抗原的交叉反应而增强抗原性 (2）辅助性MAMPs/PAMPs；（3）由细菌刺激引起的促炎症细胞因子。因此，本节将简要介绍最近关于微生物刺激抗肿瘤免疫的研究。

最近的一项研究表明，肿瘤内的琼氏不动杆菌属和病毒性丙酸杆菌可能分别吸收CD8⁺T细胞和活化的NK细胞。Alex Stevenson等人发现，MRx0518（一种肠道微生物群衍生菌株）对小鼠肺肿瘤生长的抑制作用达到了35–51%的大小。这种肿瘤大小的缩小也增加了CD8⁺T/Tregs比率和减少Ki67+细胞的数量。Min Cheng和他的团队证明，共生细菌对小鼠肺部的γδT17细胞反应至关重要，这是Lewis肺癌模型中平均生存时间缩短的潜在机制。

Francisco J. P´erez-Cano及其团队发现，从母乳中分离的唾液乳杆菌CECT5713和发酵乳杆菌CECT5716具有调节先天性和获得性免疫细胞的潜力，其中NK细胞受到的影响最为显著。当体外暴露于这两种细菌时，NK细胞上的CD69表达水平显著升高（~90%，P<0.05）。另一株戊糖乳杆菌也被证明分别刺激NK1.1⁺细胞和CD11c⁺DC分泌IFN-γ和IL-2。这种I型免疫在抗肿瘤免疫中是必不可少的。当与A549细胞共同培养时，人肠道细菌分泌的胞外囊泡（EV）显著刺激抗炎细胞因子（IL-10、转化生长因子-β2（TGF-β2）和IL-1Ra）的分泌，并抑制促炎细胞因子（IL-6、TNF-α和TNF-β）。

化疗是非切除肺癌的首选治疗方法，但采用了历史上“一刀切”的方法，可以通过开发生物标记物来识别潜在患者和合适的药物组合。肠球菌科、乳酸杆菌科和链球菌科在使用培美曲塞治疗的肺癌患者来源的异种移植物（PDX）模型的粪便样本中的含量较高。中国的一个研究团队已经研究了肠道微生物群作为肺癌化疗疗效预测生物标志物的潜力。变形链球菌和Enterococcus casseliflavus对化疗有良好的反应，而在无反应的患者中，乳明串珠菌和惰性真杆菌Eubacterium siraeum的检出率更高。Romain Daillere和他的团队发现，在刺激海氏肠球菌和肠道巴恩斯氏菌铂类化疗后是晚期肺癌无法进展生存（PFS）的保护性里程碑。

肺癌对化疗的反应率在20%到40%之间，化疗常常引起严重的毒性事件，并与不良预后有关。然而，益生菌的定期化疗有助于解决这个问题。枯草芽孢杆菌菌株在肺癌患者中的应用可降低死亡率。化疗引起的不良事件（AEs）的发生，包括肠道消化不良和肠道菌群恶化（比如乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌数量较少，不同病原微生物数量增加）。同样，Yang Tian也报道了酪酸梭菌的组合（梭菌和乳酸杆菌）与安慰剂合用可减少肺癌患者化疗引起的腹泻，并通过降低NLR和血小板-淋巴细胞比率（PLR）缓解全身炎症反应。

Q-F Gui等人报告了与单用顺铂相比，采用顺铂和乳酸杆菌联合使用使得LLC小鼠模型中观察到更好的肿瘤缩小（P<0.01）和血清IFN-γ水平更高（44%）。

吡哆醇是维生素B6的前体，已被证实有可能通过加剧细胞内谷胱甘肽的耗竭和顺铂介导的DNA损伤来增强顺铂在非小细胞肺癌中的细胞杀伤功能。Fabian M. Commichau和他的团队建立了一种工程枯草芽孢杆菌，用于从4-羟基-L-苏氨酸（4− HO-Thr）和去氧基果糖（DX）中生产吡哆醇，有望与化疗联合应用。

嗜黏蛋白阿克曼菌是健康肠道粘液层中最突出的的细菌（1-4%）。最近的一项研究提出了在LLC小鼠模型中，嗜黏蛋白阿克曼菌与顺铂的结合显示出肿瘤体积进一步缩小、配体蛋白的表达更加减少。平均而言，抗肿瘤细胞因子，包括IFN-γ、IL-6和TNF-α，与单用顺铂相比也有所增加。如上所述，仅使用β-葡聚糖就显示出强大的免疫动员能力。

ATBs诱导的免疫抑制可能会削弱化疗的抗肿瘤效果（图2）。在肺癌小鼠（KrasLSLG12D/WT；p53Flox/Flox），万古霉素显著降低环磷酰胺 (CTX) 对肿瘤大小的抑制作用，同时也减少了CD3⁺T细胞和Th1细胞的渗入。另一项研究也揭示了ATBs对化疗敏感性的间接影响。Rachel Fellows最初发现，小鼠肠道微生物群的减少提高了结肠中组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）的水平，这是一种I类组蛋白去乙酰化酶。此外，HDAC2的过度表达通过丙戊酸（VPA）途径损害了顺铂对NSCLC细胞的敏感性。

免疫检查点抑制剂（ICIs）是免疫治疗的代表，它阻断了免疫逃逸的免疫检查点途径。到目前为止，如何通过强大的生物标记物最大限度地实现个性化治疗，以及如何通过免疫治疗联合方案优化癌症患者的生存率仍然是癌症免疫治疗的十大挑战。鉴于宿主微生物群的免疫刺激潜力，微生物群可能是突破上述困境的一个好切入点。

只有15%-25%的肺癌患者受益于ICIs，而缺乏可靠的疗效生物标志物是免疫治疗中最棘手的问题。嗜黏蛋白阿克曼菌（P=0.045）、瘤胃球菌属、阿利斯蒂普斯属和真杆菌属、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和副杆菌属在NSCLC患者中富集。在这些微生物中，粪便中的嗜黏蛋白阿克曼菌与对程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）抑制剂（P=0.004）和较长的PFS（P=0.028）的较好反应显著相关。

就中国人群而言，在非小细胞肺癌中对PD-1抑制剂反应良好的的主要肠道微生物种类为腐烂别样杆菌、长双歧杆菌和普氏菌，而未分类的瘤胃球菌在无反应患者中富集。对于日本人群，据报道，更多的乳酸杆菌和梭状芽孢杆菌作为治疗失败时间更长的生物标志物（TTF）接受ICIs治疗的患者。同时，肠道微生物组多样性高的患者与周围较高水平的记忆性CD8⁺T细胞和NK细胞相关，这也是更好的治疗反应的原因。Andrea Botticelli等人专注于肠道微生物群的代谢组学分析，并验证其与ICIs益处的关联。在本研究中，2-戊酮（酮）和十三烷（烷烃）是接受纳武单抗治疗的肺癌患者预后的负面标志物，而短链脂肪酸，赖氨酸和烟酸是预后的积极预测因子。

肠道微生物群的种类也可能在抗PD-1抗体诱导的腹泻中发挥重要作用。Tian Liu等人发现，在无腹泻（D-F）肺癌患者中，类杆菌、类副杆菌和考拉杆菌更为丰富，而在腹泻患者中，韦荣氏球菌属更为丰富。

益生菌与ICIs的结合已被证明是一种更有效的治疗方法，不良事件更少。根据Aurelie Fluckiger的研究，检测到一种拟噬菌体的尾部长度带测量蛋白(TMP)与MHC-I的结合能力，MHC-I负责肿瘤相关抗原（TAAs）的呈递。粪便样本中的肠球菌原噬菌体和肿瘤对TMP交叉反应抗原的表达可能是肺癌患者PD-1抑制剂的阳性预测因子。此外，使用TMP的工程菌株被证明可以提高小鼠的疗效，这是佐剂常规免疫治疗的良好方法。

此外，通过全身成像，口服嗜黏蛋白阿克曼菌和海氏肠球菌13,144减少PD-1抑制剂的LLC尺寸。

虽然益生菌可以提高ICIs的疗效，但是致病性感染可能干扰ICIs的疗效。近年来，传染病尤其是肺结核的发病率较高，引起了广泛关注。一份病例报告还说明了由于抗PD-1试剂的免疫反应上调，抗结核分枝杆菌试剂出现了矛盾反应。此外，一系列临床研究表明，由于肠道微生物群多样性和组成的改变，ATB（如β-内酰胺或喹诺酮类药物）会缩短接受ICIs治疗的肺癌患者的生存期（PFS和总生存期（OS））。日本的另一项研究表明，在ICIs之前，ATBs的历史就已经存在，其也会缩短NSCLC患者的PFS（P=0.04）和OS（P=0.037）。因此，提出了抗生素免疫治疗暴露率（AIER）的新概念，其定义为整个IO期内ATB和免疫治疗（IO）天数的比率（WIOP），与转移性NSCLC患者的PFS（P<0.0001）和OS（P=0.0004）呈负相关。

5.3.4 益生菌与癌症疫苗的结合

治疗性癌症疫苗是一种主要针对TAA的新疗法，但大多数癌症疫苗都令人沮丧。在此，研究人员正在调查是否益生菌与癌症疫苗相结合可以提高疗效。据Y Yang报道，肿瘤内注射从疟原虫分离的外显体，通过过度表达miRNA 16/322/497/17和降低血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）水平，显著降低LLC生长和血管生成。另一项研究还发现，受疟原虫感染的LLC细胞的增殖和侵袭能力显著下降到可忽略的程度。就动物水平而言，与未感染疟原虫的小鼠相比，感染疟原虫的小鼠表现出更长的无转移生存（MFS）时间和总生存期，这表明疟原虫具有阻断血源性转移的潜力。此外，通过抑制LLC组织上Ki67（增殖生物标记物）和CD31（血管内皮细胞生物标记物）的表达、MDSCs和Tregs的失活，淋巴结中CD11c⁺DC的比例较高，进一步验证了疟原虫上述抗肿瘤作用的机制，CD4⁺/CD8⁺肿瘤渗入性T细胞和颗粒酶B产生的NK细胞数量增加。因此，疟原虫有望与各种免疫疗法结合作为佐剂疫苗，如DNA疫苗（pcDNAhMUC1和pcDNA3.1）。

令人鼓舞的是，一个研究小组构建了一种重组减毒疟原虫子孢子（GAS），命名为GAS/MAGE-A3，表达肺癌特异性抗原，黑色素瘤相关抗原3（MAGE-A3）。最初，在免疫的人类白细胞抗原（HLA）-A2转基因小鼠中观察到CD8α^lowCD11a^high 和CD49d^highCD11a^high CD4⁺T细胞反应和MAGE-A3特异性CD8⁺T细胞反应。此外，将GAS/MAGE-A3诱导的CD8⁺T细胞过继转移到裸鼠体内，可显著抑制肿瘤生长并延长存活时间（P≤ 0.01)。

Zhao-Jun Li 等利用重组pTRKH2 PsT/sKDR质粒建立了婴儿双歧杆菌，该质粒具有可溶性激酶插入域受体（sKDR）基因和蛋白质表达，可显著阻碍人脐血管内皮细胞（HUVECs）的扩张、肿瘤内血流和肿瘤生长抑制，但延长了LLC小鼠模型的存活时间（均P<0.05）。类似地，可溶性fms样酪氨酸激酶受体（sFlt-1）是VEGFR-1的膜外部分。H Zhu等人构建了婴儿双歧杆菌介导的sFlt-1基因转移系统，该系统可以表达sFlt-1基因和蛋白质，并通过抑制VEGF途径来阻止LLC生长，从而提高存活率。

总的来说，微生物试剂或微生物药物可以作为化疗或免疫治疗的有益添加剂，近年来甚至成为肺癌治疗的重要主流领域。

90-95%的癌症源于致癌物质和不健康的生活方式，这意味着癌症是可以预防的。然而，与治疗不同，癌症预防的好处是看不见的。考虑到微生物在消化和代谢中的独特功能，微生物在阻断致癌物、优化饮食和减少炎症方面是积极的。

根据台湾的研究，土壤中的低剂量重金属，包括铬（Cr）、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）、锌（Zn）和镍（Ni），与肺癌发病率相关（LUAC和LUSC）。肠道微生物，如乳酸杆菌和大肠杆菌。大肠杆菌被认为是从毒性Cr（VI）转化为毒性较小的Cr（III）过程中的一个重要因素。此外，甚至死亡的芽孢杆菌物种也可以在土壤乳酸菌完成这一转变，这也证明当与As（III）或As（V）一起培养时，乳酸杆菌表现出金属还原能力，这可能归因于嗜酸乳杆菌菌株和卷曲乳杆菌DSM20584产生的S层蛋白。因此，微生物有望去除环境和体内的重金属，降低肺癌的发病风险。

西化饮食（NWD）以脂肪过多、纤维或维生素D不足为特征，已被证明会导致肠道微生物变化和免疫调节改变（IL-17水平升高），甚至增加癌症风险。Theofilos Poutahidis等人发现，祖父母在怀孕期间喂食NWD的小鼠出现肺癌的年龄比前几代小鼠小（P<0.0001）。

此外，当给3周大的小鼠喂食含有罗伊氏乳杆菌ATCC-PTA-6475，1岁时患肺癌的风险显著低于饮用普通水者（5%比70%，P<0.0001）。因此，在怀孕期间定期饮食中补充益生菌被认为可以降低跨代肺癌的风险，而在早期开始含益生菌的饮食可能有助于预防未来的肺癌。

慢性炎症引起的微生物群失调在上皮细胞增殖和肿瘤发生中起着重要作用。在这种情况下，MAMP中的受体，特别是活化B细胞的TLR/核因子-κB轻链增强子（NF-κB）信号通路，已被报道为肺癌预防的明星靶点。MDSCs促进肿瘤增殖的机制是通过NF-κB途径产生IL-6和TNF-α（图3A和B）。更具体地说，肺癌组织中TLR4的含量较高与更晚期的疾病状态和不良预后显著相关，包括临床肿瘤淋巴结转移（TNM）分期增加（P<0.001）、淋巴侵袭（P<0.001）、PD-L1的高表达（r=0.545，P<0.0001）以及OS和DFS下降。

炎症减轻肺癌模型，通过TLR2/4途径引起诱发肺部炎症，并通过IL-17C进一步引入肿瘤相关中性粒细胞和肿瘤生长。此外，在暴露于NTHi后，产生IL-17的CD4⁺Th17细胞向小鼠肺组织募集Gr-1⁺CD11b⁺髓样细胞。考虑到NTHi是慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者常见的微生物感染，IL-17C和Th-17细胞诱导的炎症可能是预防COPD患者进展为肺癌的潜在靶点。同时，卡那单抗抗炎性血栓形成结果研究（CANTOS）的结果显示，抗（IL-1β）试剂卡那单抗可降低干预组中肺癌的发病率。

总之，上述发现有助于减少这种情况的发生，从而从根本上减轻肺癌给人类带来的物质和生理负担。

图3. NF-κB的促肿瘤活性。（A） NF-κB的激活可通过产生抗凋亡因子、细胞周期调节因子、炎性细胞因子和趋化因子以及粘附分子促进癌症的发展。这些改变有助于癌细胞的存活和增殖，以及血管生成和转移。此外，NK-κB途径可促进DC成熟，引入中性粒细胞和巨噬细胞，并促进T细胞分化。（B） NF-κB活化的信号转导途径。TNF、IL-1或LPS与TLR结合，导致负责IkB蛋白磷酸化的IKK复合物激活。这个过程之后是蛋白酶体介导的IkBs降解，通过泛素系统（Ub）。BCL，B细胞淋巴瘤；BCL2-L1，B细胞淋巴瘤2样1；cFLIP，细胞膜样抑制蛋白；CXCL，趋化因子（C-X-C基序）配体；DC，树突状细胞；ECAM，内皮细胞粘附分子；IAPs，凋亡抑制蛋白；ICAM，细胞间粘附分子；IKK，IκB激酶；IL，白细胞介素；LPS，脂多糖；MCP，单核细胞趋化蛋白；MMP，基质金属蛋白酶；NF-κB，活化B细胞的核因子κB；PAI，纤溶酶原激活物抑制剂；RANTES，在激活时受调节，正常T细胞表达并可能分泌；TLRs，Toll样受体；TNF，肿瘤坏死因子；TNF，血管细胞粘附分子。

越来越多的临床试验（表2）正在进行中，以通过微生物改善现有癌症治疗的缺陷或开发新的微生物应用方法。

表2. 正在进行的关于微生物群或微生物群与肺癌之间关系的临床试验。

  AEs，不良事件；BAL，支气管肺泡灌洗；BC，乳腺癌；black raspberry，黑树莓；cfDNA，循环游离DNA；CT，计算机断层扫描；CRC，结直肠癌；ECG，心电图；FACS，荧光激活细胞分选；FFPE，福尔马林固定石蜡包埋；FMT，粪便微生物群移植；HNC，头颈癌；ICIs，免疫检查点抑制剂；IL-1α，白细胞介素1α；IL-6，白细胞介素-6；IL-10，白细胞介素-10、；irAEs，免疫相关不良事件；LC，肺癌；LUAD，肺腺癌；MEL，黑色素瘤；MPM，恶性胸膜间皮瘤；NSCLC，非小细胞肺癌；OC，口腔癌；OR，优势比；ORR，总体反应率；OS，总体生存率；PBMC，外周血单个核细胞；pCR，病理完全缓解率；PFS，无进展性疾病；RC，肾癌；RCC，肾细胞癌；RT PCR，逆转录聚合酶链反应；SABR，立体定向消融放射治疗；SAEs，严重不良事件；SCLC，小细胞肺癌；scRNA，单细胞RNA；TGF-β1，转化生长因子β1；TME，肿瘤微环境；TMB，肿瘤突变负荷；UC，子宫癌。

有新的报告称，NSCLC患者出现了严重的肺部感染，包括机会性感染、结核分枝杆菌和烟曲霉，随后又服用了纳武单抗。因此，在接受ICIs的患者中，筛查机会性感染和结核病具有重要价值。另一项英国研究得出结论，在过去五年中，患有呼吸道感染且既往无肺炎球菌感染的住院肺癌患者的死亡率是非呼吸道感染患者的33倍。总之，针对高危癌症患者的高特异性ATB与针对各种传染病（如肺炎链球菌和流感）的充足疫苗相结合，是减少阻碍肺癌治疗预后的病原体和相关治疗的关键步骤。

以前的研究调查了细菌与肺肿瘤发生之间的关系，而真菌是一种被忽视的致癌相关微生物。例如，小鼠口服黄曲霉毒素G1（AFG1）会上调NF-κB、磷酸化信号转导子和转录激活子3（p-STAT3）和环氧合酶2（COX-2），并进一步引发肺癌的发生。因此，STARS（NCT04260295）是一项横断面研究，旨在揭示真菌与肺癌发生之间的相关性，证明致癌真菌毒素的临床验证。

与肺部和肠道微生物群相比，口腔细菌是另一种被忽视的致癌微生物。同时，NCT01862809正在进行检测口腔微生物群的最佳口腔收集点，并调查吸烟者和非吸烟者之间的口腔微生物群及其与肺癌发生的关系。

到目前为止，大多数研究涉及的微生物群来自同样的器官（口腔、气道、肺或肠道），这为在建立肺癌的全身微生物谱方面带来了限制。然而，正在进行的临床试验可能会突破瓶颈。

在此，多项试验涉及多系统微生物样本，例如NCT04063501（BALF和粪便样本）、NCT03998189（唾液收集和切除的肺癌组织）、NCT03454685（血液、粪便、痰和肿瘤组织）和NCT03688347（口腔拭子、皮肤拭子、鼻拭子和粪便样本）。同时，越来越多的研究团队建立了肺癌微生物组研究的数据库或样本库，这将为后续的深入研究提供更全面的信息。NCT00340405是通过检测痰微生物组来构建中国早期肺癌的大规模人群生物样本库（估计注册人数=9759），NCT00280202是为了建立肺癌发生和发展的遗传标记库（包括肺癌组织和BALF中的微生物组群）（估计注册人数=6000），而NCT03387865（估计注册人数=500）将建立一个包含组织样本、血液样本和肠道微生物组的数据库，详细记录对癌症治疗和疾病进展的反应。

目前的研究结果很少涉及放射治疗的微生物生物标志物。NCT04271384是一项2期试验，包括将肠道微生物组作为立体定向消融放疗（SABR）联合纳武单抗治疗I期NSCLC疗效的检测预测因子。此外，NCT04040244是一项初步研究，旨在探索III期非小细胞肺癌患者呼气收集对放化疗诱发症状性肺炎的预测性微生物组。

令人鼓舞的是，一项大规模人群队列试验正在进行中，以进一步探索接受ICIs（NCT04107168；估计的患者数量=1800）。越来越多的研究者关注肠道或气道微生物组是否与ICIs（NCT04300244、NCT04312308、NCT03664024、NCT04013542、NCT03083691、NCT03168464、NCT04392505）和AEs（NCT04636775、NCT04435964、NCT04291755）的反应有关，这符合现实问题，即肺癌患者对ICIs的应答率低，但不良事件发生率高。更重要的是，深入学习计算程序在临床决策或结果预测方面是一种令人鼓舞的表现，这为微生物疗法的药物开发和患者选择提供了方向。BioForte是一项基于深入学习而非实验室程序的技术，用于检测对免疫治疗有反应的重要肠道微生物群。

尽管最近在动物体内抗肿瘤益生菌和微生物介导药物以及体外细胞实验方面取得了进展，但缺乏支持肺癌患者利益和安全性的临床数据。正在招募一项IB期试验（NCT04521075），以验证粪便微生物移植（FMT）联合纳武单抗治疗IV期非小细胞肺癌的临床可行性。NCT03934827是另一项1期试验，旨在探索MRx0518在等待手术切除的实体癌患者中的应用，并将MRx0518与安慰剂作为术前辅助治疗进行比较。同样，NCT03637803（1/2期）将在对PD-1/PD-L1抑制剂耐药的晚期肺癌患者中联合使用MRx0518和派姆单抗。尽管这些试验尚处于早期阶段，但这些结果可能会开启肺癌微生物治疗的新时代。

如上所述，关于微生物组与肺癌风险之间关系的大多数证据都基于流行病学研究，而不是强有力的机制研究。例如，无论是在动物模型还是人类样本中，都缺乏对肺癌形成过程中微生物组的时间依赖性检测。同时，没有明确的模型或方法直接排除健康人和肺癌患者之间的免疫学或生理学差异，从而直接将肺癌归因于微生物调节。总之，上述突破和更大规模的临床试验将有助于形成一个更安全、更稳定的肺癌微生物治疗系统。然而，关于该微生物组对肺癌影响的深入机制研究仍需进一步发展。

总之，微生物在肺癌的发生、治疗和预后中发挥着不可或缺的作用。微生物与肺癌之间的相互作用是一把双刃剑。某些病原体和宿主微生物群的紊乱与肺癌风险的增加有关，感染性疾病的ATB不利于抗癌治疗。然而，肺癌患者独特的微生物组成和丰富性有助于早期诊断，这些微生物组群随肺癌发展的动态变化尚需进一步验证。益生菌和微生物介导的药物可作为辅助治疗，以提高疗效和降低常规肺癌治疗的毒性。此外，某些微生物在致癌物代谢和消化过程中的独特作用可能有助于肺癌的预防。由于微生物在肺癌的发生和预后中具有复杂的双重作用，如何取其精华，去其糟粕，是进一步研究逆转肺癌难治性的关键。