多囊卵巢综合征中的菌群失调会影响代谢和内分泌

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近期，锐翌基因协助上海交通大学医学院附属仁济医院在Microbiome发表题为“Androgen-induced gut dysbiosis disrupts glucolipid metabolism and endocrinal functions in polycystic ovary syndrome”的研究论文，其中16S rRNA基因测序和数据分析由锐翌基因完成。

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导读

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见的生殖内分泌疾病，具有发病率高、病因复杂、疗效差等特点。PCOS患者常发生肠道菌群失调，但肠道菌群在PCOS病理生理中对代谢和内分泌平衡的调节作用尚不清楚。研究者通过疾病模型构建、菌群移植、大鼠粪便16S rRNA基因测序、粪便非靶代谢组检测、肝组织RNA-seq等方法发现雄激素诱导的肠道菌群失调可能会加重多囊卵巢综合征患者的代谢和内分泌功能障碍，有助于理解PCOS新的致病因素和开发潜在的综合性治疗方案。

文献ID

中文标题：多囊卵巢综合征中雄激素诱导的肠道菌群失调会影响糖脂代谢和内分泌功能

原标题：Androgen-induced gut dysbiosis disrupts glucolipid metabolism and endocrinal functions in polycystic ovary syndrome

期刊名：Microbiome      IF：14.650

年份：2021   

通讯作者：陈子江，杜艳芝

通讯单位：上海交通大学医学院附属仁济医院

材料与方法

菌群研究：大鼠粪便16S rRNA基因V3V4区测序；Illumina Miseq PE250

实验设计：

- 研究结果 -

01 

脱氢表雄酮（DHEA）诱导的SD大鼠代谢、卵巢和内分泌紊乱

DHEA组SD大鼠皮下注射DHEA（6 mg/100g体重），连续注射35天，建立PCOS模型，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。在处理的第5周，DHEA处理组和PBS处理组的体重（图1a）和空腹血糖（图1b）相似。与PBS处理组相比，DHEA处理组的大鼠表现出更高的葡萄糖耐量（图1c,d），并扰乱了发情周期（图1e）。PBS组卵巢含有不同发育阶段的卵泡和多个黄体（CL），而DHEA组显示多个囊状卵泡、囊壁塌陷、CL较少（图1f）。此外，DHEA处理组大鼠的总睾酮（TT）、性激素结合球蛋白（SHBG）、游离雄激素指数（FAI）和促黄体生成素（LH）水平也升高（图1g-j）。TT和FAI的升高证实了DHEA给药的有效性和高雄激素性大鼠的成功发育。然而，没有观察到促卵泡激素（FSH）水平或LH/FSH比率的差异（图1k,l）。这些结果表明成功建立了具有代谢、卵巢形态和内分泌功能紊乱的类PCOS大鼠模型。

图1 脱氢表雄酮DHEA诱导的糖代谢、卵巢形态和生殖激素水平的改变

02 

雌性SD大鼠高雄激素血症伴随肠道菌群失调

使用Illumina-MiSeq平台对PBS和DHEA处理的大鼠粪便样本进行测序。α多样性方面，DHEA处理组肠道菌群的PD指数显著低于PBS处理组（附图1a）。基于unweighted UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）显示，DHEA组与PBS组的粪便样本聚类差异不显著（附图1b）。在属水平上，DHEA组Turicibacter、Anaerofustis和Clostridium sensu stricto相对丰度降低（附图1c）。LEfSe分析显示Turicibacter属、Erysipelotrichaceae科、Erysipelotrichales目和 Erysipelotrichia纲在两组间有显著差异（附图1d,e）。

附图1 DHEA诱导的类PCOS大鼠的菌群特征

03 

DHEA诱导伪无菌大鼠类PCOS表型

DHEA组和DHEA+抗生素组大鼠均进行连续35天的DHEA注射处理。在此期间，为建立伪无菌大鼠模型，DHEA+抗生素组大鼠给予抗生素鸡尾酒（ABX）处理，DHEA组大鼠在PCOS模型建立过程中给予非酸化饮用水。16S rRNA基因测序结果证实了ABX的处理效果--显著抑制了肠道菌群，为FMT提供了合适的环境（附图2a-d）。体重、空腹血糖和葡萄糖耐量不受肠道菌群清除的影响（图1a-d），两组的发情周期均为非周期性（图1e），DHEA+抗生素组也可观察到卵巢形态异常（图1f），表明缺乏肠道菌群不会影响高雄激素大鼠的葡萄糖代谢和卵巢功能紊乱。与DHEA组相比，DHEA+抗生素组的血清TT、FAI、LH、FSH和LH/FSH比值降低（图1g，i-l），而两组间血清SHBG保持不变（图1h）。肠道菌群的清除对血清生殖激素水平有显著影响。一般来说，在DHEA处理的大鼠中，肠道菌群的存在对于PCOS表型的发展可能不是必需的。

附图2 DHEA+ABX组用抗生素治疗后肠道菌群减少

04  

移植DHEA诱导的肠道微生物导致伪无菌大鼠葡萄糖耐受不良、卵巢功能障碍和内分泌紊乱

FMT受体动物实验的时间线如图2a所示。用三个疗程的抗生素鸡尾酒处理27天，以减少肠道菌群并建立伪无菌大鼠模型。ABX处理后，肠道微生物载量明显降低（附图3a），为FMT提供了有利的环境。随后将大鼠分为两组，PBS组FMT受体（t-PBS，n=6）和DHEA组FMT受体（t-DHEA，n=6）。在接下去的14天中，t-PBS组和t-DHEA组的伪无菌大鼠分别接受PBS和DHEA处理的大鼠的肠道微生物。为确保FMT受体从供体那里获得相似数量的微生物，研究者测量了两组供体的微生物载量，并将其合并显示（附图3a）。在菌群洗涤的27天和移植的14天期间，每周测量体重，发现各组之间的体重相似（图2b）。两组间的空腹血糖无差异（图2c）。与t-PBS组大鼠相比，t-DHEA组大鼠葡萄糖耐量试验（GTT）的血糖水平和曲线下面积均增加（图2d,e）。这些结果表明，类PCOS大鼠的FMT可导致伪无菌大鼠的糖耐量异常。t-PBS组的伪无菌大鼠表现出正常的发情周期，而t-DHEA组则表现出发情周期中断（图2f）。t-PBS组大鼠卵巢有不同发育阶段的卵泡和CL。t-DHEA组大鼠可见多个囊状卵泡，颗粒细胞层变薄，卵泡壁增厚（图2g）。因此，PCOS样大鼠的粪便微生物扰乱了发情周期，并导致受体卵巢形态异常。t-DHEA组的TT、SHBG和FAI水平均高于t-PBS组（图2h-j）。t-DHEA组LH水平下降不明显，而FSH水平低于t-PBS组（图2k,l）。LH/FSH比值没有发生变化（图2m）。有趣的是，DHEA诱导的类PCOS大鼠的肠道菌群失调导致了FMT受体大鼠的高雄激素血症。总的来说，DHEA组的FMT导致受体伪无菌大鼠糖耐量降低、发情周期紊乱、多囊卵巢和生殖激素失调，提示肠道微生态失调在多囊卵巢综合征的发生发展中起着重要作用。

图2 DHEA诱导的肠道菌群可导致FMT受体葡萄糖耐受不良、多囊卵巢和生殖激素紊乱

在DHEA治疗的供体中，游离循环的DHEA在肝脏中通过硫酸化转化为脱氢表雄酮硫酸酯（DHEA-S），并被排泄到胃肠道。非靶向代谢组学分析显示，在两组的粪便样本中均未检测到DHEA；但在接受DHEA处理的供体中，DHEA-S水平升高（附图3b）。PCOS患者的粪便中DHEA-S水平也升高。对两组粪便样本中的DHEA-S水平进行量化（附图3c）。虽然DHEA组大鼠肠道内容物中DHEA-S水平较PBS处理组显著升高，但绝对定量显示两组间差异均无显著性。DHEA-S水平在DHEA组为665±63.21 ng/g，在PBS组中为109.8±10.11 ng/g，远低于诱发多囊卵巢综合征表型的最低有效浓度。

05  

FMT受体大鼠肠道微生物组和代谢组的变化

对t-PBS组和t-DHEA组的粪便样本进行16S rRNA基因测序，以证实FMT的有效性，并进一步研究FMT诱导类PCOS表型的潜在机制。不出所料，t-DHEA组供体的菌群特征再次出现在受体中。受体大鼠的α多样性指数与供体大鼠相似（图3a）。β多样性分析显示，t-DHEA组与t-PBS组的样品形成了不同的聚类（图3b）。在PBS和DHEA处理组及其受体的肠道菌群中，Firmicutes、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Proteobacteria在门水平占主导地位，Clostridia、Bacteroidia、Verrucomicrobiae和Bacilli在纲水平上占主导地位，Akkermansia、Bacteroides、Lactobacillus和Parabacteroides在属水平上占主导地位（附图4）。一些物种在t-PBS组中显著富集，包括Turicibacter和Clostridium ensu stricto属，Erysipelotrichaceae和Clostridiaceae 1科，Erysipelotrichales目，Erysipelotrichia纲，它们在PBS处理的供体中也富集。在这些差异物种中，Turicibacter属、Erysipelotrichaceae科、Erysipelotrichales目和Erysipelotrichia纲在LEfSe分析中的LDA score值也非常高，与供体大鼠的菌群特征一致（图3d,e）。Source Tracker分析表明，供体是t-PBS和t-DHEA大鼠肠道菌群的主要来源（图3f）。所以，DHEA诱导的肠道菌群被成功地转移到了受体大鼠中。

16S KEGG功能预测结果显示，酮体和G蛋白偶联受体的合成和降解途径在t-PBS组中富集，β-丙氨酸代谢、生物素代谢和矿物质吸收途径在t-DHEA组富集（图3g）。这些数据提示，DHEA诱导的菌群移植后，肠道菌群在环境感知、能量、维生素、氨基酸和矿物质代谢等方面可能发生异常功能。属水平物种和临床指标的相关性分析（图3h）显示睾酮水平与Clostridium sensu stricto、Turicibacter、Olsenella和Anaeroplasma的相对丰度呈负相关。FAI与Olsenella相对丰度呈负相关。FSH水平与Clostridium sensu stricto和Olsenella等菌属呈正相关。此外，GTT曲线下面积和FBG水平与Clostridium sensu stricto、Anaeroplasma等菌属的相对丰度有关。

图3 FMT受体大鼠肠道菌群特征

通过对粪便代谢组的研究，进一步了解FMT后的功能变化。图4a显示了含量最高的30种代谢物。t-PBS组和t-DHEA组间差异显著的粪便代谢物有氨基酸代谢物、脂肪酸和胆汁酸（图4b,c）。2-羟基硬脂酸、精氨基琥珀酸、1-辛烯-3-丙二醇苷、大豆苷元和4-乙酰氨基丁酸的含量与Anaeroplasma、Turicibacter和Clostridium sensu stricto的相对丰度显著相关（图4d）。图4E显示了与至少一个临床指标相关的差异表达代谢物。每两种代谢物之间的相关分析如图4F所示。功能富集分析表明，DHEA诱导的肠道菌群移植影响了精氨酸的生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢（图4g）。

图4 FMT受体大鼠粪便样品的非靶向代谢分析

06 

FMT受体大鼠肝脏的代谢表型和遗传变化特征

FMT显示肠道菌群失调显著影响代谢功能。肝脏是生理代谢的主要部位，因此研究者对肝脏的基因表达和形态学进行了评估。苏木精-伊红（H＆E）和油红O（ORO）染色显示t-DHEA组的肝组织切片含有比t-PBS组更多更大的脂滴（图5a,b）。血脂谱的测量结果提示t-DHEA组脂质代谢异常（图5c）。肝脏基因表达谱被用来更深入地了解肝脏中葡萄糖和脂肪代谢的调节（图5d-g），结果表明肝组织基因表达异常可能参与了DHEA诱导菌群的移植所引发的代谢紊乱。

图5 DHEA诱导的肠道菌群FMT可调节肝脏代谢

研 究 结 论

DHEA处理可诱导SD大鼠的类PCOS表型和肠道菌群失调。伪无菌大鼠PCOS模型的建立表明去除肠道菌群并不能防止DHEA处理大鼠PCOS样表型，高雄激素血症仍是PCOS发病的主要因素。DHEA诱导的肠道菌群移植可导致受体的类PCOS表型，包括代谢和内分泌功能障碍。因此，雄激素影响下的肠道菌群在PCOS的发病机制中也起着一定的作用。这些新的发现有助于理解PCOS新的致病因素和开发潜在的综合性治疗方案。

- End -