信阳师范：生命阶段对两个野生冬眠中华大蟾蜍种群的肠道微生物群差异的决定性影响

导读  

到目前为止，驱动因素对两栖动物肠道菌群的影响仍然很复杂。由于长期禁食，冬眠的两栖动物是探索这个问题的理想实验对象。该研究采用16S rRNA扩增子测序技术，对中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）冬眠成体的小肠微生物区系进行了分析，并对非饮食因素的影响进行了评价（例如，性别和宿主遗传背景）。变形菌门（0.9196 ± 0.0892）是冬眠中华大蟾蜍小肠菌群中最优势菌门，在鉴定出的5个核心OTU中，3个OTU被分类为假单胞菌属（Pseudomonas）。鉴于主要KEGG途径（如双组分系统）与假单胞菌属Pseudomonas之间的一致性，假单胞菌属Pseudomonas似乎是冬眠期间小肠菌群的关键微生物。此外，研究人员发现地理种群之间的肠道菌群差异大于性别之间的差异。性别和宿主遗传背景对肠道菌群变异的影响较小。生命阶段被认为是导致种群间肠道菌群差异的决定性因素。然而，大部分肠道菌群变异（约70%）不能用所测的确定因素解释（也就是性别、位置、体长和血液常规指标）。因此，其他因素和/或随机过程可能在形成冬眠两栖动物肠道细菌群落中发挥关键作用。

论文ID

原名：Decisive Effects of Life Stage on the Gut Microbiota Discrepancy Between Two Wild Populations of Hibernating Asiatic Toads (Bufo gargarizans)

译名：生命阶段对两个野生冬眠中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）种群的肠道微生物群差异的决定性影响

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：5.640

发表时间：2021.8.3

通讯作者：宋晓威

通讯作者单位：信阳师范学院生命科学学院

DOI号：10.3389/fmicb.2021.665849

实验设计

结果

1 冬眠中华大蟾蜍肠道菌群和功能

研究人员共获得457,632条质量控制后的16S rRNA基因扩增子序列（附表3）。这些序列的长度从300个碱基到492个碱基（平均长度423个碱基）。在这些序列中，412,647个序列（即总序列的90.17%）注释到630个OTUs。特别是在25个样品中注释到OTU的序列范围在6,301至46,313（平均值16,506）。共筛选出1个古菌门（即Crenarchaeota）和18个细菌门。变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度为（0.9196 ± 0.0892），是所有的样品最优势菌门，范围在60.78 - 99.60%（图1）。五个菌门，即放线菌门（Actinobacteria，0.0080 ± 0.0100）、拟杆菌门（Bacteroidetes，0.0244 ± 0.0587）、厚壁菌门（Firmicutes，0.0111 ± 0.0190）、梭杆菌门（Fusobacteria，0.0019 ± 0.0038）和螺旋体菌门（Spirochetes，0.0024 ± 0.0101），在至少一个样品中相对丰度超过1%。未鉴定菌门在肠道菌群的丰度为0.16–18.64%。丰度排名前2的优势菌属是Pseudomonadaceae的成员，即Pseudomonas （0.5023 ± 0.2314）和1个未鉴定菌属（0.2662 ± 0.1147）（附图3）。种群和性别共享的OTUs分别为431（68.41%）和 480（76.19%）（图1）。未检测到地区特异性（即，核心OTU对应唯一地区）和性别特异性核心OTU（即，核心OTU对应唯一种性别）。TJ和XZ种群核心OTUs分别为8和9，雄性和雌性分别为5和11（附表4）。所有样品中的5个核心OTUs被归为变形菌纲，包括3个科，即假单胞菌科（Pseudomonadaceae；OTU1, OTU2和OTU4）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae；OTU5）和气单胞菌科（Aeromonadaceae；OTU7）。在所有样品中，OTU1（假单胞菌属），OTU2（假单胞菌科的未鉴定菌属）和OTU4 （假单胞菌属）是前两优势菌属中的三个主要成员。有趣的是，通过使用SINA（版本1.2.11）搜索SILVA SSU Ref NR数据库（release 138.14），OTU2也被归类为Pseudomonas（同一性 ≥ 0.97）。另外， 基于Greengenes，使用SINA工具对基因进行分类，没有明确分配菌属的OTU5和OTU7分别分类为拉恩氏菌属Rahnella（Yersiniaceae：肠杆菌目的一个新科）和气单胞菌属。

由于方法的限制，许多稀少OTU无法应用于PICRUSt分析。特别是，630个OTU中的一小部分（即30.63%）被确定为Greengenes（版本13.5）的代表性OTU（基于97%的同一性）。然而，这些优势OTU占质量控制序列的83.61%（即 457,632）。预测的前5个KEGG通路是转运体（0.0634 ± 0.0046）、ABC转运体（0.0409 ± 0.0026）、一般功能预测（0.0375 ± 0.0012）、双组分系统（0.0319 ± 0.0018）、分泌系统（0.0261 ± 0.0010）。

图1 OTUs在25份样品肠道菌群样品中组间分布（A）及在门分类水平的相对丰度（B）。在维恩图中，每个带有“全部”或“核心”后缀（即地域或性别）分别代表总OTUs或核心OTU（即100% individual coverage）。样品间平均相对丰度 < 0.001的类群被归为“Others”。

  2 群体间肠道微生物群的差异大于性别间的差异

在取样深度为6301时，保留了588个OTUs（占630个OTUs的93.33%）。25个样本的平均OTU数为98，标准差为53（附表5）。研究人员发现Shannon （p < 0.001）和Pielou’s指数（p < 0.001）在两个种群间有显著性差异，但是observed OTUs （p = 0.140）和Faith’s PD（p = 0.610）没有显著性差异（表1）。然而，α多样性指数在不同性别间无显著差异。此外，性别和位置因素对Faith’s PD指数有显著的交互影响（p = 0.019）。地域因子对rarefied OTU表（表1）的Bray–Curtis（p = 0.001）和Jaccard（p=0.003）距离矩阵有显著影响，但性别因子对这些β多样性指数没有显著影响。此外，种群间29个菌群相对丰度差异显著，性别间3个类群间相对丰度差异显著。排除与其子菌群相对丰度相等的高分类水平的菌群后，得到了两个种群之间的17个差异显著的菌群（如Pseudomonas），以及两性之间的一个差异显著的菌群（即Chlamydiales）。KEGG通路在性别和种群间均无显著差异。如果使用未修正的p值，81条KEGG通路在两个种群间存在显著差异。因此，不同的种群比不同的性别拥有更大的肠道菌群差异。

表1 Alpha和Beta多样性指数的Two-way ANOVA（性别和地域）和PERMANOVA方差分析（即rarefied OTU表的Bray–Curtis和 Jaccard距离矩阵，排列数permutation number= 9,999）。加粗的p值表示小于0.05。

3 未发现宿主遗传对肠道微生物结构和功能变异的影响

遗传标记mtDNA和SSR在这些个体间产生了不一致的遗传分化模式【r = 0.095 （FDR-adjusted p = 0.309）和r = 0.090（FDR-adjusted p = 0.309）】（附图7）。此外，宿主遗传分化模式与肠道微生物的结构和功能变异均无显著相关性。

4 生命阶段对种群间肠道菌群差异起主导作用

生命阶段与两个α多样性指数存在显著的Spearman相关性（即Shannon 和 Pielou’s evenness），16个与种群因子显著相关的菌群，以及丰度排名前10的代谢途径中的9个KEGG途径（相对丰度差异）与种群有显著相关性（附图8）。具体而言，生命阶段的形态特征与α多样性指数、XZ种群显著富集的菌群和KEGG途径呈负相关，而与TJ种群显著富集的菌群和KEGG途径呈正相关。在种群显著相关的菌群（和KEGG途径）和五个RBT因子（即肌酸激酶、天冬氨酸转氨酶、总蛋白、球蛋白和碱性磷酸酶）之间检测到一些显著相关性，但只有两个因子（即肌酸激酶和碱性磷酸酶）与α多样性呈显著相关性。此外，肌酸激酶和天冬氨酸转氨酶之间的地域差异也被检测到。除肌酸激酶外，RBT因子与生命阶段因子无显著相关性。因此，种群间肠道菌群差异的主要原因可能是种群间生命阶段因子的显著差异。

在RDA分析中，检测到两个重要的约束轴（即RDA1和RDA2）分别解释了14.09和8.23%的肠道菌群变异（图2）。TJ和XZ种群在RDA1和RDA2维度上存在差异。体长、球蛋白和肌酸激酶与基于RDA1和RDA2的肠道菌群变异显著相关。3个（即OTU1、OTU3和OTU4）和2个OTUs（即OTU6和OTU68）分别与RDA1和RDA2显著相关。然而，约束轴（即0.302）解释的肠道菌群变异率远小于无约束轴解释的肠道菌群变异率。VPA分析证实了这一现象，性别、地域、体长和RBT占肠道菌群变异的30.33%（图2）。除体长在与地域相关的变异中起主导作用外，体长是唯一能显著解释变异的单一因素。PLSPM分析证实了两个地域之间的蟾蜍生命阶段显著差异（图3）。从地域和生命阶段到Alpha多样性指数没有检测到显著的直接通流系数。但从生命阶段到与地域种群显著相关菌群组成的路径上可能存在显著的直接通流系数。

图2 Hellinger变换的rarefied OTU表上的RDA（A）和VPA（B）。在简化模型下，采用置换检验对每个被解释变量的显著性进行检验（permutation number = 999，p < 0.05）。

图3 生命阶段、地域和α多样性（A）或与种群显著相关菌群组成（B，C）的偏最小二乘路径建模（PLSPM）。对于地域因素，TJ为“1”，XZ为“0”。TJ_biased和XZ_biased分别代表相对丰度与TJ和XZ显著相关的菌群。GOF是反映模型质量的拟合优度指标。原始路径系数和bootstrap值（均值 ± 标准差）沿路径显示。

  5 幼龄和老龄蟾蜍肠道菌群共发生网络的差异

幼龄组和老龄组的OTU共现网络存在显著差异（图4和表2）。具体而言，幼龄组的六个网络参数（即边缘数、节点数、直径、密度、平均路径长度和归一化介数中心度）大于老龄组。五个核心OTUs（即 OTU15、OTU33、OTU55、OTU63和OTU70）存在于幼龄组，而老龄组中没有。一个核心OTU从所有样品的共现网络鉴定到（即OTU8，图4）。此外，在共发生网络中，研究人员发现3个目标OTUs（即OTU1、OTU4和OTU8）与生命阶段相关（即体长）。

图4 根据Spearman相关性，幼龄组（A）组和老龄（B）组中24个共享OTU和所有样本（C）中37个共享OTU的共发生网络。相关系数在最小阈值为0.6时过滤，经FDR修正p < 0.05。删除了单例节点。节点大小与OTU相对丰度呈正相关。

表2 冬眠蟾蜍幼龄组（体长 ≤ 8.4 cm, n = 10）和老龄组（体长 ≥ 9.8 cm, n = 11）OTU共现网络的拓扑性质。

p值展示了幼龄组与老龄组Mann-Whitney差异检验显著性水平，p < 0.05用粗体表示。

讨论

本文中，研究人员探索了两个野生冬眠蟾蜍（B. gargarizans）种群的小肠微生物菌群。类似于冬眠两栖动物的大肠或全肠微生物群（例如黑龙江林蛙Rana amurensis，东北林蛙R. dybowskii，木蛙R. sylvatica和斑腿泛树蛙Polypedates megacephalus），变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门是冬眠的中华大蟾蜍小肠菌群的优势菌门（图1）。然而，本研究中这三个菌门的相对丰度与以往对大肠或全肠菌群的研究有很大的不同。例如，变形菌门在小肠菌群中所占比例最高（0.9196 ± 0.0892）。与活跃时期相比，变形菌门在冬眠动物的大肠菌群或全肠菌群中的相对丰度较高，这并不适用于所有两栖动物。考虑到非冬眠期两栖动物小肠和大肠菌群中变形菌门的相对丰度，可知小肠中变形菌门的增加速率似乎比冬眠时的大肠更高。然而，由于没有关于非冬眠蟾蜍的肠道微生物群的数据，所以这个假设没有得到验证。

在两栖动物中，随着禁食，小肠性能的降低（例如，肠道质量和长度、肠细胞大小、粘膜厚度和消化能力的降低）在进化上普遍存在，在消化或冬眠期间更为严重。冬眠期间从外部营养到肠道黏液的食性转变可能是重塑两栖动物肠道菌群的关键决定因素（例如，细菌数量减少，拟杆菌门/厚壁菌门比率增加），虽然没有关于小肠微生物群的数据。假单胞菌属在自然界中（例如饮用水）和宿主内环境中普遍存在（例如小肠）。虽然假单胞菌属通常被视为两栖动物的条件致病菌，但是大肠中适度的假单胞菌属积累似乎是冷适应和免疫成本之间的权衡。有趣的是，我们在冬眠的蟾蜍的小肠中检测到大量的假单胞菌属（附图3）。这种现象的一个可能原因是小肠有比大肠更适合的条件（例如，氧气含量更高或更容易接触到外部假单胞菌属）。此外，预测的KEGG通路（如ABC转运体）倾向于参与环境信息处理（附图4）。根假单胞菌属与主要KEGG通路（如双组分系统之间的显著相关性，假单胞菌属似乎是冬眠期间小肠微生物群的关键菌群。研究人员还鉴定了两个亚优势核心OTUs（注释为拉恩氏菌属和气单胞菌属）广泛分布于水环境，这可能与亚洲蟾蜍的水下冬眠方式有关。此外，耐寒性共生拉恩氏菌属和气单胞菌属的共存似乎符合冷适应和免疫成本之间的权衡假设。

为了有效地控制肠道菌群，维持宿主的健康，需要阐明驱动因素和肠道菌群之间的关系。然而，在多种驱动因素对肠道菌群发挥协同作用的情况下，这是一个巨大的挑战。例如，在许多两栖动物物种中，如中华大蟾蜍、泽陆蛙（Fejervarya limnocharis）、弹琴水蛙（Babina adenopleura）和火蝾螈（Salamandra salamandra）。在大多数情况下，种群间肠道微生物群的差异可归因于不同的生境（如饮食结构和细菌物种池），而不是遗传背景。甚至物种对肠道菌群的影响有时也比栖息地的影响弱。例如，栖息地因素而不是物种因素解释了泽陆蛙和弹琴水蛙肠道菌群结构和功能差异。由于长期禁食，冬眠的两栖动物为评估非饮食因素对肠道微生物群的影响提供了一个理想的实验平台。例如，在两种同域共存蛙类（即黑龙江林蛙和东北林蛙）冬眠期间，在肠道微生物群中检测到种间差异。

此研究发现中华大蟾蜍两个地理种群间的小肠菌群存在显著差异。然而，种群之间的差异似乎不是由种群特定的栖息地决定的。首先，冬眠期间的栖息地在种群之间趋于同质，如长期禁食和水下冬眠。第二，天津（蓟运河）和徐州（骆马湖）种群处于受人类活动影响的相似生态环境中。第三，没有为这两个群体确定特定地域的核心OTU（即，群体中100%的样本发生率）。尽管如此，由于两个地点之间的地理距离约为600 km，两个种群的不一致冬眠跨度可能是真实的，并导致种群之间的肠道微生物群差异。此外，蟾蜍的微生境在活动期的饮食结构和细菌种类可能是异质性的。地域特异性的OTUs占总OTUs的31.59%，表明种群间细菌物种池可能存在差异（图1）。然而，这些地域特异性的OTUs样本出现描述了与地域共享OTUs相似的偏态分布（在单个个体中存在39.20%）。这一现象表明，个体间肠道细菌种的偶然性较高，而地域特异性OTUs和地域共享OTUs之间存在偶然性相似。因为蟾蜍（在同一种群中）的饮食范围很广（例如，昆虫和蚯蚓），食性的高度异质性可能是偶然性高的原因之一。因此，栖息地（细菌物种池）似乎在这两个冬眠亚洲蟾蜍种群的肠道微生物区系差异中发挥了微弱的作用。

在生态适应中，性别特异性的可能影响肠道微生物群，但在α和β多样性指数方面，没有检测到显著的性别差异（表1），除了雌性较高的菌群，即致病性Chlamydiales。VPA结果表明，性别并不是中华大蟾蜍冬眠期间肠道菌群变化的重要驱动因素（R2 = 0.003，p = 0.344）。至于性别和地点因素对Faith’s PD指数有显著的交互作用（p = 0.019），一个可能的原因是生命阶段的抽样偏差导致的。具体来说，生命阶段因素在地理位置之间表现出显著差异。此外，生命阶段因素（如体长）在性别和地域因素之间也表现出显著的交互作用。这是一个基于生命阶段对肠道微生物群的驱动作用的大胆推断。遗传分化模式与肠道菌群β多样性的共变异不显著，表明宿主遗传背景对冬眠蟾蜍肠道菌群变异的解释能力较弱。尽管使用了两种类型的标记（微卫星和线粒体DNA）来推断遗传差异模式，亲属关系和亲缘关系可能是有偏颇。例如，细胞核（双亲遗传）和线粒体DNA（母系遗传）的遗传规则不同，可能导致了不一致的遗传差异模式。为了在群体规模上鉴定蟾蜍肠道菌群的遗传物质，需要从基因组水平进行深入的研究。本研究中TJ种群的生命阶段因子明显大于XZ种群。虽然由于纬度和性别的差异，这些因素（如体长）不能给出蟾蜍确切的生命阶段（即年龄），但这两个种群的生命阶段明显不同。此外，生命阶段因子与种群相关菌群和KEGG通路具有显著的相关性。生命阶段是决定两栖动物肠道菌群组成的重要因素。因此，有理由假设是生命阶段的采样偏差导致了肠道菌群间的差异。尽管RBT因子也与种群相关菌群和KEGG通路存在一定程度的关联，但这种关联可能是生命阶段对肠道菌群影响产生的副产物。例如，肌酸激酶在肌酸/磷酸肌酸穿梭系统中发挥重要作用，协助ATP水解，可作为肌肉退化的指标。肌酸激酶与生活阶段的正相关表明，在冬眠期间，老龄的蟾蜍可能比幼龄的蟾蜍有更大强度的肌肉退化。然而，我们不能排除一些与生活阶段无关的RBT因素的可能性（如天冬氨酸转氨酶）能够解释部分肠道微生物变异，如通过血液代谢物。上述假设得到了RDA、VPA、PLSPM等后续分析的支持（图2和3）。虽然体长和两个RBT因子（即肌酸激酶和球蛋白）与肠道菌群变异显著相关，但肠道菌群变异的主导因子是体长（R2 = 0.128，p = 0.001），而不是RBT因子（R2 = 0.056，p = 0.255）。此外，VPA结果还显示，由地域（R2 = 0.081，p = 0.005）解释的变异率与体长（R2= 0.183）密切相关。PLSPM分析进一步证实，生命阶段（即体长）是两个种群肠道菌群差异的决定性因素（图3）。根据之前对猪肠道微生物组的研究，在冬眠的蟾蜍中检测到OTU共发生网络的生命阶段性差异（图4）。在冬眠期间，老龄群体的微生物网络往往比年轻群体的更简单。共现网络分析发现，假单胞菌属（即OTU1和OTU4）和拟杆菌属（Bacteroides；即OTU8）是生命阶段的效应菌群。有趣的是，筛选出了RDA中与前两个约束轴相关的假单胞菌属（即OTU1和OTU4）、沙雷氏菌属（Serratia；即OTU3）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter；即OTU6）和希瓦氏菌属（Shewanella；即OTU68）。在共发生网络分析中，这些条件致病菌和/或与寒冷胁迫相关的细菌（例如假单胞菌属和 柠檬酸杆菌属）与生命阶段的显著相关，这表明在不同的生命阶段，肠道微生物群对冬眠的反应似乎是不同的。

结论

综上所述，来自两个野生种群的成年冬眠蟾蜍的小肠微生物群的特征是变形菌门的相对丰度最高，尤其是Pseudomonas。性别和遗传背景往往在冬眠的中华大蟾蜍肠道细菌群落中起次要作用。不同地理位置的肠道菌群差异主要是由生命阶段造成的。然而，在两个冬眠蟾蜍野生种群中，大部分肠道微生物群的变异（约70%）不能用本研究中测量的确定性因素来解释，如生命阶段。根据地域特异性OTUs的显著偏态分布，冬眠蟾蜍的肠道菌群似乎不仅受到确定性过程的驱动，而且受到随机过程的驱动，如历史偶然性。最后，冬眠蟾蜍野生种群的研究存在局限性，如饮食和栖息地的历史偶然性不受控制。因此，对冬眠两栖动物肠道菌群的进一步研究需要更大的样本量和/或更精确地控制非靶向因素。

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