科研 | 山大齐鲁医院：益生菌干预可减轻与剖腹产相关的食物过敏症状（国人佳作）

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

剖腹产分娩(CS)与儿童食物过敏发生率增加有关，并影响早期肠道菌群定植。此外，新出现的证据表明，肠道菌群失调与食物过敏有关。在本文中，我们研究了CS对卵清蛋白(OVA)食物过敏大鼠模型的影响。研究发现，CS分娩的大鼠比阴道分娩的大鼠对OVA致敏反应更敏感，攻毒后直肠温度下降幅度更大，腹泻更严重，OVA特异性抗体和组胺水平更高。粪便16S rRNA测序显示，CS大鼠的乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)水平降低。预防性补充含有乳杆菌和双歧杆菌的益生菌组合可以保护CS大鼠免受OVA的过敏反应，说明菌群失调有助于CS相关反应。此外，生命早期的益生菌干预可能有助于重建异常的Th2反应和紧密连接蛋白，这两者都与CS相关的高过敏反应有关。综上所述，本研究表明，肠道菌群失调在CS介导的食物过敏发病机制中发挥了重要作用。更重要的是，在生命早期调节微生物组成的干预措施对CS相关食物过敏具有治疗意义。

论文ID

原名：Probiotic Interventions Alleviate Food Allergy Symptoms Correlated With Cesarean Section: A Murine Model 

译名：利用鼠模型揭示益生菌干预可减轻与剖腹产相关的食物过敏症状

期刊：Frontiers in Immunology

IF：7.561

发表时间：2021.9.28

通讯作者：李延青

通讯作者单位：山东大学齐鲁医院消化内科

DOI号：10.3389/fimmu.2021.741371

实验设计

结果

1 CS可增加OVA引起的食物过敏的严重程度

为了确定分娩方式是否对食物过敏有影响，我们基于CS建立了大鼠食物过敏模型(具体描述见材料与方法部分)。通过CS或阴道分娩(VD)的Sprague Dawley大鼠，每天用1mg OVA(溶解在1ml PBS中)或单独1 ml PBS致敏，起始时间为第21天，结束时间为第69天。4组大鼠在第70天口服100 mg OVA，8小时后处死以进一步分析(图1A)。

为了评估我们的食物过敏模型，我们首先根据粪便评分和直肠温度变化评估过敏症状。OVA-致敏组显著的腹泻和低温表明食物过敏模型的成功实施(图1B, C)。与VD_OVA组相比，CS_OVA组大鼠腹泻明显加重，温度变化更大。与过敏症状一致的是，致敏组血清中OVA特异性IgE和IgG水平显著升高，并经CS放大，为建立食物过敏模型提供了坚实的血清学证据(图1D,E)。OVA处理CS大鼠的组织和血清中过敏标志物组胺水平均显著高于VD大鼠，表明CS大鼠的过敏反应更为严重(图1F)。然而，攻毒后回肠苏木精-伊红(HE)染色显示无病理变化(同样见图S1)。综上所述，这些发现表明CS会加重OVA诱发食物过敏大鼠的病情。

图1 CS可增加OVA诱发食物过敏的严重程度。(A) VD和CS大鼠食物过敏示意图。(B)通过粪便评分判断过敏性腹泻的严重程度。(VD_PBS n = 9, VD_OVA n = 8, CS_PBS n = 8, CS_OVA n = 8)。(C) 攻毒后25分钟直肠温度的变化(VD_PBS n = 9, VD_OVA n = 8, CS_PBS n = 8, CS_OVA n = 8)。(D, E) OD 450测定血清中OVA特异性IgE (D)和IgG (E)的相对水平，n = 8。(F) ELISA法测定回肠或血清组胺水平。n≥6。对于(B)，条形代表平均值±SEM。对于(C-F)，圆形和正方形代表个体大鼠，条形代表平均值±SEM。采用双侧t检验或单因素方差分析，*P＜0.05, ** P＜0.01, ***P＜0.001。VD，阴道分娩；CS，剖腹产。

  2 CS调节紧密连接蛋白的表达并上调Th2细胞因子的水平

我们假设OVA大鼠的肠道屏障因其腹泻症状而受到损害。因此，我们分析了紧密连接蛋白的表达，紧密连接蛋白是上皮细胞中最粘连的连接复合物，维持肠道屏障并调节其通透性。对OVA处理大鼠回肠蛋白进行蛋白质印迹（Western blot）分析显示，CS群落中ZO-1、occludin和claudin-1的表达水平低于VD组(图2A)。令人惊讶的是，OVA致敏对VD大鼠的紧密连接蛋白几乎没有影响。进一步对VD和CS大鼠回肠组织进行免疫组化染色验证结论；与VD_OVA动物相比，CS_OVA动物中ZO-1、occludin和claudin-1的表达水平较低(图2B)。这些数据表明，当暴露于膳食抗原时，与VD相比，CS分娩的大鼠肠道屏障受损更严重。

食物过敏与Th2细胞因子如IL-4和IL-10的失调有关，表明Th2反应在食物过敏中至关重要。因此，我们研究了Th2标志物在回肠中的表达。ELISA结果显示，CS_OVA组的IL-4和IL-10水平均高于VD_OVA组(图2C)。qRT-PCR结果与ELISA结果基本一致(图2D)。这些发现表明，在CS组中，与食物过敏有关的Th2细胞因子水平更高。

图2 CS调节紧密连接蛋白的表达，上调Th2细胞因子的水平。(A) Western blot分析四组回肠紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1。以β-肌动蛋白为内参(左图)。与β-肌动蛋白相关的紧密连接蛋白的灰度统计(右图)。n≥6。(B) ZO-1、occludin和claudin-1蛋白免疫组化染色的代表性图像。比例尺= 50 μm。(C, D)采用ELISA法(C)和q-RT-PCR法(D)检测IL-4和IL-10水平。数据用平均值±SEM表示。采用双侧t检验或单因素方差分析，*P＜0.05, ** P＜0.01, ***P＜0.001; ns, 不显著。VD，阴道分娩；CS，剖腹产。

3 食物过敏与CS引起的肠道菌群变化密切相关 我们假设CS组和VD组之间肠道微生物群的变化是临床特征、肠道屏障通透性和免疫反应差异的根本原因。因此，我们通过16S rRNA基因测序分析了第7、21和70天CS组和VD组的肠道菌群组成。OTU水平上的PCoA显示，与VD相比，CS后代在第7天(p = 0.003)和第21天(p = 0.001)的微生物群落结构显著不同(图3A, B)。我们还发现CS大鼠致敏组和对照组之间的微生物组组成有显著差异(p = 0.009)，但是VD大鼠没有类似的变化(p = 0.103)，这意味着CS放大了PBS和OVA处理组之间微生物群落的改变(图3C)。这也可以解释紧密连接蛋白水平的差异。第7天，Shannon指数表明CS大鼠粪便中α多样性较高。Ace和Chao指数也显示CS组的微生物多样性高于VD组(图3D)。在致敏结束时(第70天)，基于这三个指标的细菌丰富度和多样性在VD_PBS组和VD_OVA组之间没有显著差异，CS_OVA组的Ace和Chao指数高于CS_PBS组(图3E)。这些数据表明，CS引起的菌群组成变化在OVA食物过敏大鼠中持续存在。 LDA用于鉴别差异最丰富的类群，并生成分支图。利用LEfSe分析发现，CS大鼠在第7天(LDA值为5.36)和第21天(LDA值为5.06)乳杆菌(Lactobacillus)序列减少最多，而双歧杆菌属(Bifidobacterium)序列在第21天(LDA值为3.68)也明显减少(图4A、B；参见图S2和图S3)。我们发现了在以前的出版物中已经注意到的其他几个重要类群，表明肠道细菌的变化是有和没有食物过敏的儿童之间的根本区别。CS组的Faecalibacterium、Clostridium sensu stricto和Subdoligranum属的水平较高，与健康儿童相比，它们在食物过敏儿童的水平较高。相反，已被报道与食物过敏负相关的乳杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌(Streptococcus)和普雷沃氏菌(Prevotella)在VD对照组中富集。 根据我们的数据，CS大鼠群体可以产生更多的Th2细胞因子。为了确定更高水平的Th2细胞因子和微生物菌群失调之间是否存在联系，我们检测了在OVA致敏后白细胞介素和分类群丰度之间的关系。热图表明失调细菌的水平(如瘤胃球菌Ruminococcus、norank_f: Muribaculaceae和unclassified_f: Prevotellaceae)与IL-4和IL-10的蛋白水平呈正相关关系(图4C)。CS_OVA组的 Ruminococcus (p = 0.0619)、norank_f: Muribaculaceae (p = 0.0043)、non - fied_f: Prevotellaceae (p = 0.0416)的相对丰度高于VD_OVA组(图4D)。因此，我们推测这些细菌参与了食物过敏的发展，尤其是瘤胃球菌(Ruminococcus)，其在食物过敏病例中是一种臭名昭著的细菌。综上所述，这些发现表明，CS后代由于肠道菌群的变化更有可能发生食物过敏。我们首次证明，由微生物群差异触发的较高水平的Th2细胞因子在CS介导的大鼠食物过敏模型中发挥了重要作用。  

图3 分娩方式影响微生物群的组成。(A-C) VD和CS大鼠第7天(A)、21天(B)和70天(C)粪便微生物组成的PCoA图。PCoA是基于Binary-jaccard距离。采用ANOSIM和999次排列检验。(D, E)第7天(D)和第70天(E)的Shannon、Ace和Chao指数。数据以平均值±SEM表示，通过双侧t检验或单因素方差分析确定统计学意义，*P＜0.05, ***P＜0.001, ns, 不显著。(A, D)第7天(VD n = 6, CS n =7)；(B)第21天(VD n =9, CS n =9)；(C, E)第70天(VD_PBS n = 9, VD_OVA n = 8, CS_PBS n = 8, CS_OVA n = 6)。VD，阴道分娩；CS，剖腹产。

 图4 食物过敏与CS诱导的微生物群的差异有关。(A, B)基于LEfSe分析的分支图，从门到属水平，在第7天(A)和第21天(B)的Kruskal Wallis秩和检验值设置为0.05。(A)第7天(VD n = 6, CS n =7)；(B)第21天(VD n =9, CS n =9)。(C) Spearman相关热图显示IL-4和IL-10蛋白水平与属丰度的相关性(n = 6)，红色和蓝色块分别表示正相关和负相关。Spearman相关系数＞0.75/＜-0.75。(D)第70天(C)与IL-4和IL-10水平正相关的某些特定微生物的相对丰度(VD_OVA n = 8, CS_OVA n = 6)。* P ＜0.05, ** P ＜0.01, ns, 不显著。VD，阴道分娩；CS，剖腹产。

4 益生菌干预调节CS大鼠肠道菌群结构

由于CS大鼠断奶前发现乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)含量较低，考虑到肠道菌群在调节过敏反应中的关键作用，我们假设在CS大鼠早期补充乳杆菌和双歧杆菌可能逆转OVA致敏引起的食物过敏症状。基于这一假设，我们首先研究了从出生到第21天提供一种广泛使用的含嗜酸双歧杆菌(Lactobacillus acidophilus)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的益生菌片是否可挽救CS相关肠道菌群失调(图5A)。OTU水平上的PCoA显示，益生菌给药21天后，肠道菌群结构发生明显改变(图5B)。第21天，CSP组的alpha多样性和微生物丰度均高于CSO组(图5C)。分支图显示CSP组中富集Alistipes和Veillonella属(图5D)；其中两属与食物过敏呈负相关。除unclassified_f:Prevotellaceae外，在第70天，CSP组与Th2细胞因子正相关的属(Ruminococcus和norank_f: Muribaculaceae；图4C)相对丰度明显低于CSO组(图5E)。这些发现表明益生菌的干预改变了微生物群的组成，抑制了某些与食物过敏相关的细菌。因此，益生菌干预可能是一种有效的调整CS后代微生物群落结构的策略。

图5 益生菌干预调节CS大鼠肠道菌群结构。(A) CS大鼠益生菌干预及食物过敏示意图。(B) CSO和CSP大鼠第21天粪便菌群组成PCoA，n = 7。ANOSIM和999次排列检验。(C)第21天的Shannon、Ace和Chao指数。n = 7。(D)基于LEfSe分析的CS和CSP分支图，从门到属水平，Kruskal Wallis秩和检验值设为0.05，n = 7。(E)第70天某些特定微生物的相对丰度。n = 7。数据以平均值±SEM表示，通过双侧t检验或单因素方差分析确定统计学意义，*P＜0.05, ns, 不显著。CSO，剖腹产的后代；CSP，剖腹产与益生菌干预。   

5 出生后益生菌干预保护CS大鼠免受食物过敏

接下来，我们探讨了在生命早期给予益生菌是否有助于缓解CS大鼠的过敏症状。从粪便评分和直肠温度来看，与CSO组相比，CSP组的益生菌治疗改善了腹泻和低体温症(图6A,B)。此外，血清学分析表明，益生菌可以降低血清中OVA特异性IgE和IgG的浓度(图6C,D)。致敏CS大鼠灌胃益生菌后血清和组织中组胺水平均下降(图6E)。因此，益生菌干预已被证实可以缓解食物过敏模型大鼠的症状和免疫反应。

Western blot分析显示，CS大鼠中被OVA致敏损伤的紧密连接蛋白，如ZO-1、occludin和claudin-1，在益生菌干预后其水平升高(图7A)，这与免疫组化结果一致(图7B)。更重要的是，Th2反应也部分恢复，通过ELISA和qRT-PCR检测IL-4和IL-10水平下降(图7C,D)。这些结果表明，补充乳杆菌和双歧杆菌是预防CS后代食物过敏的一个有前景的策略。

图6 益生菌减少对OVA的过敏反应。(A)通过粪便评分判断过敏性腹泻的严重程度。(B)致敏后25分钟直肠温度的变化。(C, D) OD 450测定血清中OVA特异性IgE (C)和IgG (D)的相对水平。(E) ELISA法测定回肠或血清组胺水平。对于(A)，条形代表平均值±SEM，n = 7。对于(B-E)，圆形和方形代表个体大鼠，条形代表平均值±SEM，n=7。采用双侧t检验或单因素方差分析确定统计学意义，**P＜0.01，***P＜0.001。CSO，剖腹产的后代；CSP，剖腹产与益生菌干预。

  图 7   益生菌干预逆转了食物过敏中由 CS 引起的紧密连接蛋白和 Th2 细胞因子的变 化。 (A) 回肠紧密连接蛋白 ZO-1 、 occludin 和 claudin-1 的 Western blot 分析。以 β- 肌动蛋白为内参 ( 左图 ) 。与 β- 肌动蛋白相关的紧密连接蛋白的灰度统计 ( 右图 ) ， n = 7 。 (B) ZO-1 、 occludin 和 claudin-1 蛋白免疫组化染色的代表性图像。 (C, D) ELISA 法 (C) 和 qRT-PCR 法 (D) 检测 IL-4 和 IL-10 水平 ， n = 7 。数据以平均值 ±SEM 表示，通过双侧 t 检验或单因素方差分析确定统计学意义， * P ＜ 0.05, ** P ＜ 0.01 。 CSO ，剖腹产的后代 ； CSP ，剖腹产与益生菌干预。  

讨论

CS出生的孩子在童年时期更容易发生食物过敏。健康儿童与食物过敏儿童的肠道菌群组成不同。在生命早期的关键阶段，特别是在免疫系统的成熟阶段，微生物组组成的改变与以后过敏性疾病的风险增加有关。CS导致新生儿肠道菌群的定植模式不同，因为他们不暴露于母亲阴道菌群。本研究建立了CS分娩大鼠模型，比较阴道分娩大鼠和CS分娩大鼠间OVA引起的食物过敏的严重程度致敏CS大鼠血清中OVA特异性抗体和组胺浓度明显高于VD大鼠，直肠温度下降更大，腹泻更严重。这是第一次使用CS分娩动物模型来调查食物过敏，并显示了出生方式介导的疾病严重程度的差异。以往的临床研究表明，CS可显著降低婴儿期乳杆菌和双歧杆菌的丰度。一致的是，我们的模型显示这些细菌在CS后代中直到第21天显著减少。此外，CS组中Faecalibacterium、Clostridium sensu stricto、Subdoligranulum上调，而Streptococcus、Prevotella的丰度较VD组低，这些细菌也被报道对食物过敏有重要的贡献。我们证明了CS诱导的肠道菌群组成改变与食物过敏有关。

为了探索在生命初期时补充乳杆菌和双歧杆菌是否可以改善CS大鼠的食物过敏结果，我们使用了一种广泛使用的益生菌药片，其中包括这两种细菌，以补偿它们出生后的损失。用益生菌治疗成功地逆转了CS后代的过敏症状并减少了特异性抗体。因此，我们发现添加嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的混合物逆转了CS出生对食物过敏的影响，表明肠道微生物菌群失调和食物过敏之间存在因果关系。 根据我们的发现，早期微生物干预抑制了CS诱导的食物过敏，选择的益生菌如鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)已经被发现对食物过敏具有预防和治疗作用。微生物群在食物过敏发生中的作用以及益生菌恢复微生物群落失调的确切机制在很大程度上仍然是未知的。健康肠道菌群的早期成熟有利于Th1细胞反应，而菌群的失调则促进Th1/Th2平衡向Th2反应的转变。在这种情况下，后期口服过敏原会导致Th2反应异常，从而触发食物过敏过程，即使过敏原是无害的。在致敏VD和CS大鼠之间，我们发现Th2依赖性细胞因子IL-4和IL-10的表达存在差异。此外，益生菌处理的CS大鼠Th2细胞因子水平低于CSO大鼠，表明益生菌有调节Th2细胞因子的潜力。然而，直到最近，很少有临床研究和动物模型研究特定细菌和免疫细胞因子之间的关系。为了明确特定细菌类群与过敏发展之间的关系，我们使用相关性分析来研究细菌和Th2细胞因子之间的潜在联系。在我们的食物过敏模型中，Ruminococcus、norank_f: Muribaculaceae和unclassified_f:Prevotellaceae被发现与Th2细胞因子呈正相关，并且此前有报道称瘤胃球菌属(Ruminococcus)在食物过敏的儿童中更为普遍。与VD_OVA组相比，CS_OVA组中这三种细菌的相对丰度更高。尽管unclassified_f:Prevotellaceae没有显著差异，但在OVA致敏后，益生菌处理CS组的瘤胃球菌(Ruminococcus)和norank_f: Muribaculaceae丰度明显低于CSO组。这说明益生菌干预可部分恢复CS分娩大鼠的菌群。

一些研究表明，食物过敏会损害肠道屏障的通透性。虽然有证据表明食物过敏可以降低紧密连接蛋白的表达，但在我们的研究中，只有致敏CS分娩大鼠紧密连接蛋白的表达低于非致敏的大鼠。然而，在VD大鼠中没有这种作用。这可能与不同的食物过敏原或检测方法有关(如q-RT-PCR、IHC、western blotting)。同样，我们在CS大鼠中也检测到致敏组与对照组的Chao指数、Ace指数和PCoA有显著差异，但在VD大鼠中未观察到类似的变化。添加乳杆菌和双歧杆菌可提高致敏CS大鼠紧密连接蛋白的表达水平。因此，我们得出结论，健康的肠道菌群有能力保护肠道屏障免受膳食抗原的影响，而肠道屏障功能的改变与更强的过敏反应有关，这与我们研究中观察到的更严重的临床表现和更高水平的抗体相一致。我们共同阐明了益生菌影响食物过敏发展的几个途径，包括它们通过抑制某些有害细菌、调节Th2细胞因子和逆转受损的紧密连接蛋白来调节微生物组成的能力。此外，实验和临床数据支持Th2反应在调节肠道屏障功能中的作用，这与肠道通透性的增加有关。Th2细胞如何调节紧密连接蛋白还需要进一步的研究。

综上所述，我们的研究表明，肠道菌群在CS大鼠食物过敏模型中发挥着重要作用，益生菌干预是该模型中预防食物过敏的有效策略。值得注意的是，目前CS分娩的过度使用导致了微生物群和免疫发育的改变，而某些关键物种在发育的关键阶段无疑是至关重要的。阴道播种（Vaginal seeding）是用阴道液在新生儿的肠道中植入母亲的阴道细菌，现在被认为是不安全的，因为存在有害细菌转移到新生儿的风险。饮食干预是阴道播种更安全的方法。我们的研究结果表明，当CS分娩是不可避免的措施时，肠道微生物靶向治疗的可能性。与我们的选择不一致的是，一些研究支持在婴儿期早期减少拟杆菌(Bacteroides)定植模式。因此，需要更多的临床研究，以确定益生菌是否可以降低通过CS分娩的儿童的食物过敏风险。

本研究有一定的局限性。我们比较了由生母喂养的阴道分娩幼仔和由养母喂养的CS分娩幼仔。我们没有添加交叉培养组，而是使用由其生母喂养的产道出生的大鼠作为对照组，因为在同一菌株中交叉培养对细菌群落(Shannon指数，Chao指数和绝对优势菌属的相对丰度)或免疫调节细胞因子(TNFα、IFNγ、IL-4和IL-10)在后代胃肠道的相对mRNA表达的影响很小。同样，已成功实施了非交叉培养对照，以调查由分娩方式介导的缺陷。因此，出于伦理原因，我们在当前的研究中没有纳入额外的组，以尽量减少动物的使用。此外，补充益生菌并不能完全纠正肠道菌群失调。这可能与应用的物种、使用的方法和/或干预的时间有关。母亲阴道微生物群复杂，以乳杆菌(Lactobacillus)、普雷沃氏菌(Prevotella)或Sneathia为主，婴儿出生时微生物通过皮肤、口腔黏膜和鼻腔传播。口服某些菌种的接种效果有限，这是不足为奇的。此外，预防菌群破坏的最佳益生菌补充时间尚未确定。然而，这些干预措施仍能缓解食物过敏症状，这表明益生菌补充剂有可能避免与CS相关的长期负面后果。