体外诊断7——病原微生物鉴定与药敏检测,一场没有硝烟的战争

2021
11/08

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导读

     【行业分析】之体外诊断系列,详细解读体外诊断行业及其各细分领域。本篇聚焦临床微生物检测细分领域传统检测方法,详细解读标准鉴定流程中药敏试验方法及其目前市场格局。

      根据2013年版《医疗机构临床检验项目目录》,我国医疗机构常规临床微生物检测项目共有7类,包括细菌、真菌、衣原体、支原体、梅毒螺旋体、病毒及其他检验试验,共计152项。临床微生物实验室是对病原微生物进行分离、培养和鉴定等工作的特殊场所。

      送检的样本类型包括无菌样本和非无菌样本两大类,主要取决于未感染情况下样本采集部位是否为无菌环境。无菌样本是指血液、中段尿、脑脊液、穿刺液等,非无菌样本主要指痰液、粪便、分泌物等。

一、传统微生物实验室检测方法

      目前,临床微生物实验室的标准鉴定流程包括标本采集、涂片镜检、分离培养(平板培养或血培养)、细菌鉴定(生化鉴定)、药敏试验五个步骤。该鉴定流程只适合细菌、真菌、支原体、衣原体等,不适合病毒检测。病毒检测一般采用免疫学方法、PCR方法或测序法.

传统微生物实验室检测流程

       涂片镜检:用染色液对涂片样本进行染色后镜检,分为革兰染色、抗酸染色、弱抗酸染色、荧光染色、墨汁染色、乳酸酚棉兰染色[2]。目前实验室根据涂片染色结果选择合适培养基分离培养,然后根据菌落的特征现在进行生化反应鉴定或自动化仪器鉴定或者是采用试纸法进行检测。一般情况下,血液和呼吸道标本用抗酸染色,奴卡菌用弱抗酸染色,分枝杆菌用金胺染色,真菌用荧光染色,脑脊液检查中,隐球菌用墨汁染色,真菌用乳酸酚棉兰染色。该方法的局限性在于拭子样本、粪便样本和血液样本涂片效果较差,只能粗略判断属于或疑似哪种病菌/真菌。

       分离培养:分为平板分离培养或血培养。当阳性样本出现多菌种时,需要重新采样进行分离培养及纯化培养。根据一些研究数据,患者人均送检1.9份样本[1]。该方法的局限性在于高度依赖人工;阳性率20%左右,经常需要多次培养周期长,一般需要2-3天,多次培养周期更长。

平板培养

       血培养是一种适用于无菌样本的培养方法,通常将采集的样本制备成菌液加入到培养瓶中进行培养,是脓毒症、菌血症或真菌血症最常用的培养方法。血培养的样本采集通常要求常规24小时内2-3次采血,特殊情况下(脑膜炎、骨髓炎等)需要短时间多次采集及不同部位采集,培养时间一般为12小时-7天,90%阳性样本在12h内检出。

       国内血培养的阳性检出率在10%左右[4] ,国外在10%—15%[5],相差不大,原因其一是自然界超过99%的微生物不可培养或难以培养,其二是样本中含菌量低,注射或服用抗生素等。由于血培养适用于无菌样本,因此当检测结果出现多种阳性菌,或阴性结果但有临床症状,或培养结果为特殊菌种时,需要重复培养或平板分离培养。

当平板培养或血培养出现阳性结果时,需要进行微生物鉴定。鉴定一般分为三个层次,其一为菌落形态鉴定,其二为染色镜检鉴定,其三为生化鉴定,三者联合进行结果判断。

       一般而言,生化鉴定必须选用纯培养物(单种菌液或菌落),根据微生物及其代谢产物的特定生化反应(碳水化合物代谢、氨基酸与蛋白代谢、酶学实验等)来综合判断种属,一般需要1-2天。目前国内临床上使用最广泛的是生物梅里埃的ATB细菌鉴定系统,该系统有7种试纸卡,分别针对肠杆菌,厌氧菌、链球菌、革兰氏阴性肠杆菌、革兰氏阴性非发酵菌、酵母菌、葡萄球菌,可按照菌种选择所需要的鉴定卡。每种ATB鉴定卡共32孔,其中2孔为质控,其他孔以三个孔为一组,共十组孔,每组孔的结果相加产生一个数值,十组孔共产生十个数值,组合后形成一个十位数的编码,通过对应编码可判定是细菌种属。

梅里埃ATB细菌鉴定系统

       传统药敏试验一般分为纸片扩散法(K-B实验)、稀释法、快速药敏 E-test三种方法,判定标准为最低抑菌浓度MIC值和抑菌圈直径KB值。

       纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上,纸片中的药物在琼脂中扩散,随着扩散距离的增加,抗菌药物的浓度呈对数减少,从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时,纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长,而抑菌范围外的菌株则可以生长,从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈,不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同,抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度,并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。

纸片扩散法

       稀释法药敏试验可用于定量检测待测细菌对待验证抗菌药物的抗药性或敏感性,分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时,抗菌药物的浓度通常经过倍比稀释,能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度(MIC),一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点(敏感、中介和耐药)的浓度,同时也应该包含质控参考菌株的MIC。

肉汤稀释法

       快速药敏 E-test类似于纸片扩散法。E-test试纸条是一载有抗生素连续指数梯度浓度的试纸条,将其放置在一个已均匀接种细菌的琼脂平板时,其载体上的抗菌药迅速且有效地释放入琼脂,从而在试剂条下方马上建立了一个抗菌药浓度的连续的梯度,经孵育后,当细菌的生长清晰可辨时,即可见一个以试剂条为中心的对称抑菌椭圆环。本法可用于营养要求较高、生长缓慢或需特殊培养条件的病原菌的药敏试验,如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、空肠弯曲菌和厌氧菌等,具有操作简单、结果容易判断等有点,且得到的是一个定量的MIC值。但缺点是价格较高,适用范围受限,不易普及推广。

快速药敏 E-test法

       目前国内市场上市占率最高的是生物梅里埃的VITEK2药敏自动化检测系统,该实验系统可进行细菌鉴定实验和药敏实验。药敏鉴定卡由梅里埃根据细菌的种属及抗药性结合国内医生的习惯进行设置。

       目前,微生物实验室内,传统的微生物鉴定方法还包括免疫法、qPCR法/探针法等,这两种方法的局限性在于检测项目是已知的,项目数量较少,主要针对流行病快速检测或特殊场景使用的快速检测试剂,包括HPV筛查,术前八项,肝炎,新冠,流感,艾滋,肺支/肺衣,沙眼衣原体,肠道病毒、幽门螺杆菌、结核杆菌、沙门氏菌、贺氏菌等项目。除此以外,超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)和血清淀粉样蛋白(SAA)也是目前最常用的POCT急性感染指标,用于早期感染辅助诊断。hs-CRP 和PCT用于鉴别细菌感染和病毒感染及抗生素用药指导(用还是不用),SAA用于病毒感染早期诊断,主要适用于脓毒症重症监护,五大中心,发热门诊等场景。

二、微生物检测市场现状及竞争态势

       根据头豹研究院公布的数据,2018年中国微生物检测的市场容量为56.1亿元,2014年-2018年的复合增长率为17.2%。

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关键词:
培养,染色,样本,检测,鉴定

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