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环状RNA的研究进展与产业化进程

2021

11/09

生物世界

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环状RNA的研究进展与产业化进程

撰文 | 小云

来源 | RNAScript

环状RNA的定义

1976年，Sanger等人在植物病毒中鉴定到了一类具有传染性的单链共价闭合环状RNA分子，并将其命名为环状RNA （Circular RNAs, circRNA），自此开启了非编码RNA研究的新时代。到了1991年，Nigro等人首次在哺乳动物中发现环状RNA的转录物——他们观察到来自肿瘤抑制基因DCC的RNA转录物存在 “混乱的外显子（scrambledexons） ”现象，即该基因外显子能够首尾相连形成环状结构。

尽管发现得早，但环状RNA分子由于其表达水平低、数量稀少总是被当做基因转录过程中的异常副产物，再加上传统的RNA分析方法很难对这类RNA进行检测，因此在之后的很长一段时间里环状RNA都未得到足够的重视。

直到2012年以后，得益于高通量测序技术的发明、富集环状RNA生化手段的出现以及计算方法的改进，研究人员才发现在人类、果蝇、植物、隐球菌、斑马鱼和原生动物中竟存在大量的环状RNA。

不仅如此，环状RNA相较于线性RNA在体外和体内都更加稳定，这是因为环状RNA所特有的共价闭环结构可以抵抗核酸外切酶的降解；同时，环状RNA在不同物种之间也显示出高度的保守性——例如小鼠体内有约20%的环状RNA与人类的环状RNA同源；此外，环状RNA被证实还可以参与到神经突触发育和神经细胞分化等多个物理学进程当中。可以看出，环状RNA并非是毫无用处的基因剪接副产物，相反，它们在生物体内高度稳定且具有一定的功能。

环状RNA的分类

根据高通量RNA测序结果可知，大约75%的人类基因组会被转录成RNA并产生数以百万计的RNA转录物。而且同一条信使RNA前体（precursor messenger RNA, pre-mRNA）在转录过程中若发生内含子滞留（retention）或外显子跳跃（skipping）则会产生多个不同版本的成熟mRNA，该过程被称为“选择性剪接” （alternative splicing）。

在选择性剪接过程中，当一个基因的外显子3'端（剪接供体位点，splice donor site）与同一外显子（单外显子环状RNA，single-exon circRNA）或与其相邻外显子（多外显子环状RNA，multiple-exon circRNA）的5'端结合时，都会形成共价闭合的外显子环状RNA （exon circRNA）。但是，环状RNA不仅可以从基因的外显子上产生，也可以从基因内含子、基因间隔区、非转录区上以“反向剪接” （back splicing）的方式形成闭合环状结构。

因此根据其形成的来源可以简单地将环状RNA分为以下四种类型：

①外显子环状RNA （exon circRNA, ecircRNA）（图1A）；

②外显子-内含子环状RNA （exon-introncircRNA, eIciRNA）（图1B）；

③内含子环状RNA（intronic circRNA, ciRNA）（图1C）；

④转运RNA前体 （precursor transfer RNA, pre-tRNA）剪接后形成的 tRNA内含子环状RNA （tRNAintronic circular RNAs, tricRNA）（图1D）。

图1. 环状RNA的生物合成机制（参考文献3 doi: 10.7150/thno.29678）

环状RNA的作用机制

继2012年发现环状RNA普遍存在以后，研究人员立刻针对环状RNA的功能开展了系统性研究。仅仅一年以后，有两个研究小组同时发表文章证明环状RNACDR1as可以充当“分子海绵”来作为 miRNA 的竞争性RNA分子，后续发现另外几种环状RNA也可以作为miRNA的竞争因子，进一步证实了环状RNA作为“分子海绵”的生物学功能。

miRNA是一类长度较短的非编码RNA家族，它们可以调节广泛的生物学过程，也在调控癌症相关基因表达方面发挥重要的作用——miRNA可以通过抑制下游的肿瘤抑制性mRNA来发挥作用。

图2. 大量存在于脑内的环状RNA CDR1as 参与大脑正常功能维持（注：敲除小鼠的CDR1as将导致miR-7 and miR-671下调，产生神经精神疾病。doi: 10.7150/thno.29678 ）

然而，大多数环状RNA并不包含miRNA的结合位点，因此作为miRNA的“分子海绵”作用只是环状RNA众多潜在功能中的一种。关于环状RNA分子机制的最新研究表明环状RNA还可以作为蛋白质的“分子海绵”、作为蛋白质复合物的支架、调节基因的转录和剪接以及翻译产生小肽等多种多样的生物学功能。

但是关于环状RNA存在的意义目前尚有争议，今年7月上海交通大学胥川研究员和美国密歇根大学张建之教授的研究表明环状RNA大部分源自于剪接错误，并估算出超过97%环状RNA是无用甚至有害的。

他们针对目前环状RNA研究领域的“适应性”观点——环状RNA普遍具有功能，提出了与之对立的“分子错误”假说，认为：环状RNA多数源自于RNA剪接错误，因此普遍不具有功能。但该结论与少数环状RNA被证实具有功能的事实并不矛盾，多角度地了解这一生物分子的特征将有助于人们理解各种神奇的生命现象。

环状RNA与人类疾病的联系

尽管环状RNA的生物学机制还有待进一步地挖掘，但这并不妨碍环状RNA成为治疗人类疾病的热门靶点，这是由于环状RNA与同为非编码RNA的miRNA的作用方式有一定相似之处，并且环状RNA在生物体内含量丰富且极其稳定。目前已知的与人类疾病和癌症相关的环状RNA及其功能可参见表1和表2。

表1：与人类疾病相关的环状RNA （参考文献4 doi: 10.3389/fmolb.2017.00038）

表2：与癌症相关的环状RNA （参考文献4 doi: 10.3389/fmolb.2017.00038 ）

免疫反应是指免疫系统对外源性入侵病原物的保护性反应，以维持生物体内的稳态。免疫系统可以利用不同种类的免疫细胞诱发相应的免疫应答来抵抗病毒、细菌和肿瘤等危害人体健康的因子。环状RNA最近也被认为是免疫细胞和各种免疫反应的调控者和参与者（表3）。

表3：与免疫反应相关的环状RNA （参考文献3 doi: 10.7150/thno.29678）

基于以上信息可知，对于功能较明确的环状RNA既可以作为某些疾病诊断的生物标志物，也可以作为某些重要疾病（尤其是免疫疾病和癌症）的治疗性靶点，兼具研究和应用价值。

环状RNA在疫苗上的应用

近两年来新型冠状病毒在全球大范围肆虐，且随着时间和人口密度的增加不断演变出传播力和毒性更强的新型变异株，只有疫苗才是防止这种病毒传播的最佳手段。但是在大多数情况下，基于蛋白质的传统疫苗（例如灭毒疫苗和减毒活疫苗）产能低、药效差，目前迫切需要新技术来加快大规模的疫苗开发，而基于mRNA的疫苗恰好能满足这一要求。

一旦确定了编码免疫原（例如新冠病毒的S蛋白）的基因序列，就可以通过合成的DNA模板转录成RNA，再经过修饰和脂质体包装制备出mRNA疫苗，当这段体外合成的mRNA注释入人体内，会快速激活针对病原物的免疫反应，从而抵御该病原物的入侵。

从设计抗原序列开始算起，仅需几周时间就可以制备出临床规模的mRNA疫苗。而且mRNA的生产是无细胞的，只需在体外使用容易获得的材料来进行生产。与传统疫苗相比，mRNA疫苗在安全性、有效性和生产方面均表现出无可比拟的优势。

mRNA疫苗一般分为非复制型或自我复制型（自我扩增）两类。非复制型mRNA序列短、构建难度低，不编码额外蛋白，只编码免疫原蛋白，在免疫原蛋白两侧还含有5’和3’非翻译区（UTR），以及一个由7-甲基鸟苷（m⁷G）组成的5'帽子结构和一个3’多聚腺苷酸尾巴（3’poly(A)tail）（图2a）。

而自我复制型mRNA除了包含非复制型mRNA的所有元件，还含有一个编码能自我复制的RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）（图2b）。RDRP一般来自于阿尔法病毒，如辛德比斯病毒（Sindibis virus）。自我复制型mRNA可以在体内进行大量复制产生更多抗原，从而延长mRNA疫苗的作用时效。

图2：mRNA疫苗构建信息。（参考文献5 https://doi.org/10.3390/vaccines9040390 ）

基于上述mRNA构建方式，目前由Moderna公司、辉瑞公司和BioNTech公司快速开发的高效mRNA疫苗已经充分证明了mRNA可以用来预防新型冠状病毒引起的肺炎。但这种由线性mRNA制备的疫苗仍存在一定的缺陷：一方面是线性mRNA分子的稳定性较差，极易在高温或有核酸酶的存在下降解，这也导致mRNA疫苗成品的运输和储藏成本较高（通常要保存在-20°C或-70°C条件下）;

另外，尽管自我复制型的mRNA疫苗可以大幅提高抗原产量和免疫持久度，但较大的分子量会使得此类mRNA不够稳定且生产难度增加。

体外环化RNA技术为mRNA疫苗的开发提供了一种既能稳定存在又能有效诱导免疫原产生的替代性手段 。环状RNA因其具有共价闭合环状结构而能抵抗外切核酸酶的识别和切割。

在2018年，Wesselhoeft与其合作者就报道了一种基于自我剪接型内含子（也叫I型内含子）改造而来的体外环化技术，该技术能够在体外环化各种类型mRNA，环化后的mRNA半衰期显著延长，且具有编码蛋白质的能力。

另外在mRNA序列前加入一个柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3）的内部核糖体进入位点（IRES）有利于核糖体的结合并促进环状RNA的翻译。当外源环状的RNA进入细胞，可以直接避免被细胞RNA传感器（即RIG-I）和Toll样受体（TLR）的识别而无需核苷酸修饰，从而避免引起细胞的先天性免疫反应。

此外在2021年， 北大魏文胜团队也利用同样的体外环化技术合成了针对新冠病毒及其变异株RBD（Receptor-binding domain）序列的环状mRNA疫苗（图3），并证明该疫苗可以在小鼠体内诱导强烈的T细胞免疫应答。

还有研究表明环状RNA疫苗在癌症干细胞治疗中具有潜在的应用价值。以上研究结果表明，环状RNA疫苗有希望成为一种替代性的、更为先进的mRNA疫苗。

图3：circRNA-RBD的设计模式图（参考文献2 https://doi.org/10.1101/2021.03.16.435594）

以环状RNA为核心的生物医药公司

1．Orna Therapeutics

今年2月，一家名为Orna Therapeutics的初创公司以8000万美元启动，以开发基于“oRNA”的环状RNA疗法。Orna的技术是基于麻省理工学院的丹尼尔-安德森（Dan Anderson）实验室的工作，该实验室已经发表了几篇关于环状RNA的制备和蛋白表达的文章。

Orna公司声称oRNA是RNA治疗领域的下一代革命——通过一个精细、专业的分子平台制备出的环状RNA具有容易制备、耐受性好、表达高等优秀的特性。他们还声称利用oRNA技术能够将嵌合抗原受体(CARs)直接递送到患者体内的免疫细胞中（即开发原位CAR-T疗法），从而解决当前免疫疗法的限制性。

此外，oRNAs可能意味着给病人一个较小的剂量来获得预期的治疗效果，或者应用于需要非常高的蛋白质水平的疾病治疗领域，而这些领域是基于线性RNA的治疗所不能达到的。

2．Laronde

OrnaTherapeutics并不是唯一对环状RNA疗法感兴趣的公司。今年5月，Moderna的创始者之一FlagshipPioneering公司（以下简称“FP”）新推出了Laronde公司——“Laronde”一词是法语中的“环形”（round）——用以创造一种新的环状RNA疗法，该类环状RNA又被他们命名为“无尽的RNA”（endless RNA），或简称eRNA。

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这是一种专为可翻译设计的专有闭环RNA构建体，由于无裸露的末端，先天免疫系统或核酸外切酶无法识别eRNA，使得eRNA高度稳定，延长治疗效果。凭借着孵化Moderna的光环，FP公司又为Laronde公司筹集到了4.4亿美元。

Laronde公司还设下了在未来十年内创造出100种eRNA药物的大胆目标。“这在不久之前听起来是很荒谬的，”Laronde公司首席执行官Diego Miralles承认道，“但我们已经生产出两种mRNA疫苗（线性的），在不到18个月的时间里设计、测试、批准并为数亿人使用。所以很明显，我们正在进入一个可编程药物的新世界。”

在设计eRNA序列时，该公司的科学家们也添加了IRES序列促进eRNA吸引核糖体，进而完成蛋白翻译的过程。Miralles还说，Laronde的eRNA比mRNA坚持的时间更长，可以让细胞在很长一段时间里产生治疗性的蛋白质，但又不会像基因治疗那样造成永久性的改变。不过目前该公司还没有发表或公开分享任何有eRNA的数据。

另外值得注意的是，这些环状RNA疗法都没有在人体中进行过测试，Laronde甚至还没有披露其关注的任何特定项目或疾病领域。但Miralles说，这家初创公司正在广泛考虑其eRNA可能编码的蛋白质，包括分泌的肽和蛋白质、抗体、受体、通道、酶等等。

3. 环码生物

环码生物成立于2021年，由在RNA领域深耕多年的科学家团队所创立。2021年上半年已完成由凯泰资本和杏泽资本共同领投的近千万级别美元天使轮融资，此次募集资金将用于公司全球独有的环状RNA技术平台的完善和管线推进。同时，公司宣布将有数位在载体递送、核酸工艺等方面具有资深经验的产业界人士加盟。

科学创始人王泽峰教授现任中科院营养与健康研究所教授、中科院计算生物学重点实验室主任、RNA系统生物学课题组组长，在环状RNA调控机制和工程化应用方面具备全球顶尖水平的研究成果和技术积累。公司共同创始人、CTO杨赟博士现任中科院上海营养与健康研究所副研究员，在RNA体外环化和环状RNA翻译效率调控等方面具有多年基础研究和技术开发经验。

王泽峰教授表示：“整个RNA领域在过去十年间取得了突飞猛进的进展，我们对环状RNA的认知也逐步加深。环状RNA已初步体现出许多优于线性RNA的独特优势，未来前景可期。环码生物感谢凯泰资本和杏泽资本专业而高效的支持，我们将继续在RNA前沿领域探索，早日将基于环状RNA的新药推向市场，造福全球病患。”

总结与展望

尽管环状RNA曾一度被认为是mRNA剪接过程中出现的“垃圾”序列，但现在已成为一类重要的新的非编码RNA。目前几乎所有的生物和生物医学领域都在对环状RNA开展大量的研究。

除了早期提出的作为miRNA“分子海绵”的功能，环状RNA在后续的研究中也被证实具有多种分子机制，包括调控基因的转录和翻译，调控蛋白质互作甚至可以翻译成小肽。不仅如此，环状RNA具有极高的应用价值，它们在作为诊断性生物标志物或疾病治疗靶点方面都具有极高的应用潜力。

此外，利用体外环化RNA技术可以制备针对免疫性疾病或癌症的环状RNA药物，只不过相关研究仍处于起步阶段，目前只有Orna、Laronde环码、吉瑞生物等少数研究团队在推进环状 RNA从实验室走向产业化，另外环状RNA疫苗或药物的免疫原性和安全性也需要进一步的确认。

参考文献：

1. Santer, L., Bär, C. &Thum, T. Circular RNAs, a novel class of functional RNA molecules with therapeutic perspective. Mol Ther 27, 1350–1363 (2019).

2. Qu, L. et al.Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants. Biorxiv2021.03.16.435594 (2021) doi:10.1101/2021.03.16.435594.

3. Chen, X. et al.Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics 9,588–607 (2019).

4. Greene, J. et al.Circular RNAs: Biogenesis, Function and Role in Human Diseases. FrontiersMol Biosci 4, 38 (2017).

5. Kowalzik, F. et al.mRNA-Based Vaccines. Nato Adv Sci Inst Se 9, 390 (2021).