单细胞测序技术的那些事！

什么是单细胞测序？

单细胞测序（Single-cell sequencing）是指获取单个细胞遗传信息的测序技术，即对单个细胞水平上，对基因组或转录组进行提取扩增和高通量测序分析（Figure 1）[1]。该技术能够揭示但个细胞独有的基因结构和基因表达状态，包括结构变异、拷贝数变异、RNA表达水平等数据，使不同细胞类型得以精确区分，并有助于科学家在但细胞水平进行分子机制的研究。

Figure 1. Basic steps of Single-cell sequencing technology (Source: Molecular Aspects of Medicine)

为什么要做单细胞测序？

对于多细胞生物来说，在细胞的分裂和分化过程中，必然会逐渐产生或大或小的差异，即遗传信息的异质性。例如，同一肿瘤组织中的不同细胞内涵不同基因组和转录组等遗传信息，就临床利用上而言，这种差异或能影响某种疗法对该肿瘤起到的作用。

传统的研究方法是在多细胞基础上完成检测，即一次处理成千上万个细胞。比如，当研究人员想要检测某个蛋白的表达量，常用的方法如Western Blot等，最终得到的信号值反映的其实是基因在群体细胞中的表达平均后水平，这就会导致不同细胞间表达异质性信息的丢失。但如果运用单细胞测序方法，如流式细胞术技术，在单细胞水平对荧光强度加以测定，就能完全反应同一个细胞群里不同细胞的基因组和转录组等遗传信息的状况。

单细胞测序的实现方法和里程碑

目前，单细胞测序的方法有二。

第一种，分离出单个细胞，独立构建其测序文库，并进行测序。目前用于细胞分离的代表技术包括：主要运用于细胞样品的流式细胞仪技术（Luorescence Activated Cell Sorting, FACS）以及主要运用于组织切片样品的荧光捕获显微切割（Laser Capture microdissection, LCM）等（Figure 2）[2]。这类方法简单直接，但也存在显而易见的共通缺陷：低通量，高成本——当所测单细胞数量较低时，研究结果不足以反映问题；而随着所测数量增长，测序的成本也随之呈线性提升。

Figure 2. the most commonly used technologies for the handling of single cells （Source: MDPI）[2]

第二种，基于标签（barcode）的单细胞识别，即给每个不同的细胞赋予一段独一无二的DNA序列。于后期混合测序时，可把携带相同barcode序列的核酸分子视为来自同一个细胞，从而可通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息并加以区分。显而易见，此种方法相较于前者，优势更大。

回望其发展史，第一例单细胞RNA测序是由汤富酬等人于2009年发明[3]，通过改进先前用于微阵列分析的转录组扩增方法，分析了来自小鼠四细胞胚胎阶段的单个卵裂球的转录组。在此之前，研究人员只能通过显微成像等方法，观察有限数量的细胞。自2009年首次问世，单细胞测序技术持续不断地发展，并成为一套强大的新技术，尤其是近几年，更是出现了爆发式的发展和普及，利用单细胞测序检测DNA和RNA的方法对生物学的许多不同领域产生了广泛的影响，包括微生物学、神经生物学、发育学、组织镶嵌学、免疫学和癌症研究 （Figure 3）[4]。

Figure 3. Timeline of Milestones in Single-Cell Sequencing (Source: Molecular Cell)[4]

2011 年，第一例单细胞DNA测序也随即被发明[5]，Navin等人通过应用单细胞基因组测序方法研究了两例人类乳腺癌患者的肿瘤群体的结构和进化，对100个单细胞的分析显示，证实其中一种异质性肿瘤有三个不同的克隆亚群，可能代表了连续的克隆扩增。

2013年，美国斯坦福大学（Stanford University）的William Greenleaf教授研发“利用转座酶研究染色质可进入性的高通量测序技术”（Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq）[6]，即通过利用DNA转座酶结合高通量测序技术，来测定染色体的可及性（chromatin accessibility）。

近几年来，10X Genomics、dscATAC-seq、Micro-well、Split-seq等技术也前赴后继地出现在大众视野，这些技术的诞生彻底降低了单细胞测序的成本门，从而使得高质量、高通量的scATAC-seq成为可能。但由于技术的不成熟度，很多方法还需对样品进行预处理，耗时长且质控难，如：dscATAC-seq需定制大量带有标记的Tn5 转座子；MULTI-seq需要合成特定脂修饰的核酸序列；CellHashing需通过使用通用抗体实现多样品标记，等等。

对此，在基于以往ATAC-seq技术的基础上，来自美国得克萨斯大学安德森癌症中心（The University of Texas MD Anderson Cancer Center）的Nicholas Navin教授团队发明了一种开创新的多样本标记方法，仅用未经任何特殊修饰的简单核苷酸序列就能实现单细胞ATAC-seq的多样本同时测序，并起名为SNuBar-ATAC。相关内容以Simple oligonucleotide-based multiplexing of single-cell chromatin accessibility”为题，于10月21日刊登在《分子细胞》（Molecular Cell）杂志（Figure 4）[7]。

Figure 4. Simple oligonucleotide-based multiplexing of single-cell chromatin accessibility（Source: Molecular Cell)

single nucleus barcoding approach for ATAC-seq（SNuBar-ATAC）的操作思路简单来说，即利用Tn5转座酶作为运送barcode的载体，在进行Tagmentation反应的同时便将不同的样品进行了标记。样品混合后，通过微流控系统，构建单细胞ATAC-seq文库并测序。后续通过识别每个细胞中的样品标签，即可获知每个细胞的样品来源（Figure 5）[7]。这一方法操作简便，不但准确率有所保障，且高通量。这使得大量样本同时进行有效标记并进行scATAC-seq测序成为可能。

Figure 5. Graphical abstract of SNuBar Multiplexing (Source: Molecular Cell)

结语

总体而言，随着精准治疗时代的到来，单细胞技术将在多个方面发挥它的作用，如人类细胞图谱（Human Cell Atlas，HCA）和人类癌症图谱网路（Human Tumor Atlas Network，HTAN）等大规模单细胞测序计划，以及肿瘤、免疫、微生物、神经科学等领域的应用。

参考文献：

【1】Single-cell RNA sequencing: Technical advancements and biological applications

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0098299717300535

【2】Technologies for Single-Cell Isolation

https://doi.org/10.3390/ijms160816897

【3】mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell

https://www.nature.com/articles/nmeth.1315

【4】Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.05.005.

【5】Tumour evolution inferred by single-cell sequencing

https://www.nature.com/articles/nature09807

【6】Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation

https://www.nature.com/articles/nature14590

【7】Simple oligonucleotide-based multiplexing of single-cell chromatin accessibility

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1097276521007954