【中西合璧】电针足三里三阴交对吗啡耐受小鼠脑干cAMP-CREB通路及其转录表达谱的影响

上海中医药大学附属岳阳医院麻醉科   吗啡等阿片类药物是临床上治疗中重度疼痛的常用且效果确切的药物，广泛应用于治疗癌痛等顽固性疼痛。然而，随着使用剂量的增加及时间的延长，其耐受问题也愈加明显，从一定程度上影响了此类药物的使用，探究吗啡耐受的分子机制及寻找可减轻吗啡耐受的疗法成为摆在研究人员面前的难题。针刺作为一种古老的治疗方法在疼痛治疗中显示出了其特有的优势，操作简易、疗效确切，同时，在改善吗啡耐受方面具有良好的疗效，但其相关机制仍不明确。2021年8月发表在frontiers in Neuroscience杂志的一项研究发现电针可以通过调节脑干区cAMP-CREB通路及其转录表达谱改善小鼠吗啡耐受状态，中西合璧对该文主要内容进行摘译编撰以飨读者。

研究目的   吗啡等阿片类药物的耐受问题一直以来是影响其使用的难题，如何寻找有效的方法来降低吗啡耐受是全世界范围内迫切需要解决的问题。针刺属于传统中医学的一种治疗手段，自诞生伊始就广泛用于各种疾病的治疗，在疼痛领域的应用更是针刺作用的重要方面，而且得到了包括WHO等组织的认可。针刺用于吗啡耐受的相关研究一直以来受到许多学者的关注，相关研究显示，针刺可以通过调节多种神经因子的分泌及内源性阿片途径参与吗啡耐受的调节；此外，在正常及异常情况下，吗啡都可以通过阿片受体改变细胞内信号转导体系，进而通过相关分子及信号通路改变机体对疼痛的传导及调节。已有文献证实，腺苷酸环化酶作用的cAMP-MAPK通路及CREB等转录调节因子对吗啡发挥镇痛作用及耐受起到重要的调节作用。本研究将观察电针是否可以通过上述分子及通路改善吗啡耐受。    

材料与方法   1.动物与分组：根据实验需要，将50只8周龄C57/BL6雄性小鼠随机分为5组，即：溶媒对照组（Vehicle+Sham），吗啡耐受模型对照组（Model+Sham），吗啡耐受模型+人工针刺组（Model+Sham EA）, 吗啡耐受模型+电针组（Model+EA）及吗啡耐受模型+加巴喷丁组（Model+Gabapentin）。 2.药物与剂量：吗啡溶于生理盐水，采用10 mg/kg皮下注射的方法，每天两次（上午9点和下午4点）；加巴喷丁溶于生理盐水，采用50 mg/kg腹腔注射的方法，于吗啡注射前注射加巴喷丁。 3.电针治疗：电针刺激组取双侧足三里、三阴交，采用2/100 Hz频率，0.5-1.5 mA电流，刺激30 min，连续治疗7天。人工针刺组不接电刺激，其余同电刺激组。 4.疼痛评价：热板实验：在实验第1，3，5，7天进行，采用56℃，40秒切断时间，MPE%（最大有效效应百分比）评价的方法；  甩尾实验：实验第2，4，6天进行，16秒测试时间，MPE%评价。 5.模型与电针治疗作用位点筛查：RNA Seq测序及生物信息分析。 6.生化及分子实验方法：ELISA，Western blot，qRT-PCR。 7.统计方法：Graphpad软件单/多因素方差分析（One/Two-way ANOVA）, Bonferroni post hoc test方法统计。 

结果   1.电针减轻了吗啡诱导的小鼠痛觉耐受（Fig.1,2）  

Fig.1 实验方法及流程图。A.吗啡注射时间、疼痛行为评价时间轴；B.每日实验步骤流程图；C.针刺穴位图；D.各组针刺治疗及相关参数。

Fig.2 吗啡诱导的疼痛耐受模型行为评价方法。各组在A甩尾实验、B热板实验及C剂量反应曲线中的结果统计。 

2.电针后吗啡耐受小鼠脑干相关基因表达发生改变。（Fig.3-5）

Fig.3 转录水平序列测序后各组不同基因表达统计。A.热统计图显示模型组及电针治疗组不同基因的表达变化；B.表达升高或降低相关基因统计；C.火山图显示表达升高、不变或降低基因的统计。 

Fig.4 GO相关分析（A图）及KEGG信号通路相关分析（B图）显示表达发生改变的分子及信号通路。 

Fig.5 模型及电针治疗组中表达升高最明显的5个基因（A图）及表达降低最明显的5个基因（B图）在脑干中的mRNA表达水平。

3.电针改变了吗啡耐受小鼠cAMP-PKA通路的蛋白表达（Fig.6）

Fig.6 电针对吗啡耐受小鼠脑干相关分子及通路蛋白表达的调节。A. Western blot结果显示各组PKA, CREB, ERK及其磷酸化分子蛋白表达变化；B. ELISA结果显示各组脑干中cAMP的水平；C, D, E统计结果显示各组PKA, CREB, ERK磷酸化比率变化。

讨论与小结   吗啡耐受与其剂量及使用时间有关。本研究发现， 第1天吗啡注射后镇痛效果明显，表现为甩尾实验及热板实验中潜伏期较长，而从第2天开始，与第1天相比，吗啡注射后甩尾实验及热板实验潜伏期开始缩短，注射第6天时最明显，潜伏期较前明显下降，表明吗啡出现明显耐受；而电针治疗组潜伏期下降幅度较模型组明显减少，证明电针可以改善因吗啡长时间使用后引起的耐受。此外，实验结果显示，利用甩尾及热板实验评估小鼠疼痛时，二者结果不甚相同，这种差异可能与两种方法检测的痛觉信号传导路径及部位不同有关。在临床及部分动物试验结果中，除了吗啡长期使用引起耐受外，还可能同时出现吗啡诱导的痛觉过敏现象，此次研究未发现二者同时出现，结合既往研究，可能主要与吗啡使用时间及剂量有关。 为了探究与吗啡耐受及电针治疗相关的分子位点的改变，文章采用了RNA Seq的方法筛选相关基因；此外，本文选择的部位为与痛觉信号传递、调节有关的重要部位-脑干。通过序列分析共发现了53个表达明显变化的基因位点；然后通过GO及KEGG分析法发现这些潜在基因与细胞信号转导过程、突触传递、多巴胺能神经元功能、配体门控离子通道等密切相关，这些潜在基因同时又参与到炎症相关通路TNF、IL-17、尼古丁及吗啡成瘾等过程中，而以上均与吗啡作用相关。因此，上述基因的转录表达可能参与了吗啡耐受的过程。 以往相关研究发现，ERK1/2、PKA参与了吗啡耐受的发生，CREB作为一种转录调节因子也被证明可以通过cAMP诱导而调控与吗啡耐受相关的基因转录，作为细胞内信号转导过程的关键因子，上游ERK1/2、PKA均可通过激活CREB启动转录调控。因此，上述分子及其通路可能与电针改善吗啡耐受有关，实验结果进一步证明电针可以通过改变其磷酸化而调节信号转导过程，从而通过调控靶基因转录及功能变化改善吗啡耐受。 本文利用吗啡耐受的小鼠模型，通过热板等疼痛评价方法观察了实验组及电针治疗后小鼠痛觉行为的变化，并通过转录组测序、生物信息分析等筛选出了与吗啡耐受及电针治疗相关的分子及通路，结合既往研究结果及进一步的分子生化实验进一步证实了电针可能通过cAMP-PKA/ERK-CREB通路参与了对吗啡耐受小鼠疼痛的调节（Fig.7），为进一步揭示针刺镇痛及改善吗啡耐受相关分子机制提供了思路；同时，为针刺在临床中用于吗啡耐受患者的治疗提供了理论基础。

Fig.7电针改善吗啡耐受的可能分子机制。电针可能通过降低细胞中cAMP的水平而降低对下游PKA的激活，或经MAPK通路通过降低ERK的激活，进而通过下调转录调节因子CREB的磷酸化水平影响相关基因的转录表达。

中西合璧述评 吗啡等阿片类药物耐受是其临床使用过程中遇到的一大挑战，目前，尚无有效的方法解决这一问题，通过辅助其他治疗措施或改进此类药物使用而降低其耐受问题是麻醉、疼痛及相关领域迫切需要解决的问题。本文从与吗啡耐受及电针治疗相关的基因转录谱角度入手，通过转录组序列分析的方法筛选出了与疾病发生及治疗有关的目标基因，这些潜在基因的表达及功能变化对于进一步了解吗啡耐受的分子机制提供了帮助，同时，为后续进一步深入研究打下了基础，这是本文的一大亮点。关于针刺镇痛及改善吗啡耐受是针刺研究的重要方面，然而，对于针刺的作用机制一直以来未有明确结论，本文结合既往研究发现电针可以通过重新激活因吗啡耐受而功能降低的细胞内信号转导途径来改善疼痛。这一发现进一步揭示了针刺治疗吗啡耐受的分子机制，为针刺治疗的科学化与合理性提供了理论基础。 该研究需要进一步说明的问题是，电针治疗组甩尾实验及热板实验潜伏期下降幅度较模型组明显减少的原因是电针镇痛效应与吗啡镇痛效应的叠加还是对吗啡耐受的逆转？ 

翻译：崔鹏     述评：许华

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