科研 | Microbiome:PET塑料圈内生物降解和微生物群落演替的多组学特征

2021
11/04

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微生态
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编译:微科盟鼻涕,编辑:微科盟茗溪、江舜尧。

导读  
【背景】塑料现在污染着全球的海洋环境。一旦进入这些环境中,塑料就被称为塑料圈的各种微生物群落迅速占领。塑料圈的成员具有各种各样的功能,这些功能通常存在于任何生物膜中。此外,许多海洋塑料圈研究已经声称存在塑料生物降解生物,但几乎没有机理验证。该研究从海洋塑料碎片中获得微生物群落,并分析了以不同的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)产品作为唯一碳源培养 6周期间的群落演替,并进一步表征了塑料圈中的两种细菌分离物参与聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解的机制。  
【结果】结果表明,所有群落均与接种菌群有显著差异,早期以γ-变形菌纲如AlteromonadaceaeThalassospiraceae为主,后期以Alcanivoraceae为主,整体以弧菌科(Vibrionaceae)为主。在预测的宏基因组中发现的大量参与PET降解的编码酶,以及通过FTIR分析观察到的聚合物氧化,都表明PET正在被降解。然而,由于它们被复杂的群落快速消耗,无法通过代谢组学分析检测PET水解的中间体。为了进一步证实PET在海洋塑料碎片塑料圈中的生物降解潜力,使用了蛋白质基因组学代谢组学相结合的方法来表征两种新型海洋分离物Thioclava sp. BHETI和Bacillus sp. BHET2对无定形态PET的降解。通过代谢组学鉴定PET水解中间体,证实了两株菌株均能降解PET高通量蛋白质组学研究揭示了Thioclava sp. BHET1使用了陆地环境中对应的降解途径,这表明该细菌使用的酶与之前所鉴定的酶几乎没有同源性,或者这种细菌使用了一种新的PET降解途径。  
【结论】总的来说,该研究对PET降解的多组学特性的研究结果为我们理解细菌分离物和群落对海洋塑料的降解提供了重要的一步,并证明了海洋塑料碎片塑料圈中存在的生物降解潜力。   

论文ID

 

名:A multi-OMIC characterisation of biodegradation and microbial community succession within the PET plastisphere

PET塑料圈内生物降解和微生物群落演替的多组学特征

期刊Microbiome

IF:14.650

发表时间:2021.6.21

通讯作者:Robyn J. WrightJoseph A. Christie-Oleza

通讯作者单位:英国华威大学生命科学学院

DOI号:10.1186/s40168-021-01054-5


实验设计



结果


1. PET上的微生物群落演替

在所有处理中,(i)不添加碳(对照)、(ii)无定形的PET薄膜、(iii)PET粉末、(iv)被风化的PET粉末或(v) PET单体BHET【双(2-羟基乙基)对苯二甲酸乙酯(图1)】,从海滩塑料中获得的微生物群落随着时间的推移而出现分化。虽然PET粉末具有高度的晶态构象,无定形PET和BHET单体预计更易于微生物降解。有趣的是,尽管在这种环境下对微生物生长的评估存在问题,但与无碳对照相比,风化PET粉末和非风化PET薄膜处理的DNA提取量随着时间的推移显著增加(图S1)。通过16S rRNA基因测序,对接种物和6周孵化期内(即第1、3、7、14、21、30、42天)五种处理的细菌群落结构进行评估,包括对无定形PET膜生长的浮游生物和生物膜群落的单独分析。由于读长序列较少(<1000),仅删除了2个样品(第42天无定形PET生物膜重复2次,第42天PET粉末重复1次)和程序控制(即DNA提取和PCR阴性对照)。所有其他样本的读长至少为4000,平均读长为每个样本19,000,在所有样本中共检测到18,114个扩增子序列变异(ASVs)。

 

图1. 暴露于PET和PET衍生底物所导致的微生物群落变异。(a)nMDS图展示16S rRNA基因群落间的Bray-Curtis距离。每一种处理都用不同的记号和颜色来表示。标记颜色强度表示孵育时间(较深的颜色表示以后的采样点)。生物重复(n=3)分别展示,省略号表示每个处理的平均值加标准偏差。(b)基于对数变换绝对丰度的主响应曲线冗余分析。总结了所有处理相对于无碳对照随时间的变化(相当于y=0),并确定了导致处理之间差异的最大ASV。只显示log丰度之和大于100的ASV(关于这些ASV的进一步信息见表S2)。贡献大于1的ASV促进了对照群落和具有正效应的群落(即非定形PET生物膜和浮游群落)之间的差异,而贡献小于1的ASV促进了对照群落和具有负效应的群落之间的差异。(c)热图显示随时间绘制的PRC分析中确定的所有ASV的标准化相对丰度。热图右边的黑色圆圈表示ASV在所有条件下的最大相对丰度(也显示在分类学分类旁边的括号中)。

 

2. 不同处理间微生物群落差异

γ变形菌门(Gammaproteobacteria)在所有样品中占主导地位(相对丰度>60%; 图S2),这主要是由于弧菌科(Vibrionaceae)在所有时间点上以及交替单胞菌科(Alteromonadaceae)(如ASV2,最大丰度25%)和海螺菌科(Thalassospiraceae)(如ASV18,最大丰度9%)在早期阶段和食碱菌科(Alcanivoraceae)(如ASV8,最大丰度15%)在后期阶段在除BHET外的其他所有处理的优势(图1和图S2)。所有群落均有显著差异(图1a和表S1;ANOSIM R=0.885,p=0.001),且差异小于接种物(图S3),但非定形PET生物膜和BHET处理与所有其他群落的差异最为显著(ANOSIM R=0.709,p=0.001;R=0.446,p = 0.001;图la和表S1)。这可能是因为与其他处理相比,基质的可用性更高。主响应曲线冗余分析(PRC)用于识别导致这些群落差异的ASV(即权重高于或低于1)或有助于相似性(即权重接近1)(图1b)。有趣的是,许多导致非定形PET生物膜与无碳对照处理之间差异的ASV在BHET处理中并不存在,或仅以非常低的相对丰度存在,反之亦然(图1c;表S2)。随着时间的推移,无定形PET薄膜周围的浮游生物群落变得更类似于无碳对照的群落,这可能是由于随着材料上成熟的生物膜的发展,它们对PET基质的获取减少。另一方面,随着时间的推移,PET和风化的PET粉末群落逐渐脱离无碳对照群落,这表明晶体-PET降解和基质可用性可能增加,这也得到了群落中PETases增加的支持。

 
3. 类PET底物诱导的群落演替
在BHET和非定形PET薄膜存在的情况下,微生物群落的明显差异表明,可用的基质(即BHET单体和来自低结晶度/非定形PET薄膜的可用PET链)的存在可能选择了不同的生物降解微生物。为了进一步鉴定这些微生物群,ASV被定义为早期、中期或晚期定植体,取决于它们是否在第1-7、14-30或42天时达到丰度峰值(图2)。其中,对每个处理都单独进行,只有当ASVs在该处理的至少一个时间点的丰度高于0.5%时才被纳入。总的来说,该分析鉴定了77个ASV,其中一些显示了明显的早期(n=24)、中期(n=15)或晚期(n=2)定居模式,还揭示了一些ASV(n=42)仅在一种情况下富集。有趣的是,与无碳对照相比,ASV导致了非定形PET生物膜(PRC分析贡献效应>2)或BHET处理(贡献效应<0.9;见图1b)的群落分化,早期和中期定殖者占主导地位,尽管这些ASV在其他处理中也存在(图2;表S3)。在图中1b的PRC分析中,其他数量丰富但对群落分化没有贡献的ASV(即权重接近1)通常是中晚期的殖民者,或不同处理之间的差异(图2)。这可能表明,无定形PET生物膜和BHET微生物群落的可利用底物,最初对能够降解它们的微生物进行选择,在培养1周后耗尽。底物耗竭后,群落经历的演替过程类似于其他基质可用性降低的处理。奇怪的是,PET的热风化没有产生一个明显的增加PET衍生基材的可用性。PET是一种高耐热的高分子聚合材料,因此,在经过9个月热风化后,用傅里叶变换红外光谱(FTIR)仅观察到很小的(但显著;两个独立样本 T 检验 p<0.05)化学变化(80℃培养;图S4)。具体来说,参考波长1410 cm-1(I1410)与C=O (I1711/I1410)和C-O (I1240/I1410)羧酸键、C-O (I1090/I1410)酯键和C-H(I725/I1410)芳香键对应的波数之间的比值略有增加(图S4)。这种低热氧化和风化产生的低聚PET可以解释在这些处理中观察到的风化和非风化PET粉末的群落(表S1和图1)和定植动态之间的高度相似性(图2)。这与其他热氧化时释放大量的碳的塑料材料一致,如聚乙烯,这是已知诱导生长的独特微生物群落殖民地的早期阶段。

 

图2. PET和PET衍生底物早期、中期和晚期定殖者的定殖动力学。热图展示标准化ASV相对丰度在(a) BHET、(b)无定形PET生物膜,(c)浮游的无定形PET,(d) PET粉末,(e)风化的PET粉末和(f)无碳对照处理随着时间的微生物群落变化。值为三个独立重复的平均丰度,所有丰度值归一化为每个ASV内的最大丰度。代表了至少一个时间点内平均相对丰度大于0.5%的所有ASV。在第1-7、14-30和42天丰度最高的ASV分别被划分为早期、中期和晚期殖民者,ASV按其最高丰度的平均日排列。图中右侧的颜色和字母表示了物种的ASV分类顺序。“其他”表示未在目水平分类的ASV。ASV驱动BHET的群落变异性(PRC效应值小于0.9;图1b)或无定形PET生物膜(PRC效应值大于2)处理分别用橙色或粉色框表示,黑色背景表示预测具有PETases的ASV(见下文)。表S3显示了这些ASV的详细信息,包括完整的分类法分类。

 

4. 从海洋塑料圈中分离PET降解微生物

从塑料圈中分离出PET降解微生物,进一步证实了海洋塑料碎片上现存的生物降解潜力,并表征了其代谢途径。我们使用PET粉末和BHET的混合物对微生物进行富集,分离出了在以BHET为唯一碳源的琼脂平板上生长的两种细菌。通过16S rRNA基因对其进行部分测序,鉴定为Thioclava dalianensis(99% 相似性)和Bacillus aquimaris(99% 相似性)(以下简称Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2)并且进一步选择蛋白质基因组学和代谢组学描述。他们的基因组序列显示,Thioclava sp. BHETI的基因组大小为7.66 Mb,编码序列7568条,GC含量为63.26%;Bacillus sp. BHET2的基因组大小为4.23 Mb,编码序列4368条,GC含量为40.97%(表S4)。

 
5. 分离出的Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2在海洋塑料圈及全球海洋中的分布
我们在PET群落培养、我们最近的整合(meta)分析和全球海洋调查在内的所有海洋塑料圈群落样本中寻找与这两种分离物相匹配的序列。正如预期的那样,我们在PET群落培养中发现了与两个分离物相匹配的序列,在接种物(0.42%)和无定形PET生物膜(第7天0.08%)中丰度最高的分别是Thioclava sp. BHET1(图3a)和Bacillus sp. BHET2(图3d)。有趣的是,当在全球可用的塑料圈研究中探索这两种分离物的丰度时,它们都主要出现在来自东北大西洋和地中海的塑料上(图3b和e),Thioclava sp. BHETI在一个未知类型的塑料样品中达到4.4%的最大相对丰度(>99%的同一性)(图3c),而Bacillus sp. BHETI在一个PVC样品中达到6.8%的最大相对丰度(99%的同一性)(图3f)。在塔拉海洋 (Tara Oceans)数据集中,世界各地的浮游海洋群落中,没有任何一个序列的同一性超过99%,尽管与两个分离株的同一性为>97%的序列广泛分布(图S5)。序列匹配(97%相似性)的Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2在表层水域,已到达丰度最大值分别为2.91%和0.03%,在深水水域,丰度最大值分别为1.20%和0.03%(图S5)。因此,虽然这两种分离似乎盛行于海洋塑料圈,他们在浮游微生物组中可能是罕见的。Thioclava sp. BHETI和Bacillus sp. BHET2肯定不是微生物群落中唯一进行PET降解的分类群,如下所示,关键的PET生物降解中间产物在这些培养的环境中积累,PET代谢可能是由微生物群落更有效执行的任务

 

图3. Thioclava sp. BHET1(a-c)和Bacillus sp. BHET2(d-f)在最近的塑料球整合分析或群落演替实验样本中的分布。每个Thioclava sp. BHET1或Bacillus sp. BHET2 16 s rRNA基因共享超过97%或99%以上的ASV对所有匹配的相对丰度进行总结,得出这里显示的丰度,蓝色表示相对丰度0%和黄色表示相对丰度3%以上。a和d显示了PET演替实验中总的相对丰度。b和e为各位置塑料球样品中总相对丰度最高的样品。c和f表示不同塑料或其他样品的相对丰度。每个彩色点代表在一个单独的样品中相对丰度的总和,而黑色标记显示每种塑料或样品类型的平均值。浮游Tara海洋数据集中类似Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2的ASV丰度见图S5。

 

6. 分离出的Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2对PET的降解

PET已知通过初始水解(通过PET水解酶,或PETase)降解为PET低聚物BHET,单(2-羟基乙基)对苯二甲酸(MHET),对苯二甲酸和乙二醇。MHET可以被MHET水解酶作用,产生乙二醇和对苯二甲酸,尽管PETases也可对BHET和MHET表现出水解活性。乙二醇代谢通常通过转化为乙醛和醋酸或生成乙醛酸,而对苯二甲酸通常通过双加氧酶代谢为原儿茶酸。利用已知的PETase序列构建的隐马尔可夫模型(HMM)对两个分离株的基因组进行了搜索,以寻找可能参与PET水解的PETase(表S5),如Danso等人揭示了Thioclava sp. BHETI中高于阈值的七种酶和Bacillus sp. BHET2的四种酶(表S6)。有趣的是,虽然Thioclava sp. BHET1的基因组编码PET中间降解的典型分解代谢途径(例如对苯二甲酸降解),但在Bacillus sp. BHET2中却没有发现这些途径(表S4)。

全面的蛋白质组学(即细菌分离物;表S7和S8)和代谢组学分析(即细菌分离物和微生物群落;表S9和S10),以进一步确定海洋微生物用于分解PET及其中间体的机制。

 

7. 两种海洋分离物PET降解的蛋白质组学分析

两种新的海洋分离物,Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2,与不稳定底物果糖(图S6)、无定形PET薄膜、BHET和对苯二甲酸形成完整的细胞和细胞外蛋白质组学分析将有助于阐明PET底物诱导的途径和酶。

Thioclava sp. BHETI中,蛋白质组学数据表明,编码序列(CDS)为0051的酯酶是参与PET解聚的酶,相对于果糖阳性对照,在PET及其衍生物(即 BHET 和对苯二甲酸)的存在下,酯酶略有增加(图4)。通过HMM分析(表S6),该酶被强调为的PETase,预计会被分泌,并包含有酯酶特征的α / β水解酶折叠结构域。在Thioclava sp. BHETI基因组中未发现与I. sakaiensis MHETase相似的酶;然而,羧酸酯酶(CDS 1741)可能也能进行这种水解,在PET、BHET和对苯二甲酸细胞蛋白质组中含量分别是前者的2.1倍、3.5倍和2.3倍。与阳性对照相比,也有一些三部分ATP独立的周质(TRAP)转运蛋白在所有处理中均上调(表S11),这些转运蛋白可能参与PET降解产物的运输,即乙二醇和对苯二甲酸,并且进入细胞。

正如预期的那样,BHET处理下在Thioclava sp. BHET1中检测到更多参与乙二醇分解代谢的酶(编码为CDSs 0884,0999和0538;图4)。特别是乙醛脱氢酶(编码为CDS 0999)-乙醛转化为醋酸的必要条件-在细胞蛋白质组中非常丰富,在BHET和PET处理中分别代表3.33%和1.42%的相对丰度。

另一种PET生物降解产物对苯二甲酸通常转化为原儿茶酸进行降解。在这种情况下,在蛋白质组中未检测到具有这些功能注释的Thioclava sp. BHETI蛋白(即2867-2870基因簇编码的蛋白tphAl、tphA2、tphA3tphB;表S4)(表S8)。对苯二甲酸向原儿茶酸(protocatechuate)的转换更有可能由其他对苯二甲酸乙二醇酯加双氧酶(1142 – 1143)催化,尤其是由对苯二甲酸的存在引起(图4)。原儿茶酸(protocatechuate)预计会通过3-氧代己二酸-烯醇-内酯进入β-酮己二酸途径,尽管同样没有检测到预期的酶(即由1124-1125编码pcaG和pcaH基因调控的原儿茶酸3,4-双加氧酶),或者由于 PET 降解产物的存在没有特别诱导。有趣的是,尽管如此,正如Hara等人先前假设的一样,原茶儿酚 1,2-双加氧酶(即由 1817 编码的catA;与对照相比,对苯二甲酸处理增加了8000倍以上)和粘康酸环异构酶(即由 1816 编码的catB;增加57倍)的高诱导可能表明原儿茶酸可能通过原茶儿酚降解(图4)。然而,在Thioclava sp. BHET1中缺乏特定的原儿茶酸(protocatechuate)提出了catA和类catB酶是否可以直接影响原儿茶酚的问题。奇怪的是,PET和PET的子产品BHET和对苯二甲酸似乎也共同诱导苯乙酸的厌氧降解的所有酶(即通过苯乙酰辅酶A和其他中间体合成乙酰辅酶A;由基因簇编码 1572-1593;表S8),以及一些用于好氧苯乙酸降解的酶(即通过尿黑酸和其他中间体生成富马酸盐和乙酰乙酸盐;基因簇2777-2782)。

我们的蛋白质基因组分析无法确定Bacillus sp. BHET2代谢PET产品的途径。对于Bacillus sp. BHET2,Prokka和BlastKOALA的基因组注释(Blast,基本的局部对齐搜索工具;KEGG,京都基因和基因组百科全书;KOALA、KEGG Orthology 和 Links 注释)以及随后使用已知的对苯二甲酸和原儿茶酸降解蛋白进行的局部 BLAST 搜索未发现任何具有显着同源性的蛋白质。然而,PET处理似乎确实诱导了大量通常参与外来生物降解的蛋白质,如细胞色素C氧化酶和单加氧酶(表S12),与对照组相比,PET、BHET和对苯二甲酸处理上调了这些蛋白质,如细胞色素C氧化酶和单加氧酶(果糖)。再加上下图所示的代谢组学分析(图4),表明这些PET化合物正在被降解,但可能使用的酶与之前描述的酶没有多少同源性,或者通过目前未知的途径,需要进一步的鉴定。


 图4. 通过蛋白质组学和代谢组学分析,提出了Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2降解PET、BHET和对苯二甲酸(TPA)的途径。此外,还包括I. sakaiensis代谢组学数据和群落培养分析。初始底物显示在带有白色文本的黑盒子中,以及所有底物和中间物的化学结构。涉及多个步骤的路径用灰色框表示。代谢组学在每个处理(蓝到绿颜色刻度;处理PET, BHET和对苯二甲酸,如盒子的左边所示)中检测到的底物由每个菌株(即Thioclava sp. BHET1, ‘Thio’; Bacillus sp. BHET2, ‘Baci’, Ideonella sakaiensis, ‘Ideo’ , ‘Comm’)和阴性对照(无微生物接种培养的底物)之间的倍数变化来表示。粗体值表示显著的变化(两个独立的样本T检验;p < 0.05)。通过高通量蛋白质组学检测到的每一步催化酶,表明在每个条件(PET, BHET和对苯二甲酸)和不稳定对照(即与果糖生长)之间的倍数变化。仅显示来自Thioclava sp. BHET1的酶,无法确定Bacillus sp. BHET2所使用的途径。未对I. sakaiensis进行蛋白质组学分析。

 

8. 根据群落宏基因组预测PET的生物降解潜力

在确定了Thioclava sp. BHET1中PET降解的典型和替代途径后,我们使用PICRUSt2来确定它们在群落中的预测丰度(图5)。PICRUSt2使用的默认数据库对联合基因组研究所(JGI)集成微生物基因组(IMG)数据库中包含的20,000个基因组使用KEGG同源注释。所用的版本不包含PETase的KEGG同源物(即K21104),因此,我们使用上面构建的PETase HMM来确定JGI基因组中PETase的丰度(详细信息见方法部分)。使用默认的HMM阈值(0.01),416个JGl基因组预测包含至少一个PETase,通过选择更严格的阈值(1×10-4;表S13A),将其减少到370个基因组。加权最近排序分类单元指数(NSTI)介于0.03(浮游无定形PET样品)和0.1(接种物)之间,中位数为0.05(表S14),这表明这些预测预计具有可接受的准确性,尽管我们确实注意到这些不是真正的宏基因组,因此需要谨慎对待这些结果。

预测的宏基因组显示有156个ASV(总计18,114个ASV)可能编码一种类PETase的酶,其中130个在PET或风化的PET粉末处理中含量最高。我们检查了与每一个ASV(包含PETases)最接近的JGI基因组匹配,发现它们都与七个基因组中的其中一个相似:(i)Thalassolituus oleivorans R6-15(海洋螺旋体;2 个拷贝;5 个 ASV);(ii)Lenzea violacea DSM 44796(放线菌;3 个拷贝;5 个 ASV);(iii)Lenzea flaviverrucosa CGMCC 4.578(放线菌;2 个拷贝;1 个 ASV,在 DNA 提取对照中丰度最高);(iv)Pseudomonas aestusnigri VGX014(假单胞菌;2 个拷贝;127 个 ASV,其中 123 个在 PET 或风化 PET 粉末处理中丰度最高);(v)Loktanella atrilutea DSM 29326(红杆菌目;1 个拷贝;16 个 ASV);(vi)Plantactinospora sp. CNZ320(小单孢菌;1 个拷贝;1 个 ASV,在 DNA 提取对照中丰度最高);和(vii)Oleibacter sp. HI0075(海洋螺旋体;5 个拷贝;1 个 ASV,最高大量存在于无定形 PET 生物膜样品中)。这些PETases都通过国家生物技术信息中心(NCBI)的保守域搜索进行了进一步的手工验证;在这些预测的PETases中发现的最主要的是超级自水解酶家族(11 PETases)、PldB 家族(3 PETases)或者DAP2家族(2 PETases),通常分别存在于水解酶、溶血磷脂酶或二肽基氨基肽酶中(表S13B)。在156个被预测含有PETases的ASV中,只有3个ASV的丰度在任何时间点都超过0.5%(都与Pseudomonas aestusnigri VGX014相似):ASV20(假单胞菌,2个拷贝,最大丰度7.4%,NSTI 0.002),ASV43(氮单胞菌,2个拷贝,最大丰度3.6%,NSTI 0.035)和ASV98(假单胞菌,2个拷贝,最大丰度0.9%,NSTI 0.025;被NCBI BLAST分类)。这三种ASV都是中晚期的殖民者,奇怪的是,它们只在PET和风化的PET粉末处理中丰富(图2和5)。因此,虽然已知的类PETase酶在所有其他处理的微生物群落成员中被鉴定为<0.5%,但PET和风化的PET粉末都显示出显著丰富的细菌编码这些酶之一,到培养结束时达到微生物群落的20-25%(即每4或5个细菌就有1个基因拷贝;图5)。目前已知的确认的MHETases只有三种(即负责MHET转化为对苯二甲酸),乙二醇转化为乙醛酸的初始转化是由具有广泛特异性的脱氢酶催化的,因此,这些基因没有被包括在本次分析中。

参与对苯二甲酸转化为原儿茶酸的酶(即对苯二甲酸1,2-双加氧酶)通过使用已知对苯二甲酸降解基因的HMM进行预测,如上所述的PETases。tphA2和tphA3基因表现出在PET和风化的PET粉末处理中,以及在无碳对照中,随着时间的推移,丰度普遍下降(图5)。这些酶只有在PET或BHET最初转化为对苯二甲酸后才有用,因此,我们预计在PET处理中,它们的丰度模式将遵循PETases的模式,即随着时间的推移,丰度会增加。有可能PET被水解的速度太慢,无法对对苯二甲酸降解基因的丰度产生影响。然而,值得注意的是,在无定形PET和BHET存在的情况下,生物膜中tphB的丰度很高,这可能是因为对苯二甲酸在这些处理中最为有效(图5)。有趣的是,在Thioclava sp. BHET1中通过蛋白质组学检测到的替代途径,用于对苯二甲酸降解的BHET1,即基因 1142-1143(图4),遵循与tphB(图S7)相似的丰度模式,可能值得进一步进行生化表征以确认本研究中给出的功能假设。

参与催化原儿茶酸生成β-酮己二酸途径的大量基因,即基因pcaGpcaH在BHET处理中非常丰富(图5),因为这种底物可能比PET更容易获得。我们还探讨了通过儿茶酚降解原儿茶酚的替代途径,即儿茶酚双加氧酶基因catA和catB的丰度,因为它在Thioclava sp. BHET1的蛋白质组中具有很强的诱导作用。在这种情况下,与群落接种物中catAcatB的丰度相比,几乎所有处理中catAcatB的丰度都随时间减少(图S7)。我们还分析了苯戊酸酯降解基因的丰度,这一通路似乎是由Thioclava sp. BHET1中PET子产物的存在共同调控的,观察到在无定形PET生物膜处理中,所有基因paaABCDEGJKZ的丰度都持续增加(图S7)。

虽然Bacillus sp. BHET2不编码任何已知的用于对苯二甲酸酯生物降解的酶,但当暴露于PET底物时,其蛋白质组中有相当数量的氧化酶和单加氧酶上调。尽管这些都是非常普通的酶,我们分析了每个菌群中的单加氧酶和双加氧酶的丰度,发现在预测的宏基因组中,平均每个细菌有一个以上的双加氧酶和单加氧酶基因拷贝(图S7)。因此,无法分析Bacillus sp. BHET2的生物降解途径在群落内的分布

 

图5. 随着时间的推移,在PICRUSt2中组装的所有群落的宏基因组中预测了丰富的PET降解途径基因。(a)与无碳对照相比,PET降解途径在处理中显示KEGG同源性的倍数变化;(b)每个KEGG同源物在PET降解中的分类学贡献。所显示的分类学贡献是按每个分类单元的相对丰度以及该分类单元所拥有的基因拷贝数进行缩放的。所有总贡献低于0.5%的类群归为“其他”类群。所显示的所有倍数变化和相对丰度都是三个生物学重复的平均(n=3)。单个ASV见表S2,预测的PETases见表S13,所有时间点的NSTI值见表S14。图S7显示了Thioclava sp. BHET1蛋白组学分析显示的潜在替代PET降解途径的预测基因丰度。

 

9. 分离物和群落对PET降解的代谢组学评估

PET降解中间体的检测和这些代谢物在培养上清液中的积累是PET降解的最明显证据,而且还标志着细菌的生物降解潜力可能效率较低的瓶颈(图4)。对我们新分离的海洋菌株Thioclava sp. BHETI和Bacillus sp. BHET2以及陆生PET降解菌I. sakaiensis的上清液进行非靶向代谢组学研究,并与无定形PET膜BHET、对苯二甲酸和果糖培养。以未接种底物作为阴性对照,我们还在第42天对每个群落进行了非靶向代谢组学分析,以确定PET降解产物。

代谢组学分析证实,三种细菌以及BHET培养的微生物群落(即与BHET培养42天的菌群)都能够水解BHET,因为它们与没有细菌的对照组比较,显著积累了MHET (Thioclava sp. BHETI和BHET群落)、对苯二甲酸(Bacillus sp. BHETI)或两者都积累了(I. sakaiensis)(图4和表S9和S10)。此外,两个潜在的氧化衍生物BHET(C12H12O6和C12H12O7)的离子也在Thioclava sp. BHET1和I. sakaiensis培养物中积累,即C12H12O6和C12H12O7,其中第一个也在与BHET培养的微生物群落的接种物中被确定(图4,表S9和S10)。BHET 的这些氧化衍生物似乎仅在该底物过量时才会发生,因为它们在 PET 处理中未检测到,并且可以通过氧化酶、氧化还原酶或脱氢酶进行,其中许多在Thioclava sp. BHET1 蛋白质组中被检测到。最有趣的是,在PET培养期间,BHET在Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2中积累(即分别比对照高22倍和2.6倍;图4和表S9)。在与I. sakaiensis培养中,BHET 在 PET 处理中也积累(比对照高1.88倍),尽管这种积累没有统计学意义。

奇怪的是,在有聚合PET存在的群落接种物中,没有观察到PET降解子产物。PET子产物可能没有被观察到,因为PET水解发生的速率低于微生物群落对这些低聚物的同化,因此,没有可测量的这些代谢中间体的积累。这也可以解释在无定形PET薄膜条件下生物膜与浮游微生物群落之间的强烈差异(图1和图2),降解中间体可能在接近塑料表面的地方迅速消耗,浮游生物群落无法获得。因此,由于缺乏PET降解中间体,在代谢组学NMDS图中,只有BHET处理的上清液与其他所有条件的上清液分开分组就不足为奇了(图S8)。Thioclava sp. BHET1在暴露于PET的培养物中大量积累的降解中间体BHET表明,虽然它能够PET水解,但它在使用BHET方面不如群落那么有效。当三种细菌与对苯二甲酸培养时,没有检测到降解中间体,这表明(i)当没有其他碳源存在时,对苯二甲酸的毒性限制了这种化合物的降解,正如我们之前发现的邻苯二甲酸;或者(ii)对苯二甲酸的降解途径没有产生在培养上清液中可检测到的中间产物积累的瓶颈

 
10. PET表面氧化

考虑到PET存在时不同的蛋白质组学反应和PET水解产物的代谢组学检测(图4),我们进行了一个额外的实验,以确定经过我们的海洋分离物培养后的非定形PET表面修饰(即Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2),微生物群落(即用于定位PET群落演替实验的群落)和对照不接种微生物的培养。在这个附加的实验中,我们将非定形PET孵育5个月,然后使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量关键氧化峰的吸光度。在这些关键氧化峰处,FTIR测量的吸光度增加表明PET聚合物链水解,从而暴露出更多的官能团,特别是导致(i) C-O和C-O羧酸端基数量增加(分别增加I1711和I1240);(ii)芳香环的C-H弯曲(I725增加);(iii)C-O酯基数量增加(增加I1090)。峰变化的指数用与C-H弯曲和C-C环拉伸相对应的不变峰值进行归一化,如Donelli等人。两种分离物都显著氧化了无定形的PET表面(图6),但Bacillus sp. BHET2产生的氧化显著增加与蛋白质组学检测到的大量细胞色素C氧化酶和氧合酶进行的非特异性氧化是一致的。这也可以解释Thioclava sp. BHET1产生了大量的降解积累,Bacillus sp. BHET2可能产生除BHET以外的多种低聚中间体。与群落一起的培养产生了PET表面氧化的轻微增加,尽管这在统计学上并不显著(图6)。

 

图6. 微生物分离物和群落修饰无定形PET薄膜表面的能力。(a)展示了傅里叶变换红外光谱(FTIR);(b)展示了参考波数1410 cm−1与羧酸键C=O和C-O(I1711/I1410和I1240/ I1410)之间的吸光度比、芳香键C-H (I725/I1410)和酯键C-O (I1090/I1410)。在绘制和计算比率之前,FTIR光谱被平滑和归一化。FTIR谱线代表三个生物重复的平均值,柱和误差柱分别代表三个生物重复的平均值和标准差。星号表示微生物处理与不接种对照的两项独立样本T检验的显著结果(p<0.05)。

 

讨论


不同类型PET基质培养6周的微生物群落演替,以及两个新的海洋分离株Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2的多组学分析证明了海洋塑料圈中存在的塑料生物降解潜力。我们通过代谢组学和蛋白质基因组学分析证实,Thioclava sp. BHET1通过初始水解降解PET,生成单体,主要是BHET。虽然通过比较基因组学和蛋白质组学在Thioclava sp. BHET1中检测到了类似PETase的候选酶,但值得注意的是,这种酶与Danso等人鉴定的之前的PETase的同源性低得多,因此,进一步的生化测试需要确认其PET水解活性。BHET(和MHET)的酯分支被移除,生成对苯二甲酸和乙二醇,这两种物质在细胞内运输并分解,如图4所示。通过蛋白质组学分析,发现了一些由PET产物诱导的替代酶,这些酶可能参与了它们的生物降解,这是基因组筛选所没有预料到的。这些酶的诱导(图4),以及苯乙酸分解代谢途径的共诱导,需要进一步的工作确认它们是催化这些反应还是仅仅由一个共同的相互作用引起的。加氧酶通常参与大多数芳烃的退化,如对苯二甲酸和原儿茶酸以及潜在的进一步的中间体苯邻二酚(图4)。这些加氧酶往往是丰富的海洋环境以及海洋塑料,并且,我们发现它们在来自群落的PICRUSt2预测宏基因组中大量存在(图S7)。这表明,PETases虽然是能够水解PET的酶,但通常存在相对较低的丰度,参与PET降解副产物代谢的酶可能在海洋环境中分布更为广泛。虽然我们倾向于将酶分配给非常特定的底物,但一些加氧酶可能显示更广泛的底物特异性并不是新的,特别是那些具有较大催化囊的酶。因此,本研究中鉴定的酶是进一步评价底物特异性的极好候选酶。虽然FTIR和代谢组学结果表明,无定形PET和BHET正在被降解,但尚未确定Bacillus sp. BHET2降解对苯二甲酸的代谢途径(图4和6)。在该菌株的蛋白质组中检测到大量的细胞色素C氧化酶和未定义的单加氧酶,这表明该细菌使用一种尚未确定的降解PET的途径。

Thioclava sp. BHET1和Bacillus sp. BHET2以前曾被发现是海洋环境中塑料的定植者,我们证实两者都存在于海洋塑料圈生物膜中(图3)。Thioclava spp.也被发现是原油的有效降解剂,而Bacillus sp. BHET2在陆生环境中降解PET和在海洋环境中降解PE也曾被报道过。Sudhakar等研究表明,经过热预处理的PE上生长速度更高,这也表明,芽孢杆菌要降解PE,必须经过初始的非生物氧化步骤。正如我们最近详细讨论的,非生物降解可能是许多塑料生物降解的先决条件,特别是对于主干中不含杂原子的塑料,如PE和PP。PE、PP、PS和PET的这种非生物降解产物是具有氧化端基的低分子量化合物,其结构与BHET、MHET和对苯二甲酸相似。奇怪的是,虽然PET粉末经过热预处理后,FTIR光谱中羧酸端基增加,吸光度比增加(风化PET粉;图S4),这并没有导致风化和非风化PET粉体上生长的微生物群落有很大差异(图1,2和S7)。此外,PET的结晶度决定了降解的容易程度,这意味着这里使用的结晶度高的PET粉末(>40%)由于缺乏可被微生物攻击的链可及性,更难以降解。PET也具有很高的热稳定性,这意味着我们用于人工风化的热处理效果可能不如其他材料的效果,比如我们之前观察到的聚乙烯。最有趣的是,Bacillus sp. BHET2对无定形PET表面产生了强烈的氧化作用(图6),因此,证明微生物产生的胞外活性氧可能是难降解聚合物的有效引发剂。

通常,在海洋环境中的颗粒表面,微生物群落演替导致颗粒基质降解物最初占据主导地位,这对天然颗粒和聚合物以及海洋塑料都是如此。通常情况下,这种成功发生在目的分类水平上,但在我们6周的演替实验中,γ变形菌门在所有时间点上占群落的70-80%,仅在较低的分类水平上观察到演替(图1和图2)。交替单胞菌科(Alteromonadaceae)和海螺菌科(Thalassospiraceae)在早期较为丰富,在后期Alcanivoraceae较丰富,Vibrionaceae占主导地位。有趣的是,一个ASV(ASV1),与两种弧菌均有99%的16S rRNA基因同源性副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)约占所有群落的20-40%。使用的培养液是从威尔士波斯考尔(Wales Porthcawl)海滩塑料中收集的,靠近一个污水处理厂,这可以解释弧菌属无论是在接种物中还是在所有时间点的所有样本中占据优势(图1,2和S2),强调了这些潜在致病微生物一旦寄生在塑料表面,就会持续存在。之前的一些研究已经发现弧菌在一些海洋塑料上的丰度很高,而另一些研究调查了弧菌在海洋塑料上的存在作为潜在的致病性微生物附带者。然而,正如我们和其他人之前强调的那样,弧菌并不只存在于塑料上;此前有报道称一群弧菌可降解聚乙烯醇-线性低密度聚乙烯塑料混合物,是众所周知的海洋生物膜形成微生物。我们不能确定弧菌是否能够降解PET,主要是因为我们的PET生物降解菌株中没有发现类似弧菌的生物。此外,PICRUSt2 宏基因组预测显示,无论是ASV1还是其他弧菌ASV贡献了0.5%以上的相对丰度所持有的任何基因参与PET,对苯二甲酸或原儿茶酸退化,如图5所示,这表明丰富的弧菌属更可能是交叉饲养者,可能利用微生物群落其他成员产生的有机物质,而不是 PET 或其任何直接分解产物。

先前的一些研究指出,底物类型的影响可能只出现在生物膜形成的早期阶段。在这里似乎也是如此,那些对不同处理之间的差异有很大贡献的物种主要是相应处理的早期殖民者(定义为在第1天和第7天数量达到峰值的物种;图1和2)。我们还发现参与原儿茶酸降解的基因在 BHET 的第 3 天和第 7 天以及无定形 PET 生物膜处理的第 21 和 30 天达到峰值,这符合 BHET 是一种比 PET 更不稳定的底物的假设,会诱导较早选择的能够生物降解芳香环的微生物。然而,有趣的是,潜在的PETase同源物仅在PET和风化的PET粉处理中大量确定,这些随时间增加,在培养42天达到最大丰度(图5)。这说明对于高结晶的PET,在培养6周内微生物群落的降解尚未达到峰值,这可能是PET和风化的PET粉末群落没有不同于无碳对照群落直到培养结束(图1)。通过我们的代谢组学分析,我们也没有在这些群落中检测到PET降解的中间产物,尽管这可能是由于这种难降解聚合物的中间产物生产速率降低,因此,这些中间产物的消耗速度比生产速度更快。之后应该进行更多的研究,例如使用同位素标记塑料,以确定高结晶度PET的生物降解,并跟踪其在复杂的微生物群落中的迁移。

结论

该研究通过蛋白质基因组学和代谢组学方法鉴定了第一个海洋PET降解细菌分离物Thioclava sp. BHETI和Bacillus sp. BHET2。Thioclava sp. BHETI揭示了一种有趣的和意想不到的酶来处理PET副产物,而Bacillus sp. BHET2则显示了更有趣的、未知的PET降解酶。这些酶的进一步特征将允许在环境宏基因组中搜索这些酶,并帮助评估塑料球中存在的真正的生物降解潜力。我们还描述了在6周的培养过程中暴露于不同PET产品的塑料球的微生物群落演替,并提供了一些证据,表明PET降解的峰值可能发生在不同的时间点,取决于底物的抵抗性(即结晶度)和以及基质对微生物的可及性。我们的多组学分析结果突出了海洋塑料圈中PET降解的潜力,并表明需要对不同环境中生物降解潜力进行更机理的表征。


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关键词:
微生物,塑料,群落,对苯二甲酸,通过

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