科研 | 河海大学:青藏高原雅鲁藏布江沿岸抗生素抗性的人为干扰:抗生素抗性基因对细菌病原体的生态传播机制(国人佳作)

2021
11/02

+
分享
评论
微生态
A-
A+

编译:微科盟蓝胖儿,编辑:微科盟茗溪、江舜尧。

微科盟原创微文,欢迎转发转载,转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

人类活动可加速抗生素抗性的流行,并对全球生态安全和公共卫生构成威胁。然而,在人为干扰下,抗生素抗性基因(ARG)的迁移和传播到细菌病原体的研究仍然知之甚少。本文采用宏基因组学方法研究了雅鲁藏布江沿岸人为干扰下ARGs和致病性抗生素耐药细菌(PARB)生物地理学特征。结果表明,青藏高原雅鲁藏布江沿岸的ARGs以bacA基因为主。快速城市化和筑坝对ARG组成的影响不同,城市化促进了ARG对磺胺和四环素的抗性,而筑坝提高了ARG对氯霉素和氨基糖苷的抗性。土地利用模式是影响人为干扰下ARG组成的关键因素,它可以直接反映土地退化程度,并反映不同人类活动对ARG选择性化学品的投入。此外,尽管ARG相对丰度没有变化,但PARB受到了人类活动的高度促进,表明ARG对病原体传播的增加。我们发现,受人类影响的环境中含有高比例的可动遗传因子(MGEs),在致病宿主中携带ARG的MGE也在人为干扰下增加,证实了人为活动可以促进ARG基因的水平转移。此外,人类活动也会影响PARB的组装过程。基本上,随机过程主导了沿河PARB的聚集,随着人类活动的增加,这些过程由非支配的随机过程向扩散限制转变。综上所述,本研究为流域抗性管理和减少ARG对病原体传播提供了有益的策略,应考虑人类活动的方式和强度及其对水平基因转移和组装过程的潜在影响。

 

论文ID

 

名:Anthropogenic disturbances on antibiotic resistome along the Yarlung Tsangpo River on the Tibetan Plateau: Ecological dissemination mechanisms of antibiotic resistance genes to bacterial pathogens

青藏高原雅鲁藏布江沿岸抗生素抗性的人为干扰:抗生素抗性基因对细菌病原体的生态传播机制

期刊Water Research

IF:11.236

发表时间:2021.7.20

通讯作者:王沛芳

通讯作者单位:河海大学环境学院

DOI号:10.1016/j.watres.2021.117447

实验设计

 

沿雅鲁藏布江从仁邦县到嘉卡县进行了采样(图1)。沿河采集了7个地点,其中2个在原始地区(Y1和Y2),2个在城市化地区(Y3和Y4),3个在大坝调整区(Y5、Y6和Y7)。在每个采样点,地理数据(经度、纬度和采样点之间的距离)由GPSMAP 62s设备记录。每个采样点的土地利用信息从国家测绘中心获取,然后进行量化。土地利用指数是指流域内多个土地的退化程度,由采样点周围10 km缓冲区内不同土地利用的具体值加权求和得到。使用手持式声学多普勒测速仪测定水流速度。采用HQ40d多参数水质分析仪在现场采样时测定了河水的pH、温度、溶解氧(DO)、氧化还原电位(ORP)和电导率(EC)。在样品采集过程中,用2100 P浊度计测定水的浊度。从每个地点,收集1.5 L的水样存储在4℃,用于实验室溶解有机碳(DOC)和总氮(TN)分析。通过真空过滤收集水中微生物,存于-20℃运送到实验室进行DNA提取和宏基因组测序。

74861635809246855

图1 青藏高原雅鲁藏布江沿岸的采样点。   蓝色、红色和黄色地块分别代表位于原始地区、城市化区域和大坝调整区的采样点。   图片显示了每个采样点的河流特征。    

结果

1 抗生素抗性基因和病原体的多样性和相对丰度

雅鲁藏布江共检测到119种抗34种抗生素的ARG亚型。每个样本中ARG亚型的数量从80(原始地区为Y1)到113(城市化地区为Y3)不等。雅鲁藏布江沿岸ARG相对丰度范围是恒定的,在原生态遗址、城市化地区和大坝调整区的平均相对丰度分别为3.59×10-4,3.64×10-4和3.51×10-4(表S2)。同时,ARG多样性受到人为干扰的显著影响,原生态遗址的Shannon指数为0.337,而城市化和大坝调整区的Shannon指数分别为1.437和0.55。结果表明,原始地区、城市化地区和大坝治理地区的病原菌(即携带VGs的细菌)相对丰度分别为0.129、0.121和0.129,三者间差异不显著。河流沿岸的病原菌多样性分布范围也基本一致,原始地区、城市化地区和大坝调整区的Shannon指数分别为5.33、5.34和5.32。采用Pearson相关分析检验ARGs与病原菌的关系,潜在病原菌的相对丰度与ARGs的相关性不显著(r = -0.433,p > 0.05)。

  2 人为干扰下的抗生素抗性基因组成

用PCoA测定ARG组成的差异。从雅鲁藏布江采集的21个样本分为三组(图2A),一组包括所有来自原生态遗址的样本,另两组分别包括来自城市化地区和大坝治理地区的样本。结果表明,不同采样区ARG组成存在显著差异,表明城市化和大坝整治对ARG组成的影响存在差异。此外,ANOSIM还证实了ARG的组成在采样区域之间存在显著差异。相比之下,在水库、大坝上游和下游采集的样本被归为一组,这表明在大坝调整区,ARG组成沿着河流-水库系统没有显著差异。

 

13941635809247045

图2 不同人为干扰对抗生素抗性基因(ARG)分布的影响。主坐标分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)显示ARG组成的不同(A),图上任意两点之间的距离表示基于PCoA的ARG组成变化,双头箭头表示基于ANOSIM的ARG组成差异。*表示取样区域间差异显著(p<0.01)。根据ARG分类的相对丰度(B)和基于抗生素耐药性的ARG分类(C)来分析ARG的组成。

同时我们还考虑到不同采样区域的ARG组成(图2B-C)。在雅鲁藏布江流域,抗杆菌肽的bacA基因是ARG的优势基因,占总ARG的91.0%。在Y1中检测到的bacA比例最高(98.1%)。在城市化和大坝调整区,bacA百分比下降,ARG分布更加多样化。在城市化地区,sul1(磺酰胺)、ant3ia(壮观霉素)、tetC(四环素)、acrB(氨基糖苷)和mexB(替加环素)得到促进,而在大坝整治区,acrB、mdtL(氯霉素)和TolC(氨基糖苷)略有增加。

3 抗生素抗性基因与环境因素的关系

通过BEOENV分析(表S3)确定了ARG组成与环境因素之间的关系,土地利用指数是解释ARG组成变化的最佳单一参数(BEOENV相关性 = 0.927)。与ARG组成相关性最好的环境变量子集为土地利用指数和TN,其Bioenv相关性为0.934。

此外,CCA分析表明,所有选定的变量解释了65.5%的ARG变异(表1)。土地利用指数对ARG组成的解释率最高,占总变异的解释率为40.1%。相关分析证实,土地利用模式显著影响ARG组成,土地利用变化与沿河ARG组成的差异性显著正相关(图S1)。因此,土地利用模式被确定为影响ARG组成的关键因素。此外,土地利用指数与沿河抗生素总浓度显著相关(r = 0.910,p < 0.01),并显著影响抗生素成分,解释了沿河抗生素变异的67.5%,具有统计学意义。

  表1 通过CCA分析计算的选定变量解释抗生素耐药基因(ARG)的变异和致病性抗生素耐药细菌(PARB)的组成。p值通过蒙特卡罗置换(999置换)进行测试。

77011635809247371

 4 致病性抗生素耐药菌鉴定

通过鉴定我们发现,总共有36种病原菌被鉴定为携带ARG(图3A)。脑膜炎奈瑟菌8013(Neisseria meningitidis 8013)和百日咳杆菌Tohama I(Bordetella pertussis Tohama I)是沿河的主要PARB。PARB相对丰度沿河变化范围为1.42×10-6(Y1)~5.97×10-5(Y3)。人类活动对PARB相对丰度有显著影响,城市化地区和大坝调整区的PARB相对丰度分别比原生态遗址高3.54倍和1.55倍。PARB相对丰度与沿河土地利用指数显著正相关(r=0.758,p<0.01)。

93301635809247559

图3 致病性抗生素耐药细菌的相对丰度(PARB;A)和可动遗传因子(MGE;B),以及它们在雅鲁藏布江沿岸的相关性(C)。抗生素耐药基因(ARG)和MGE样ORFs的排列位于同一个被注释为潜在病原体的重叠群上(D)。5 可动遗传因子相对丰度及其与致病性抗生素耐药菌的相关性

MGE相对丰度沿河流总体序列的变化范围为0.32%(Y2)~0.76%(Y3)(图3B)。质粒是河流MGE的优势种,占MGE相对丰度的86.8%,其次是ISs(10.4%)和整合子(2.80%)。通过Pearson相关分析分析MGEs和PARB之间的关系,PARB百分比与MGE相对丰度显著正相关(图3C;r = 0.951,p < 0.001)。

此外,根据宏基因组分析(表S4),对被注释为潜在病原体的组合重叠群的ARGs和MGEs共存进行了表征。总共获得了44只携带ARGs和MGEs并被指定为病原体的重叠群,其中城市化地区样本中共存的重叠群数量最多,占河流中44只重叠群中的30只。例如,在城市化地区的柠檬酸杆菌(Citrobacter)和不动杆菌(Acinetobacter)中发现携带MGEs和ARGs的重叠群(图3D)。此外,大多数重叠群注释为柠檬酸杆菌,占所有重叠群的81.9%。

6 零模型分析

根据PCoA(图S2),各采样区域的PARB成分没有显著聚集,我们调查中检测到的环境因素几乎无法解释PARB成分(表1和S3)。因此,使用零模型分析来分析PARB组装过程。在PARB组装中,随机过程比确定性过程更占主导地位(图4A;分别为80.0%和20.0%)。考虑到随机过程,包括扩散限制、均匀化扩散和不确定随机过程,对PARB组装过程的解释分别为49.0%、4.8%和26.2%。同时,确定性过程,包括异质选择和均质选择,对PARB组装过程的解释分别为15.2%和4.8%。RCBray与土地利用指数变化的关系决定了人为干扰对PARB组装过程的影响(图4B)。RCBray与土地利用指数变化显著相关,随土地利用指数差异的增加,RCBray分布逐渐增加,从与非支配随机过程一致(-0.95 < RCBray < 0.95)到与扩散限制基本一致(RCBray > 0.95)。此外,基于零模型对ARG组装过程的分析,发现异构选择是ARG组装中最重要的过程(图S3)。

 

77361635809247758

图4 在形成致病性抗生素耐药细菌(PARB;A)和土地利用指数差异的随机过程变化(B)的组装过程。随机过程(扩散限制、均匀化扩散和不确定随机过程)和确定性过程(异质选择和同质选择)的相对比例分别用青色和棕色表示。基于 RCBray 与土地利用指数差异的关系,分析了随机过程的比例变化,水平虚线表示在RCBray = +0.95和-0.95处的上、下显著性阈值。  

讨论

随着人类的发展,人类活动在世界范围内日益频繁,受人类影响的河流系统是最具代表性的地表水,在全球现代水环境中都有发生。人类主导的河流系统在生物污染物(包括ARG和病原体)的发生和富集中起着关键作用。然而,影响ARG的不同人为干扰的机制,特别是解决ARG向病原体传播的机制,仍需要在流域尺度上进行进一步研究。这项研究是在一条受城市化和大坝建设影响的大型原始河流中进行的,旨在描述这些人为活动下的抗生素抗性生物地理学,并进一步阐明影响ARG的机制,特别是在不同的人为胁迫下ARG对病原体的传播。 

1 不同人类活动对ARGs分布的影响

这是首次使用宏基因组测序方法进行流域尺度研究,以揭示人类对原始河流ARGs的不同影响。在这项研究中,受人类影响(城市化和大坝调整)和原始位置之间的ARG组成存在显著差异,表明人类活动在改变ARGs方面起着关键作用。这一结果与前人的研究结果一致,认为人类活动对ARG的发生和富集有很大的影响。同时,我们还发现bacA基因是雅鲁藏布江沿岸最常见的ARG亚型,在原始地区占优势。根据先前的研究,bacA基因被认为是细菌的固有基因,并已在各种细菌属的原始生态位中发现。雅鲁藏布江被认为是原始河流,这是由于其起源于冰川和周围人口稀少,而bacA基因在原始西藏环境中的流行已经被描述过。bacA基因的优势证实了我们研究的原始区域很少受到人类活动的污染。

河流流入城市化地区后,ARG多样性增加,ARG亚型增加。磺酰胺和四环素是常用的抗生素,在高度城市化地区经常检测到它们相关的ARG。我们的研究还发现,这些ARGs在城市化地区得到了高度促进,特别是在流入河流的支流(拉萨河)的Y3位置。拉萨河流经西藏自治区首府(拉萨市),作为政治、经济活动、宗教、文化和交通的中心。因此,快速城市化和相关人类活动(包括抗生素治疗、农业径流和城市废水排放)造成的人为压力,导致大量抗生素投入,从而促进ARGs在周围环境中的发生、进化和传播。

大坝建设对ARGs的影响与城市化的影响不同,因为其样本被分为不同的具有统计学意义的组。在大坝治理区,bacA仍占较高的ARG比例,与氯霉素和氨基糖苷相关的ARGs增加,这与城市化地区的ARG组成不同。藏木大坝是在自然环境中修建的。与城市环境相比,大坝施工和管理营地可能排放不同的ARG选择性化学物质。有趣的是,在大坝调整区域内,由于在水库、大坝上游和下游采集的样本聚集在同一组,ARG的组成在河流-水库系统中相对稳定。这与之前的一项研究结果不一致,该研究检测到大坝调节引起的环境因素变化对饮用水河流-水库系统中的ARG有重要影响。这种差异可能由于之前在高度城市化地区进行的调查,在我们的研究中,抗生素浓度水平高于藏木大坝。由于原始环境的低背景值,藏木大坝的建设和运行从全河角度来看可能是ARG选择性化学物质的主要来源,这一影响可能比大坝调节如流量等引起的环境变化更占优势。

尽管城市化和大坝建设显著影响ARG的组成,但它们对ARG相对丰度的影响可忽略不计。这可能是由于雅鲁藏布江受到了轻微的人为干扰,例如西藏地区的地区生产总值比上海等特大城市低30倍。这一结果强调,即使是轻微的人为诱导的选择性压力也会使ARG成分多样化,从而提高其对人类和环境的健康风险

根据CCA,雅鲁藏布江沿岸土地利用指数对ARG变化的解释率最高,并且ARG差异性与土地利用差异性显著正相关,这进一步证实了土地利用模式对ARG分布的重要影响。最近,几项研究声称,人类活动排放的大量抗生素和非抗生素抗菌化学品可作为选择性药剂,即使在低浓度下也会对ARGs产生重要影响。然而,很难量化所有这些选择性化学物质来解释人类活动如何影响ARGs。特别是,土地利用模式可以为河流沿线的人类活动提供强有力的证据,并在水生生态系统中抗生素和杀菌剂等外源性ARG选择剂的出现中发挥重要作用。在本研究中,土地利用指数通过特定加权值进行测量,重点关注耕地和人工地表的土地利用百分比,以表明河流沿线的土地退化水平。城市化和大坝整治区土地利用指数均高于原始地区。城市化地区土地利用指数最高,河流沿岸耕地和人工地表所占比例最高。在大坝治理区内,人工地表所占比例超过耕地。这一结果是合理的,因为城市化地区的高人口居住增加了耕地和人工土地的比例,混凝土水工建筑物增加了大坝调节区的人工表面。研究还发现,雅鲁藏布江沿线的抗生素总浓度与土地利用指数呈正相关,这证实了土地利用模式可以提供ARG选择性化学品污染源的有用信息。因此,土地利用指数可以有效地反映人类活动(包括城市化和大坝调整)对ARG的不同影响。 

2 ARGs在人为干扰下向病原体传播

生物污染物污染,包括ARGs和病原体,是全世界水生环境中最基本的环境问题之一,并导致经济成本和人类健康风险。值得注意的是,人类病原体与其他环境细菌共享ARGs,病原体获取ARG是河流生态系统安全的最重要风险因素之一。因此,我们的研究分析了携带ARGs和VGs的PARB,以探索ARGs向病原体的传播。结果表明,城市化和大坝建设对PARB相对丰度的促进作用不同,分别是原始地区的3.54倍和1.55倍,ARG和病原体相对丰度没有差异。这一结果强调了在评估抗生素抗性的生态风险时考虑ARG宿主致病性的重要性。PARB相对丰度的提高可能是由于人为活动促进了ARG向病原体的潜在传播。在以前的研究中也发现了类似的结果,这为ARG和VG在人为压力下在致病基因组中共同进化的趋势提供了理论支持。ARG在人类影响环境中的传播主要是通过细菌宿主或遗传位点之间的混杂基因转移,即水平基因转移,需要MGE作为载体。因此,研究MGE的存在以评估ARG在细菌间的水平转移潜力。

根据我们的研究结果,城市化和大坝建设地区在人为污染下MGE相对丰度的变化是不同的,这与Gillings等人的发现相似。不同的MGE相对丰度表明,在这些人为干扰下,ARG的水平转移能力不同,这可能是PARB相对丰度增加的原因。此外,我们发现MGE相对丰度与PARB的相对丰度显著正相关,这证实了MGE对病原体获取ARG的影响。基因排列显示,城市化地区比沿河其他地区更频繁地检测到携带ARGs和MGEs并被指定为病原体的重叠群,该地区的PARB相对丰度也有所增加。由于这些重叠群大多被注释为柠檬酸杆菌,柠檬酸杆菌可被视为ARG在病原体中传播的热点。综上所述,MGEs在环境ARGs向病原体转氨化中发挥着重要作用。应该考虑的是,我们的研究是在一个相对不发达的地区进行的,即使是轻微的人为干扰也可能聚集MGEs,并促进ARG向病原体的传播。

此外,PARB成分的变化几乎不能用我们研究中选择的环境因素来解释。因此,我们的研究基于其组装过程进一步评估了这种变化。这是首次通过零模型分析研究PARB组装过程,我们发现,在雅鲁藏布江流域,PARB组装过程以随机过程为主。随机过程包括随机出生、死亡、移民和扩散事件,导致物种组成模式与随机机会产生的模式无法区分。相反,确定性过程涉及非生物和生物因素的生态选择,以改变物种适应度,从而决定群落的组成和共存。值得注意的是,作为ARGs的一个危险部分,PARB与整个ARG群体相比具有不同的组装过程,因为ARG组装主要由确定性选择主导。这可能是ARG和PARB群落在人为干扰下呈现去耦变化的原因之一。因此,我们可以推测,每一种ARG都可能被随机捕获用于水平基因转移,并且每一种ARG都可能有相同的机会传播给病原体。

我们还发现,人为活动可能会影响PARB组装过程。随着土地退化程度的增加,PARB组装的随机过程从非决定性随机过程(即随机出生、死亡和繁殖)到扩散限制(即抑制微生物迁移导致不同的群落结构)。由于随机过程主导了PARB组装,来自不同人类影响环境的微生物的不同迁移可能在构建PARB群落中发挥了重要作用。这些微生物的远距离移动可能会受到限制,从而导致扩散限制。因此,建议在河流生态系统的大规模生态PARB评估中考虑土地利用模式和相关人类活动的差异。从流域管理的角度来看,研究结果为提高环境耐药菌的生态评价效果,减少ARG对病原体的传播提供了有益的信息。

评论

综上所述,本研究揭示了青藏高原雅鲁藏布江沿岸不同人为干扰下抗生抗性的变化。城市化和大坝建设对ARG组成的影响不同。土地利用模式可以直接反映河流沿线的土地退化程度,是影响ARG组成的关键因素。尽管ARG相对丰度变化不大,但城市化和大坝建设对PARB的促进作用不同。受人类影响的环境中含有高比例的MGEs,因此对PARB富集有显著贡献。此外,在人为干扰下,携带ARGs的MGEs在致病宿主中增加,这证实了MGEs在ARG向病原体迁移中的重要性。而且人类活动也可能影响PARB组装过程。随机过程控制着PARB的聚集,并且随着土地退化程度的增加,这些过程从非决定性随机过程转变为扩散限制。因此,本研究强调了PARB在揭示环境抗生素抗性所造成的威胁方面的重要性,并为在流域管理中控制ARG向病原体传播提供了有用的策略。


本文由“健康号”用户上传、授权发布,以上内容(含文字、图片、视频)不代表健康界立场。“健康号”系信息发布平台,仅提供信息存储服务,如有转载、侵权等任何问题,请联系健康界(jkh@hmkx.cn)处理。
关键词:
地区,人类,城市化,影响,大坝

人点赞

收藏

人收藏

打赏

打赏

我有话说

0条评论

0/500

评论字数超出限制

表情
评论

为你推荐

推荐课程


社群

精彩视频

您的申请提交成功

确定 取消
剩余5
×

打赏金额

认可我就打赏我~

1元 5元 10元 20元 50元 其它

打赏

打赏作者

认可我就打赏我~

×

扫描二维码

立即打赏给Ta吧!

温馨提示:仅支持微信支付!