科研 | mSystems：农业管理对根际活性细菌群落组成和硝化作用的影响

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

与常规种植系统相比，种植在多样化种植系统土壤中的植物根系表现出更细、分枝更多的结构(表1)。此外，根/茎比表明，多样化种植系统增加了植物生物量分配到根系的比例。正如之前所报道的，我们还观察到，来自多样化种植系统的土壤的硝酸盐库显著降低(表S1)，这可能促进了这些土壤中的根系发育。

表1 玉米根系结构特征。对每个根系性状分别进行单因素方差分析(每种种植制度n = 16)。 

种植制度和根系邻近性(即样品是来自非根际土壤、根际还是内层)影响了原核和真菌群落组成，并存在一些显著的交互作用(表2)，而种植制度(垂直扩散)则不那么明显(图1)。种植制度对原核群落的影响在RNA水平上比在DNA水平上更明显，其中非根际土壤、根际和内层样品一般因种植制度而单独聚集；在靠近根的分离过程中也观察到类似的趋势(图1A和B)。同样，靠近根的真菌群落分离更明显，而种植制度分离的程度较小(图1C)。

土壤微生物群落的多样性随种植制度的不同而不同(图2和表S2)。根的邻近使原核物种丰富度降低，均匀度增加。另一方面，对于多样性系统是否改变这两个多样性指标的解释，取决于是基于DNA还是RNA的分析(图2和表3)，基于RNA的分析表明，在不同的系统中，原核生物的丰富度更高。此外，除了非根际土壤在DNA分析中具有更高的丰富度外，基于DNA的原核物种丰富度在多样化系统中也更大。相比之下，真菌的总体趋势则相反，根际的丰富度在常规种植系统中显著更高(图2)。基于RNA而不是DNA的分析表明，不同种植系统的土壤均匀度不同，不同种植制度下植物根际和内层的均匀度均有轻微增加的趋势。虽然内层总体丰富度较低(原核生物和真菌)，但其群落更均匀，两种种植方式基于DNA和RNA的分析差异不大。

4 原核生物群落的差异丰度

在不同的分类水平上进行了LEfSe分析，以揭示种植制度如何影响原核生物群落(图3和4)，以及总居住(基于DNA)和潜在代谢活性(基于RNA)群落结构是否不同(图5)。无论种植制度和DNA/RNA水平如何，分类群富集(LDA，P＜0.05)都存在显著差异，尤其是在根际(图3和图4)。种植制度影响了基于DNA和RNA谱之间的对应关系，特别是非根际土壤和根际群落(图5)。各种植系统对分类群的选择基本一致，但各类型分类群优先富集。

不同种植制度的土壤都有不同的基于DNA和RNA的群落结构(图3、4和5)。在DNA水平上，常规土壤中差异丰富的门和科较多，其中变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）占59%(30/51)(表4、图6A和D;图S1A、S1D和图S2A、S2D)。在19个差异丰富的变形菌科中，有12个是α变形菌纲，主要属于根瘤菌目。相比之下，在多样化系统中，差异丰富的科较少，代表较少的门；Proteobacteria和Actinobacteria占差异丰富类群的40%(表4)，而变形菌纲并不占主导地位(图3，图6A和D，图S1A和S1D，图S2A和S2D)。

放线菌（Actinobacteria）和酸杆菌（Acidobacteria）对系统间差异的贡献是独一无二的，与常规系统中的11个放线菌科相比，多样化系统中有8个差异丰富的酸杆菌科(图S2A和S2D)，而常规系统中有11个差异丰富的放线菌科，许多是低丰度。浮霉菌门（Planctomycetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）只有微小差异(图S3A和S3D)，而常规系统具有更多差异丰富的拟杆菌门（Bacteroidetes）(图S4A)，多样化系统具有更多差异丰富的厚壁菌门（Firmicutes）科(图S4D)。

基于RNA的图谱显示，多样化非根际土壤中差异丰富的科数比常规非根际土壤多33%，门数多50%(表4)。变形菌门、放线菌门和酸杆菌门占差异丰度类群的51%，其余的来自其他9个门(表4，图6A和D，图S1A和S1D，图S2A和S2D)。在常规的非根际土壤中，这三个门占差异丰富科的73%。差异丰度最大的变形菌门为α变形菌门(主要是根瘤菌目Rhizobiales和红螺菌目Rhodospirillales)，这与基于DNA图谱的观察结果相似(图6A)。潜在代谢活性β变形菌（Betaproteobacteria）的增加主要是由于丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）(图6D)。δ变形菌（Deltaproteobacteria）和γ变形菌（Gammaproteobacteria）的丰度差异不大(图S1A和S1D)，尽管δ变形菌在基于RNA的图谱中更丰富。放线菌在常规土壤中比在多样化土壤中更具有潜在的代谢活性(图S2A)。在多样化种植系统中以及在非根际土壤和根际中，浮霉菌门在基于RNA比基于DNA的图谱中更丰富(图S3A和S3B)，包括土壤厌氧氨氧化分支OM190。疣微菌门、拟杆菌门和厚壁菌门差异不大(图S3D、图S4A和S4D)。

每种种植制度的根际都有不同的基于DNA和RNA群落谱(图3、4和5)，与非根际土壤相比差异尤其明显(表4)。在DNA水平上，放线菌（Actinobacteria）、酸杆菌（Acidobacteria）和变形菌（Proteobacteria）分别占多样化和常规根际差异丰富科的50%和76%。与非根际土壤的一个关键共同点是，与多样化的（23种变形菌中的8种）根际（图6B和D；图S1B和S1D）相比，常规（18种变形菌中的15种）根际中差异丰富的α变形菌科占优势，包括根瘤菌科增加了0.3倍（图6B）。相对于非根际土壤，根际中富集最多的是β变形菌，与土壤中不同的是，在多样化的系统中，多个β变形菌科的RNA谱更丰富(图6E)。伯克氏菌目（Burkholderiales）的丛毛单胞菌科和草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）分别在多样化和常规根际中富集，而伯克氏菌科（Burkholderiaceae）则没有富集(图6E)。与非根际土壤一样，δ变形菌在根际中具有高度的代谢活性，一些科在基于RNA和DNA的相对丰度上表现出2-5倍的差异(图S1B)，包括亚硝酸盐氧化的Nitrospinaceae。常规根际中假单胞菌科（Pseudomonadaceae）较多；在非根际土壤中，假单胞菌科在多样化系统中更丰富(图S1E)。

与非根际土壤相比，根际放线菌减少33%，但与非根际土壤不同的是，RNA相对丰度显著增加，尤其是在常规体系中(图S2B)。同样，两种种植方式都富集了具有代谢活性的放线菌科。此外，在基于DNA和RNA的图谱中，多样化系统中有更多差异丰富的酸杆菌，其中许多是低丰度(图S2E)。相对于非根际土壤，根际土壤中浮霉菌门和疣微菌门的丰度总体上略有下降，拟杆菌门和厚壁菌门的丰度总体上略有上升，拟杆菌门和厚壁菌门的丰度较低（S3B、S3E和图S4B、S4E)。

基于DNA和RNA的群落结构在内层比在根际或非根际土壤中更为一致(图3、4和5)。这可能是植物对能够在细胞间隙生存的细菌的选择以及残余DNA对群落结构缺乏影响的结果。然而，尽管有这些相似之处，但仍有一些显著的差异，与常规系统中的10科(3门)相比，多样化系统中的28科(9门)更丰富(表4)，尽管许多是低丰度类群(＜0.1%)。

相对于根际而言，变形菌在内层的代表性增加，这与种植制度有关(图6C和F以及图S1C和S1F)。根瘤菌科在常规内层中特别富集，与在根际中观察到的情况类似(图6C)。此外，丛毛单胞菌科和草酸杆菌科分别富集在多样化和常规系统的内层中(图6F)。相对于根际，黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）在内层富集(图S1C和S1F)。虽然基于RNA的变形菌门的相对丰度在两种种植制度之间没有差异(图5C)，但群落组成发生了显著的变化，多样化种植制度下的β-和δ变形菌较多，而常规种植制度下的α变形菌（特别是鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae）较多(图3,图6C和F,图S1C、S1F)。

与根际和土壤相比，内层中放线菌（小单孢菌科Micromonosporaceae、链霉菌科和假单胞菌科）富集，构成了相当大比例的潜在活性群落，特别是在常规内层中(图5和图S2C)。种植制度对植物生长动态选择过程的影响还体现在Verrucomicrobia和Bacteroidetes科的差异富集上(图S3F和S4C)。然而，常规的内层在酸杆菌门(图S2F)和浮霉菌门(图S3C)中耗尽。最后，内层中类芽孢杆菌科（Paenibacillaceae）的富集，可能反映了它们在根际的富集(图S4F)。

常规土壤和多样化土壤中各有不同的真菌科富集(图7和图S5)。在多样化的非根际土壤中，差异丰富的科较少(表4)，其中子囊菌门(主要为Sordariomycetes)和担子菌门(主要为Tremellomycetes和Mortieromycetes)占83%。根际存在明显的种植制度效应(图7)，导致常规根际真菌科比多样化根际真菌科丰富3倍(表4)，主要是子囊菌门和担子菌门。常规根际和内层富含多种植物病原真菌科(Botryosphaeriaceae、Glomerellaceae、Diaporaceae、Pleosporaceae和Ustilaginaceae)。此外，多样化根际中球囊菌纲（Glomeromycetes）的数量显著高于常规根际。常规内层与多样化内层之间差异不大，常规内层富含植物病原体，而多样化内层则分别富含已知腐生植物Trichocomaceae和植物病原体Microdochiaceae。

基于DNA和RNA的图谱显示，Nitrosomonadaceae相对丰度在非根际土壤中最高，在多样化的根际中富集(图3和6D)。常规非根际土壤中Thaumarchaeota较多，而根际中Thaumarchaeota较少(图8A和B)。而Nitrospiraceae在多样化根际富集的同时，其他Nitrospirae也在多样化非根际土壤和根际中富集(图8C和D)。在特定可操作分类单元(OTUs)富集过程中，我们观察到了种植制度效应而非根际效应。采用定量PCR(qPCR)检测了氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA) amoA基因的丰度。在常规土壤中检测到AOB amoA基因丰度高于在多样化土壤中检测到的AOB amoA基因丰度并不奇怪，考虑到无机氮输入的差异，在根际观察到类似的模式是有趣的(图9A)。我们的结果还表明，根际中Thaumarchaeota的富集不受种植制度的影响(图9B和C)，并且根据相对丰度，常规土壤中的Nitrosomonadaceae可能比预期的更多(图6D和9A)。

在V4/V5发育阶段，不同种植制度的非根际土壤硝化势、总硝酸盐产率和硝酸盐库大小没有显著差异(图9D至F)。相比之下，根际土壤表现出种植制度效应，但在多样化根际中的总硝酸盐产量下降趋势不显著(表S3)。尽管Thaumarchaeota、Nitrosomonadaceae或Nitrospira的相对丰度与潜在硝化速率之间没有明显的相关性，但硝酸盐库大小和总硝酸盐产量的模式更类似于AOB/AOA amoA基因丰度比(图9C至F)，表明这两类生物之间的关系可以解释在多样化系统的地下水中检测到较低的硝酸盐水平。

本文研究了常规(2年轮作，无机施肥)和多样化(4年轮作，肥料修正)种植制度对玉米氮素需求增加时原核群落和真菌根系相关群落组成的影响。前提是，在植物开始快速吸收养分之前，植物就已经对微生物群落进行了选择，以促进养分的获取或保留。通过比较总定居(基于DNA)和潜在代谢活性(基于RNA)的群落结构，以及其对总硝化速率和硝化潜力的影响，我们评估了种植制度是否影响了原核生物群落的根际启动。虽然我们的提取方法被认为是非定量的，但分类单元相对丰度的差异确实反映了群落组成的差异。根-土壤反映了从土壤到植物的连续统一体，这是探索植物群落的一个重要考虑因素。结果表明，由于农业管理对土壤微生物群落的影响，不同系统的根际和内层微生物群落结构不同，根际微生物群落潜在的代谢活性也不同。

基于DNA的图谱反映一系列代谢状态(休眠、生长)和残留(死亡)，而RNA分析则反映潜在的代谢活跃状态(蛋白质合成的潜力)。蛋白质合成的潜力可能反映了生物对环境变化的快速反应能力。RNA谱的组成变化是对养分输入(包括根系分泌物)的响应，而活性群落已被证明比整个群落组成更能与降雨事件后的CO₂生产相关联。基于RNA分析的原核物种丰富度高于基于DNA的分析，这表明基于RNA的分析可能为环境因素如何影响群落组成提供更大的分化。根内和根上基于DNA和RNA的谱图之间的更大一致性可能反映了残留DNA对群落图谱的潜在影响的减少，或根提供的营养物质对代谢活动的更大刺激。这与之前的一篇报道一致，即玉米和其他植物根的DNA和RNA谱具有更强的一致性。植物内层群落指数(即相对丰度和物种丰富度/均匀度)的趋同性可能反映了植物内部生存环境的强选择性。因此，管理影响了土壤微生物种子库，植物通过根际的根沉积物富集特定种群，提供了一个特定生态位的群落，而内生真菌从中进行选择。总的来说，多样化的系统促进了玉米根相关微生物组中更大的原核物种丰富度，这可能是由于不同作物种类、施肥和/或减少耕作对微生物群落结构的影响。这与长期单施化肥导致土壤细菌多样性下降的报道相一致。相比之下，常规系统中根际真菌群落的物种丰富度更高，表明管理对真菌和原核物种多样性的影响不同。

氮素有效利用率的降低可能影响玉米根系构型，进而影响根际微生物群落结构。细根驱动微生物群落动态，以及养分循环和水分获取。根系形成的增强可能会增加根沉积物，而更大、分枝更多的根系探索更大的土壤体积，更多的C可能会提供给更大比例的土壤微生物。这在一定程度上解释了根际多样性中原核生物的丰富度和潜在代谢活性的差异。与这一前提相一致的是，AMF(球囊菌纲)在多样化的根际中相对丰度更高，但在形成丛枝的根际中不存在。根际真菌菌丝获取养分的地方，是否有更大的AMF生物量需进一步确定。这些观察结果表明，不同系统中的植物不仅通过根系，还可能通过加强植物与微生物过程之间的氮耦合来增加土壤资源的获取，这可能有助于这些系统中的产量效益。未来的工作应该通过利用AMF特异性引物更好地评估AMF的丰度和组成，以及测量根际土壤中AMF菌丝生物量来进一步探索这一点。

在多样化根际中，原核生物科的数量较多，代表更多数量的菌门，比常规根际中丰富，这可能影响了内层群落结构的差异。与常规根际相比，多样化根际中酸杆菌、拟杆菌和疣微菌门中科的富集与之前在同一试验点描述玉米根际群落的报道一致。这些微生物以分解复杂的有机物而闻名，如植物多糖。相比之下，变形菌门和放线菌门在常规根际中选择性富集，这可能影响了变形菌门在内层的优先富集，这与常规根际群落更依赖简单C基质的观点是一致的。综合考虑，这表明常规系统不太适合复杂的C分解，进而产生氨，这与之前在该地点发现的有机物动态一致。根际微生物对根际沉积物的响应增加，这种生长可能刺激微生物对N的需求，导致其与植物对N的直接竞争。微生物对氮的需求可以通过增加氮矿化(产铵)或降低硝化作用来满足。本研究之前在收集土壤的现场工作中得出的结论是，氮矿化可能对多样化种植制度的产量效益没有贡献。在V4/V5发育阶段，多样化的根际比常规根际更能抑制硝化作用(潜在活性，总速率)。这与另一篇报道一致，即在繁殖早期玉米根际潜在硝化活性较低，在该研究地点的多样化系统土壤水分中检测到的硝酸盐水平较低。根际较低的硝化作用反映了硝化细菌群落结构的复杂变化，根际AOA相对于AOB的比例高于非根际土壤，且具有特定的种植制度。在多样化的根际中，低硝化作用的趋势可能是由于向硝化群落的转变，该群落可能更善于在较低的铵水平上生存，进行硝化作用的微生物数量较少，和/或硝化细菌的代谢活性较低。虽然我们的数据支持在多样化的根际中氮供应与植物和微生物需求之间更有效的耦合，但更深入地探索管理和根际如何影响氮循环活动对于证实或反驳我们的结论至关重要。

综上所述，在植物准备快速吸收养分的多样化种植体系中，植物选择了更多样化的原核群落，改变了氮循环群体及其代谢，这可能有助于产量效益和减少氮损失。细菌内生菌在植物选择过程中存在群落结构趋同，但群落结构受根际群落结构的影响。在多样化系统中，玉米增加了土壤资源的获取(更多的分枝根系，增加了AMF相对丰度)，这将改变微生物的生境(定殖地点，根沉积模式)。生境改变的一个可能后果是分解过程中对铵的竞争加剧，这可能会降低硝化作用。很容易得出这样的结论：Marsden试验场的多样化系统能够在减少无机肥料的情况下支持高产，其中一个机制是更有效地耦合C和N循环。然而，单凭这一点可能不能完全解释产量效益，因为在多样化的系统中，由于真菌病原体胁迫的降低，以及与植物相关的微生物群的选择，直接刺激植物生长，植物健康可能更好。