科研 | 华科同济医学院：消化道菌群介导的溶血磷脂胆碱的产生促进了肠道表皮特异的Fut2缺乏性肠炎（国人佳作）

导读  

[研究背景和目标] 之前的研究揭示了岩藻糖基转移酶（Fut2）基因为一种肠炎（IBD）的风险位点。本研究的目的是探索Fut2在IBD易感性中的机制并提出一种治疗IBD的新策略。

[方法] 使用肠道上皮特异性的Fut2敲除（Fut2ΔIEC）小鼠。肠炎通过脉舒流（DSS）进行诱导。通过分析肠道微生物菌群的16S rRNA对菌群多样性进行分析，同时对小鼠粪便进行了代谢组学分析。通过粪菌转移（FMT）试验确定了消化道菌群和LPC之间的关联性。采用墨角藻糖基转移酶（LPC）证实菌群对于肠炎的影响。

[结果] 在患UC（UC vs.对照，P = 0.036）以及CD（CD vs.对照，P = 0.031）的病人中Fut2以及结肠组织中α-1,2-岩藻糖基化水平下降。当采用DSS进行治疗时，与WT小鼠相比，肠道炎症以及在Fut2ΔIEC小鼠中破坏性的屏障功能更加严重。与WT小鼠相比，在Fut2ΔIEC小鼠中观察到较低的肠道菌群多样性（P < 0.001）。当暴露于DSS中时，消化道细菌的多样性和组成在Fut2ΔIEC小鼠中发生了明显的变化，同时LPC在粪便中的浓度上升。FMT实验揭示了当接受来自Fut2ΔIEC粪便微生物转移的小鼠会表现出更严重的肠炎和更高的粪便LPC浓度。相关性分析表明LPC的浓度与4种细菌—大肠杆菌，嗜胆菌属，肠蠕虫属以及高氏杆菌相关。不仅如此LPC促进了促炎性细胞因子的释放以及体外和体内上皮屏障的损伤。

[结论] 结肠中的Fut2和α-1,2-岩藻糖基化不仅发生在CD中，而且在患UC的病人中下降。Fut2ΔIEC小鼠中的肠道菌群在结构和功能上发生了变化，促进了LPC的产生，这些LPC被证明促进了上皮屏障的炎症和损伤。

论文ID

原名：Gut microbiota-mediated lysophosphatidylcholine generation promotes colitis in intestinal epithelium-specific Fut2 deficiency

译名：消化道菌群介导的溶血磷脂胆碱的产生促进了肠道表皮特异的Fut2缺乏性肠炎

期刊：Journal of  Biomedical Science

IF：8.410

发表时间：2021年3月

通讯作者：蔺蓉，侯晓华

通讯作者单位：武汉华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科

DOI号：10.1186/s12929-021-00711-z

实验设计

结果

1 Fut2和α-1,2-岩藻糖基化在IBD病人和DSS诱导的大肠炎小鼠中下调

与健康个体相比，Fut2基因的表达在UC和CD病人（P = 0.031）的结肠组织中显著下调（P = 0.036）；在所有5个CD病人和16个UC病人中15个的Fut2水平低于对照组的标准偏差（图1a）。UEA-1染色表明了α-1,2-岩藻糖基化在UC，CD病人的结肠上皮细胞中下降（图1b）。除此之外，在暴露于DSS的小鼠中，Fut2在结肠中的蛋白质水平比正常小鼠显著降低（P = 0.009）（图1c，d）。在暴露于DSS下的小鼠结肠α-1,2-岩藻糖基化水平的下降通过UEA-1染色被检测出来（图1e）。上述数据证实了Fut2的表达和α-1,2-岩藻糖基化在IBD和试验性大肠炎的病人中下降。

图1 在IBD病人和DSS诱导小鼠中Fut2和α-1,2-岩藻糖基化。a 在正常结肠组织和UC结肠组织中Fut2相对的mRNA表达，同时CD病人通过qPCR进行检测（对于每组n = 8，16，5）。b 正常，UC，和CD结肠组织典型的UEA-1（一种特定的针对α-1,2-岩藻糖基化的瘦素）染色（红色）图像（比例尺，100μm）。c, d 从暴露或者非暴露于DSS（n = 3每组）的WT小鼠中提取出的结肠上皮细胞的蛋白质水平。e 采用UEA-1染色的（比例尺，100μm，50μm）小鼠结肠组织。数据采用平均值 ± SEM表示。数据来自3个独立的试验。在所有的板块中：*p < 0.05，**p < 0.01。

2 肠上皮特异的Fut2缺乏加剧了DSS诱导的结肠炎

基于IBD中Fut2和α-1,2-岩藻糖基化表达水平的下降，我们假设Fut2在结肠炎中具有重要作用。为了评估Fut2在结肠炎中的作用，我们通过注射3%的DSS到饮用水中7天将结肠炎引入WT和Fut2ΔIEC小鼠。当采用DSS处理时，Fut2ΔIEC小鼠相比WT小鼠表现出较高的死亡率（P = 0.036）（图2b），以及结肠长度的下降（P = 0.017）（图2a）。同时Fut2ΔIEC小鼠的疾病活性评分相比DSS组中的WT小鼠较高（P = 0.024）（图2c）。不仅如此，这伴随着较短的结肠长度（图2d，e）。与临床表现一致，Fut2ΔIEC小鼠的结肠切片表现出更加严重的腺体缺陷，粘膜溃疡以及炎性细胞渗入（图2f）以及较高的组织病理学评分（图2g）进一步证实了该结果。总之，Fut2小肠上皮特异性损伤加剧了DSS诱导的结肠炎。

图2 小肠上皮特异的Fut2缺乏加剧了DSS诱导的结肠炎。 a 在疾病过程中的体重改变。b 来自每组小鼠的生存率。c 小鼠疾病活性指数评估。d, e 每组小鼠结肠的长度。f 采用H&E方法染色的结肠组织。g 每组小鼠结肠的组织病理学评分。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有版块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.0001。 3 Fut2ΔIEC小鼠表现出增加的炎性反应

炎性反应是针对肠炎评估的关键指示指标，因此肠道促炎性细胞和因子被检测到。WT对照组小鼠和Fut2ΔIEC对照组小鼠在结肠组织的促炎性因子方面未表现出差异，而与WT小鼠的结肠组织相比，暴露于DSS中的Fut2ΔIEC小鼠表现出与巨噬细胞相关的促炎因子如tnf-α（P = 0.028），il-1β（P = 0.002）, il-6（P = 0.030）的mRNA水平上调。不仅如此，ccl2（P = 0.026），ccl3（P = 0.031），与单核细胞/巨噬细胞相关的趋化因子也表现出增加（图3a）。该结果通过对IL-1β和TNFα表达的western blot进行了进一步的证实（P = 0.002）（图3b，c）。对于F4/80的免疫化学染色被用于评估结肠巨噬细胞的渗入（图3d，e）。这显示出Fut2ΔIECDSS组的巨噬细胞（F4/80+）相比WT DSS组的巨噬细胞多出3倍（P = 0.001）。总之，这些结果证实了Fut2的缺乏增加了DSS诱导的急性结肠炎的炎性反应。

  图3 在暴露与DSS后，在结肠上皮细胞中丧失Fut2增加了结肠中促炎性因子的水平。 a tnf-α, il-1β, il-6, ccl2, ccl3, ccl4在结肠组织中相对的mRNA表达通过qPCR进行检测。b, c tnf-α, il-1β在四个组小鼠结肠组织中的蛋白质水平。GADPH被用于对照组上样。d, e 各个组中针对小鼠结肠组织巨噬细胞F4/80的免疫组化结果。这些结果通过分析阳性细胞区域和DOI进行分析。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有板块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。   4 小肠上皮特异性的Fut2的丧失加剧了DSS诱导的结肠炎中肠道屏障的损伤

    结肠炎的严重性与上皮细胞损伤屏障的严重性相关。紧密连接是上皮屏障最重要的功能元件之一，肠道杯状细胞的分泌在上皮细胞屏障中发挥了至关重要的作用。相比其他3个组，在Fut2ΔIEC DSS组上皮细胞的紧密连接处表现出显著的破坏。当暴露于DSS中时（图4b），相比野生型，ZO-1和闭塞蛋白的mRNA水平表现出显著下降（P = 0.021和P = 0.047）（图4b）。对ZO-1和闭塞蛋白免疫荧光染色证实了此结果（图4a）。进一步的，相比野生型Fut2ΔIEC小鼠结肠组织的AB-PAS染色（图4c）显示出杯状细胞的数量和粘膜厚度的显著下降（P = 0.013）（图4d）。总之，肠道上皮细胞中Fut2缺乏加剧了DSS诱导的结肠炎的屏障损伤。

图4 Fut2缺乏加剧了上皮细胞紧密连接和DSS诱导的结肠炎的屏障损伤。a采用ZO-1（绿色），闭塞素（红色）染色的结肠组织典型的免疫荧光图像，紧密连接的主要组成成分（比例尺，100μm）。b 闭塞素和不同组ZO-1的相对mRNA表达。c 采用AB/PAS对不同组的结肠组织进行染色（比例尺，100μm）。d 杯状细胞的数量（比例尺，50μm）。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有板块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

5 Fut2ΔIEC小鼠肠道菌群在LPC水平上结构和功能的提升

由于WT小鼠和Fut2ΔIEC小鼠的差异通过上述方法被检测到，我们研究了介导结肠炎易感性差异的潜在因子。正如之前所提到的，Fut2对肠道菌群具有潜在的调控效应，因此我们推测肠道菌群可能是影响Fut2ΔIEC小鼠结肠损伤的重要因素。首先，我们研究了基准水平上的微生物菌群组成，并且在研究结肠炎过程中采用小鼠粪便进行了16S多样性分析。相比WT小鼠（P < 0.001），Fut2ΔIEC小鼠表现出较低的α多样性。当暴露于DSS中时，Chao1指数在Fut2ΔIEC小鼠中显比WT小鼠中著下降（图5a）。基于Unweighted Unifrac（图5b）的PCoA图表明在4个组的微生物菌群中具有显著的区分。正如在图5c中所显示的，采用DSS处理的Fut2ΔIEC小鼠Muribaculaceae和疣微菌科（Ruminococcaceae）细菌的丰度显著下降。在种属水平，与其它三个组相比，多形杆状菌的相对丰度在用DSS处理的Fut2ΔIEC小鼠中上升（图5d）。

由于肠道微生物的组成与其功能紧密相关，我们接着采用对于粪便的非靶标代谢组学分析调查了消化道菌群的功能。值得注意的是，代谢组学分析显示与WT的DSS粪便相比，胆碱代谢和甘油磷脂代谢通路在Fut2ΔIEC小鼠DSS粪便中显著上升（图5f）。这些数据表明肠道微生物功能在WT小鼠和Fut2ΔIEC小鼠间具有一定差异。我们进一步分析了两个增强通路中的代谢产物并发现与WT小鼠相比，Fut2 ΔIECDSS小鼠LPC水平出现上升（图5g，h）。不仅如此，PICRUST2分析表明磷脂酶A（PLA），一种生产LPC的微生物酶类，在采用DSS处理的Fut2ΔIEC小鼠中显著富集（图5i）。相关性分析表明LPC的浓度与4种革兰氏阴性细菌—大肠杆菌，嗜胆菌属，肠蠕虫属以及高氏杆菌属（表1和附件1，图S2c）。这些细菌的相对丰度在Fut2ΔIECDSS小鼠中上升（图5e）。相关性分析表明LPC浓度与促炎性细胞因子相关，同时与紧密连接蛋白呈现负相关（见表1和附件1，图S2a, b）。

总之，这些数据证明了肠道菌群的结构和一些代谢通路在WT和Fut2ΔIEC小鼠之间存在差异，同时当暴露于DSS中时，相比WT小鼠，更多的LPC在Fut2ΔIEC小鼠中产生。

图5 在Fut2 ΔIEC小鼠中的肠道菌群及代谢组。 a 在4组中的α多样性（Chao1指数）。b β多样性中的非加权UniFrac距离的PCoA图。c, d 不同组微生物种属的相对丰度。e 在属的水平的微生物相对丰度。f 暴露于DSS后WT小鼠相对Fut2ΔIEC小鼠代谢产物的增加。g 在DSS组中WT小鼠和Fut2ΔIEC小鼠不同代谢物的火山图。h 4组中粪便LPC的水平。i 4组中PLA的水平。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有板块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

表1 相关性分析

6 来自Fut2 ΔIEC小鼠的消化道菌群促进了LPC的产生，并使结肠炎恶化

为了证实LPC的产生与消化道菌群有关，进行了FMT。正如图6a所示，小鼠（FMT-F组）比接受了来自WT小鼠（FMT-WT组）的粪便微生物表现出更多的体重减轻。较高的DAI评分（图6b）（P = 0.014）降低了结肠长度（P = 0.049）（图6c，d）并且在FMT-F组中被观察到。结肠切片的H&E染色在FMT-F小鼠中比FMT-WT小鼠表现出更严重的结肠炎。另外，免疫荧光染色表明与其他组相比，来自Fut2 ΔIEC小鼠的粪便微生物降低了ZO-1和闭塞素在结肠中的表达（图6f）。通过Western blotting方法检测到促炎性因子TNFα（P = 0.0005）和IL-1β（P = 0.0012）在FMT-F组中被检测到（图6g）。最为重要的是，FMT-F小鼠的粪便LPC浓度比FMT-WT小鼠更高（P = 0.042，图6h），这证实了LPC和消化道菌群之间的关联。

 图6 Fut2 ΔIEC小鼠肠道菌群促进了LPC的产生，加剧了结肠炎。a 此过程中FMT-WT组和FMT-F组小鼠体重的变化。b 对于两个组的DAI评估。（C,D）来自每组小鼠的结肠长度。e 结肠切片的代表性的H&E染色图。f 每组中采用ZO-1（绿色），和闭塞素（红色）染色的结肠组织的免疫荧光图（比例尺，100μm）。g 结肠组织中TNF-α，IL-1β的蛋白质水平。GAPDH被用于上样对照组。（H）每组中LPC小鼠的粪便浓度。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有版块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

7 LPC恶化了DSS诱导的肠炎     为了确定LPC是否能够恶化DSS诱导的肠炎，WT小鼠被随机分为两组。并且上述两组被暴露于1%的DSS饮用水中7天，同时DSS + LPC组中的小鼠也通过灌肠的方法被给予LPC（40mM，溶解于PBS）7天，1日1次，同时DSS + PBS组作为对照组被给予PBS。正如图7a所示，与仅采用DSS处理的小鼠相比，DSS + LPC小鼠在试验结束时表现出显著高的更多的体重丧失（P = 0.047）（图7c，d），这在DSS + LPC组中被观察到。结肠组织的组织病理学分析（图7e，f）（P = 0.007）证实了该结果，即LPC加剧了DSS诱导的结肠炎。总之，LPC加剧了DSS诱导的结肠炎。

图7 LPC加剧了DSS诱导的结肠炎。 a 在疾病过程中小鼠的体重变化。（B）两组小鼠疾病活性指数（DAI）评估。c, d 每组小鼠结肠的长度。（E）采用H&E染色的来自结肠组织的顺序切片。f 每组小鼠结肠的组织病理学评分。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有板块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。8 LPC 增加了体内和体外的炎性反应

炎性反应是评估结肠炎严重性的重要指标，所以我们检测了采用DSS + PBS和DSS + LPC处理的小鼠结肠组织促炎性细胞因子的mRNA和蛋白质水平。采用LPC处理后，tnf-α（P = 0.046），il-1β（P = 0.002），ccl2（P = 0.006）以及ccl3（P = 0.019）的mRNA表达在小鼠中增加（图8a）。TNF-α（P = 0.021），IL-1β（P = 0.006）在DSS + LPC小鼠中的表达比DSS + PBS小鼠中高2-3倍（图8b，c）。不仅如此，与DSS + PBS小鼠相比，血清中LPS的水平升高（P = 0.011，图8c）。在体外，相比采用无DMSO处理的细胞，采用LPC（50μM）处理12h的Raw 264.7细胞表现出包括tnf-α，il-1β，ccl2以及ccl3促炎性细胞因子的显著增加。ccl4和ccl5（P = 0.002）的mRNA水平（P = 0.001）在DMSO + LPC组中也被检测到显著的升高（图8e）。同时，采用LPC处理的Raw 264.7细胞分泌出更多的促炎性因子TNF-α（P = 0.015）以及IL-1β（P = 0.004）也通过ELISA被检测到（图8f），LPC促进了结肠炎症响应。

图8 LPC增加了体内和体外的促炎性细胞因子。 a 结肠组织中 tnf-α, il-1β, ccl2, ccl3 通过qPCR进行检测（n = 6每组）。b, c tnf-α, il-1β在结肠组织中的蛋白质水平。GADPH被用于对照。f TNF-α和IL-1β在Raw 264.7细胞在存在和缺乏LPC的上清液中的水平采用ELISA进行检测（n = 5每组）。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有板块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。   9 LPC损伤了体内和体外的紧密连接      为了进一步确定LPC对于上皮屏障完整性的作用，ZO-1和闭塞素的mRNA和蛋白质水平。相比DSS + 小鼠，上述蛋白水平在DSS + LPC小鼠中显著较低（图9a-c）。对于结肠组织的免疫荧光染色证实了ZO-1和闭塞素的表达受到LPC的损害（图9d）。杯状细胞的数量在DSS + LPC小鼠中与DSS + PBS小鼠相比显著降低，粘膜厚度也表现出相同的趋势（图9e，f）。相应的，在体外，两个组的TEER，DMSO组和DMSO + LPC组采用Caco-2细胞在不同时间点进行度量（0,12,24h）。在实验开始，在两组之间无差异。但是，在12和24小时处理后，DMSO + LPC的TEER组与DMSO组相比显著的下降（P = 0.0003和0.0006）（图9g）。不仅如此，用LPC处理的caco-2细胞中的ZO-1和闭塞素的mRNA和蛋白质水平是其他组的一半（图9h，i，j）。ZO-1和闭塞素的免疫荧光结果显示出caco-2细胞间的紧密连接当采用LPC处理时被破坏（图9k）。所有上述数据证实了LPC能够损伤肠道屏障的功能。

图9 LPC损伤体内和体外的肠道屏障。 a mRNA的相对水平，b, c在结肠组织中闭塞素和ZO-1的蛋白质表达。GADPH为一个对照。d 每组中采用ZO-1（绿色）和闭塞素（红色）进行染色的结肠组织的典型免疫荧光图（比例尺，100μm）。e, f 采用AB/PAS染色的结肠组织以及来自两组杯状细胞数量的典型图像（比例尺，100μm）。g 采用LPC处理和未处理的Caco-2细胞的TEER。（H）两组采用LPC处理的ZO-1和闭塞素在caco-2细胞中的mRNA表达水平。k 每组中具有ZO-1和闭塞素的Caco-2细胞的免疫荧光图像（Z轴和XY轴）。数据采用平均值 ± SEM（n = 5每组）。这些数据来自三个独立的试验。对于所有板块：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。  

讨论

在当前的研究中，Fut2表达的下降以及结肠中α-1,2-岩藻糖基化在患UC和CD的病人中被观察到。不仅如此，我们证实了Fut2在肠道上皮细胞中的缺乏加剧了结肠炎，包括促进了促炎性细胞因子的释放和上皮屏障的损伤。Fut2 ΔIEC小鼠肠道细菌的多样性和组成的改变以及LPC的产生在暴露于DSS时增加。FMT试验证实了肠道微生物菌群作用于LPC的产生，促进了结肠炎症。关联性研究表明LPC与促炎性细胞因子正相关，同时与紧密连接蛋白的表达负相关。最终，LPC被证明增加了促炎性细胞因子并且损伤了体内和体外的上皮屏障。Fut2在IBD易感性中的作用是从结构上和功能上调控肠道微生物菌群，并因此改变LPC的产生，这些LPC被证实加剧了结肠炎。

在我们的研究中，我们揭示了α-1,2-岩藻糖基化在患CD和UC病人结肠上皮中的下调表达。已有的研究报道了Fut2和CD易感性之间可能的相关性，但是在UC的病例中无相关报道。根据我们的发现，Fut2不仅在CD中而且在UC中可能是一个风险的遗传位点。小肠上皮细胞中基因的改变可能会改变细胞本身，影响消化道和其他器官之间的相互作用，或影响肠道菌群。由于Fut2的一个重要功能是促进肠道粘膜中岩藻糖基化寡聚糖链的合成，这些粘膜可作为肠道细菌结合位点和碳来源，消化道菌群在我们的试验中也被进行了研究。

与WT对照组小鼠相比，消化道菌群的多样性在无DSS的缺乏Fut2 ΔIEC小鼠中表现为下降。Tong M等发现Fut2与消化道菌群的组成有关。他们分析了从39个健康个体（12SeSe，18Sese以及9sese）的盲肠和S形结肠中收集的样本，并且发现非分泌者的结肠微生物群落（sese）发生了改变。在我们的研究中，想到消化道菌群的变化，在缺乏DSS的WT和Fut2 ΔIEC小鼠的结肠炎和屏障功能都无变化。因此，我们想了解Fut2 ΔIEC小鼠是否对试验性的DSS诱导的结肠炎易感。

当采用DSS处理时，Fut2 ΔIEC小鼠消化道菌群的多样性比WT小鼠显著降低。其组成也发生了变化，特别是肠道菌群的有益成员，比如相比WT小鼠的Fut2 ΔIEC小鼠疣微菌科和脱疏孤菌科成员数量的下降。不仅如此，FMT试验证实了来自Fut2 ΔIEC小鼠的消化道菌群对于大肠炎易感性的增加。这是首次在DSS模型中研究Fut2 ΔIEC小鼠的变化。肠道菌群的扰动在加重Fut2 ΔIEC小鼠肠道损伤中发挥了重要的作用。

    肠道菌群的组成与其功能紧密相关并影响宿主代谢已被证实。本研究中代谢产物分析表明与其他三个组相比LPC，在Fut2 ΔIECDSS小鼠中显著增加。不仅如此，FMT试验揭示了消化道细菌与LPC具有相关性。LPC对于动脉粥样硬化中巨噬细胞的作用已被广泛研究，但是其对于结肠炎的效应的报道较少。本研究检测了采用LPC处理的小鼠的促炎性细胞因子并揭示了LPC能够促进促炎性细胞因子在结肠中的释放。在体外，检测到采用LPC处理的Raw 264.7细胞可释放更多的促炎性细胞因子。C Tagesson等采用大鼠模型评估了LPC对于肠道通透性的效应，并且发现LPC可能损伤了回肠的粘膜细胞。本研究发现采用LPC处理的结肠上皮细胞的紧密连接不论在体内和体外都被损伤。LPC加重了Fut2 ΔIEC小鼠的结肠炎症和上皮屏障损伤。如果LPC的产生量下降，结肠中的上皮屏障和炎症将会减轻。

理所当然的，当前研究中有一些局限性需要被考虑。虽然我们发现Fut2在CD和UC中下降，但仍需要更多的数据对此结论进行确认。所以下一步需要开展人体方面的试验去证实我们的结果。

结论

    总之，在当前的研究中，我们首次构建了Fut2 ΔIEC小鼠模型研究Fut2在IBD中的作用。我们证实了肠道上皮特异的Fut2缺乏通过肠道微生物菌群的调控和LPC的产生增加了IBD的易感性。这些数据为未来研究提供了方向以提高肠道岩藻糖基化作用或降低LPC在IBD中的产生，特别是在具有Fut2基因缺陷的个体中。