肠道菌群失调导致肾结石疾病

2021
11/12

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医学镜界
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Abstract

   肾结石(KSs)的形成和理化特性与饮食密切相关。鉴于中西方人群在种族和饮食构成方面的差异,本研究旨在调查中国肠道菌群失调与 KS 之间的关系。目前的研究,检查了 KS 疾病 (KSD) 和健康对照组 (HLT) 之间肠道微生物的差异,并使用 Student t 检验或单向方差分析确定了基于 16s rRNA 基因扩增子的统计,具有统计学显着差异。此外,草酸钙KS (COKS)、尿酸KS (UAKS) 和碳酸磷灰石KS(CCKS) 组进行了比较与非参数统计检验。通过使用下一代测序分析 16s rRNA 标记基因序列来确定细菌丰度。与 HLT 组相比,KSD 组的厚壁菌门 (F) 和拟杆菌 (B) 水平显着更高(B/F=0.67 对 0.08;P<0.001),B 的总体水平也是如此(与 HLT 组相比高 6.19 倍) HLT 组;22.2 与 3.6%;P<0.001)。与 HLT 组相比,KSD 组中的 Prevotella-9 丰度水平高 4.65 倍(8.8% vs. 1.9%;P<0.001)。KSD 组的 Blautia 和 Lachnoclostridium 水平显着降低(13.3 对 6.0%;和 5.0 对 7.9%;均 P <0.05)。此外,与钙质 KS(COKS 和 CCKS)相比,非钙质 KS (UAKS) 中的 Prevotella-9 水平更高。因此,本研究的结果表明特定 KS 成分与肠道菌群之间存在关键关联,为 KS 的新治疗方法提供了理论基础。此外,这些细菌之间的差异和相互作用可以初步预测特定类型的尿石症。

关键词:肠道菌群失调,肾结石病

Introduction

    肾结石(KS)病(KSD)是最常见的泌尿系统疾病之一。在西方国家,5-10% 的人口在其一生中经历了≥1 次尿路结石发作 (1,2)。KSD 是由多种原因引起的代谢紊乱的结果,但其确切的发病机制仍然难以捉摸。遗传变异、饮食习惯和地理分布都有助于形成 KS (3),其中饮食是一个重要因素。全球不同地区和饮食文化导致结石成分复杂多样,包括草酸钙、磷酸钙、碳酸钙、胱氨酸结石和尿酸结石 (2,3)。通过改用低蛋白和低盐饮食,以及增加水果、全麦谷物纤维和镁的摄入量,可以降低 KSD 的发病率 (4-6)。

      饮食习惯和食物种类会直接影响肠道微生物。许多研究 (2,3,5,7-15) 报道肠道微生物可以参与生理和病理生理过程中,涉及的分子的合成和代谢分解,包括短链脂肪酸、氨基酸、维生素、神经递质和激素。由于肠道菌群失调引起的代谢物变化或免疫反应的诱导可能有助于调节各种疾病。例如,肠道细菌分泌的短链脂肪酸影响外来物质的代谢、支链氨基酸转运、氧化应激和调节肥胖和糖尿病的粘蛋白降解机制 (7-13)。在肠道代谢过程中,过量摄入胆碱或肉碱会产生三甲胺 (TMA),进而产生 TMA N-氧化物 (TMAO)。TMAO 的存在促进血小板活化,并增加动脉粥样硬化的发生率 (14-16)。因此,阻断肠道 TMA 代谢酶可显着抑制动脉粥样硬化斑块的形成 (15)。这些发现表明肠道微生物紊乱可能是疾病发作的原因,而不仅与疾病症状有关。

       Stern等(2)采用16s RNA法测定23例KSs肠道微生物的存在,发现实验组拟杆菌和普氏菌水平显着升高。此外,Suryavanshi 等 (17) 报道,与健康对照组 (HLT) 相比,KSD 组粪便中的草酸杆菌水平较低,并且在草酸代谢紊乱的 KSD 患者中观察到这种较低的丰度和草酸钙成分。上述结果表明,西方人群中的草酸钙结石可能是由 i) 肠道菌群失调与 KSD 发病率密切相关,以及 ii) 肠道中草酸杆菌水平低引起的。由于中西方人群的饮食不同,KSs表现出显着的多样性和不显着的分布特征,因此,不同的肠道细菌疾病是否会导致不同类型KSs的形成尚不清楚。因此,本研究的目的是分析中国东北地区 KSD 和 HLT 受试者肠道菌群的多样性,并进一步分析草酸钙 KS(COKS)、尿酸 KS 患者肠道菌群和基因丰度的变异性。UAKS) 和碳酸磷灰石 KS (CCKS),以研究不同类型的 KS 与肠道菌群失调之间的关联。本研究的结果可以通过饮食控制肠道菌群、KS 的精确医疗和相对具有成本效益的简单肠道菌群测序分析与饮食干预相结合来设计 KS 预防治疗。

材料和方法

伦理声明

本研究的方案经哈尔滨医科大学第二附属医院伦理委员会批准(批准号:2015-yan-221),并符合赫尔辛基世界医学协会关于人类受试者研究伦理行为的宣言。该研究是按照批准的当地指南和法规进行的,并获得了所有参与者的书面知情同意。

病人

该研究涉及 91 名 KSD 患者(年龄,26-80 岁;48 名男性患者和 43 名女性患者),其中 42 名患有 COKS,12 名患有 UAKS 和 18 名患有 CCKS,以及 75 名 HLT(年龄,21-85 岁;44 名男性患者)患者和 31 名女性患者)。结石样本仅从接受经皮肾镜取石术治疗的患者身上收集。无法从接受钬激光碎石术治疗的其余患者身上收集结石样本。参与者在禁食 6 小时后提供血液样本(5 毫升)、尿液样本(10 毫升)和粪便样本(使用无菌冷冻管)。新鲜样品储存在 -80°C 的冰箱中直至分析。所有样本均来自未接受胃肠手术且未使用抗生素的个体。KSD 患者包括新发和复发性 KS 患者。所有结石成分类型均已注册。结石的分类是基于比例最大的成分 (18)。HLT 参与者在过去一年内未使用药物,并且在过去 2 周内接受过胃肠手术或接受抗生素治疗的参与者被排除在外。通过两种手术方法收集样品,经皮肾镜取石术和钬激光碎石术。成功采集患者的结石标本,并通过经皮肾镜取石术进行结石分析。然而,钬激光碎石后结石被分成1-2mm大小而未能成功收集,这也是样本不完整的原因。

肠道微生物组分析

将粪便样本 (100 µl) 收集在标本转运培养基 (Qiagen, Inc.) 中,并使用两种方法提取微生物组 DNA,使用基于珠打的 PowerSoil DNA 分离试剂盒 (MO BIO Laboratories, Inc.) 和化学裂解法基于 QIAamp DNA 迷你试剂盒 (Qiagen, Inc.),遵循制造商的协议。完成后,将纯化的 DNA 在 100 µl 洗脱缓冲液 (pH 8.0) 中冲洗,并使用 Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 测量其浓度。如前所述 (19),微生物组 DNA 使用跨越 16s rRNA 基因 V4 可变区的条形码引物进行 PCR 扩增。来自所有样品的条形码 PCR 产物以大约相等的 DNA 摩尔浓度合并,并在 Illumina MiSeq(Illumina Inc.)上由 Albert Einstein Epigenomics Shared Facility 使用配对末端读数进行测序。

根据先前描述的方法 (20-23) 处理短 Illumina 读数以进行操作分类单元 (OTU) 分类。微生物群落的组成在属水平上按比例进行总结。

统计分析

一组中所有样品的 OTU 结果如图 1 所示,并且基于单个 OTU。物种的相对水平用 GraphPad 软件(第 6 版;GraphPad Software, Inc.)绘制。从标本和样品生成热图。未配对学生 t 检验用于确定组之间的显着差异。P<0.05 被认为表明有统计学显着差异。χ2 检验用于比较 KSD 和 HLT 组之间的主要肠道菌群类型。 


Figure 1.

KSD 和 HLT 组之间肠道菌群丰度的差异。(A) 使用 GraPhlAn 和 OTU 表显示了来自 KSD 组的 75 个样本的 OTU 结果。(B) 来自 HLT 组的 91 个样本的 OTU 结果使用 GraPhlAn 和 OTU 表呈现。(C) KSD 和 HLT 组在属水平上肠道菌群的前十名差异。KSD,肾结石病;HKT,健康对照;OTU,操作分类单位。

   为了确定实验组和对照组的主要肠道菌群类型,将年龄、性别、糖尿病 (DM) 的存在和体重指数 (BMI) 添加到与拟杆菌属、假单胞菌属和 Blautia 相关的 KSD 的独立逻辑回归模型中。未配对学生 t 检验也用于比较拟杆菌、假单胞菌和 Blautia 与 DM、高血压和 BMI 的平均丰度水平。非参数检验用于比较 COKS、UAKS 和 CCKS 组。未配对的双尾学生 t 检验用于比较两组之间的差异。使用单向方差分析和 Tukey 事后检验进行多重比较。表 III 中使用的统计方法是方差分析(单向)和事后 Tukey 检验。所有检查均为双侧(P<0.05)。使用 SPSS v.20 (IBM Corp.) 对数据进行统计分析。

表三  COKS、UAKS 和 CCKS 结石组的临床特征。

Variable

COKS

UAKS

CCKS

P-value

Age, years

56.4±10.6

46.0±4.8

55.7±13.6

0.043

Sex




0.034

  Female

  9

6

15


  Male

33

6

  3


BMI

24.7±2.8

28.8±4.7

24.1±2.8

0.223

Urine pH

5.7±0.6

6.1±1.0

6.9±0.6

0.434

Biochemical index





  Ca

2.33±0.11

2.25±0.11

2.20±0.12

0.328

  P

1.10±0.16

1.04±0.15

1.17±0.12

0.651

  Mg

0.99±0.07

1.36±0.64

1.02±0.07

0.448

  TC

7.76±5.36

5.05±1.32

4.68±1.83

0.292

  TG

3.33±2.04

3.52±1.34

2.30±2.42

0.151

  HDL

1.44±0.37

1.02±0.24

1.29±0.53

0.471

  LDL

3.02±1.17

2.31±0.24

2.65±1.08

0.252

  CRP

7.25±9.21

4.77±3.97

8.41±7.81

0.439

数据表示为 n 或平均值 ± SD。使用方差分析(单向)和事后 Tukey 检验进行比较。粗体值表示统计显着性(P<0.05)。COKS,草酸钙肾结石;UAKS,尿酸肾结石;CCKS,碳酸磷灰石肾结石;TC,血清总胆固醇;TG,甘油三酯;HDL,高密度脂蛋白;低密度脂蛋白,低密度脂蛋白;CRP,C-反应蛋白。

Results

KSD与肠道菌群失调

从 91 名 KSD 患者和 75 名 HLT 受试者收集粪便样本(患者信息见表 I)。通过16s rRNA测序,共鉴定出178个属,对含量最高的前10个细菌进行统计分析。在门水平上,KSD 组中厚壁菌门和拟杆菌门的丰度最高。此外,HLT 组表现出较高的放线菌丰度水平(图 1A 和 B)。在属水平上,KSD 组中拟杆菌和普雷沃氏菌 9 的丰度最高,占所有细菌的 31%。与 HLT 组相比,KSD 组中拟杆菌的丰度更高(22.2% vs. 3.6%;P<0.001)。与 HLT 组相比,KSD 组的 Prevotella-9 丰度高 4.65 倍(8.8% vs. 1.9%;P<0.001)。HLT 组中含量最高的两种细菌是 Blautia 和 Lachnoclostridium,占总细菌的 21%(图 1C;表 II)。与 KSD 组相比,HLT 组的 Blautia 丰度高 2.12 倍(13.4 对 6.0%;P<0.001)。与 KSD 组相比,HLT 组中 Lachnoclostridium 的丰度高 1.58 倍(8.0 对 5.0%;P=0.013 图 1C;表 II)。Prevotella-9 的高丰度(OR=3.78;P<0.001)和 Blontia(OR=-3.04,P=0.002)和拟杆菌的低丰度(OR=6.86;P<0.001)是 KSD 组的独立影响因素根据多变量分析(表 II)。

表一KSD 和 HLT 组的主要特征。

Variable

KSD

HLT

P-value

Age, years

56.3±11.4

57.0±13.3

0.695

Sex



0.445

  Female

43

31


  Male

48

44


BMI

24.7±3.4

25.1±4.1

0.419

Comorbidities




  DM

11±12

10±13

0.810

  HTN

23±25

23±30

0.210

数据表示为 n 或平均值 ± SD。使用χ2 和Student's t 检验进行比较。KSD,肾结石病;HLT,健康对照;BMI,体重指数;DM,糖尿病;HTN,高血压。

表二 KSD 和 HLT 组在属水平上肠道菌群的前十名差异(丰度,%)。

Genus

Case

Control

P-value

Bacteroides

0.222±0.183

0.036±0.057

<0.001

Enterococcus

0.036±0.104

0.024±0.099

0.474

Prevotella_9

0.088±0.152

0.019±0.069

<0.001

EscherichiaShigella

0.057±0.097

0.049±0.104

0.623

Megamonas

0.023±0.054

0.018±0.074

0.633

Lachnoclostridium

0.050±0.043

0.080±0.094

0.013

Blautia

0.060±0.064

0.134±0.072

<0.001

Bifidobacterium

0.022±0.050

0.041±0.072

0.043

Pseudobutyrivibrio

0.060±0.071

0.066±0.063

0.530

Faecalibacterium

0.067±0.065

0.070±0.063

0.721

数据表示为平均值±SD。使用学生 t 检验进行比较。粗体值表示统计显着性(P<0.05)。KSD,肾结石病;HLT,健康对照。


不同类型的肠道菌群失调与不同类型的 KS 相关

    在 COKS、UAKS 和 CCKS 组中,CCKS 组的女性发病率最高(n=5;P=0.034;表 III)。结石的分类是基于最大成分比例(18)。入组患者多数住院时有尿路感染,但临床尿细菌培养未发现尿素阳性菌。COKS 和 UAKS 组的厚壁菌门(56.4 对 30.4%;P=0.029)和拟杆菌(36.2 对 62.6%;P=0.009)的丰度显着不同。在 CCKS 和 UAKS 组中,厚壁菌门 (59.5 vs. 30.4%; P=0.014) 和拟杆菌 (31.5 vs. 62.6%; P=0.006) 的丰度水平存在显着差异。COKS 和 CCKS 组之间厚壁菌门(56.4 对 59.5%;P>0.05)和拟杆菌(36.2 对 31.5%;P>0.05)的丰度没有显着差异(图 2)。



Figure 2.COKS、UAKS和CCKS组在门水平上肠道菌群丰度的差异。在三组之间进行分析后,创建了描述统计显着性的图表。*P<0.05。COKS,草酸钙肾结石;UAKS,尿酸肾结石;CCKS,碳酸盐磷灰石肾结石。

     在COKS、UAKS和CCKS组中,UAKS组中Prevotella丰度最高,COKS组中假丁酸弧菌和Lachnoclostridium丰度最高,Ruminococcus-2在UAKS组中丰度最低(图3)。此外,在含有钙的 COKS 和 CCKS 组之间没有发现细菌丰度的显着差异(所有 P>0.05;图 4)。Prevotella 丰度水平在不含钙的 UAKS 与含钙的 COKS 和 CCKS 组之间存在差异(分别为 32.2 对 8.6 和 2.0%;所有 P<0.005;图 4)。此外,COKS 和 UAKS 组之间假丁酸弧菌、毛梭菌、瘤胃球菌和梭状芽孢杆菌的丰度水平存在差异(分别为 7.7 vs. 2.9%、4.5 vs. 1.9%、1.4 vs. 0.2% 和 1.2 vs. 0.6%) ;所有 P<0.05;图 4)。Anaerotruncus、Tyzzerell-4 和Turicibacter 三个物种之间存在差异,但丰度水平非常低(数据未显示)。


Figure 3.在属水平上比较 COKS、UAKS 和 CCKS 组之间肠道菌群的热图。COKS,草酸钙肾结石;UAKS,尿酸肾结石;CCKS,碳酸盐磷灰石肾结石。



Figure 4.COKS、UAKS 和 CCKS 组之间肠道菌群丰度在属水平上的差异。在三组之间进行分析后,创建了描述统计显着性的图表。*P<0.05。COKS,草酸钙肾结石;UAKS,尿酸肾结石;CCKS,碳酸盐磷灰石肾结石。

      分析并比较了男性和女性之间胃肠道菌群的差异(表IV)。在门级分类下,KSD 组和 HLT 组之间的胃肠道菌群差异无统计学意义(均 P>0.05;数据未显示)。在属分类下,男性和女性在 KSD 组中观察到显着差异。在柯林斯氏菌、消化链球菌、萨特氏菌、巴氏杆菌、消化球菌、塞内加利单胞菌、丁酸单胞菌、嗜胆杆菌、瘤胃梭菌-9、副杆菌、莫吉杆菌和铜绿假单胞菌之间发现了统计学上的显着差异(所有 P<0.05;表 IV)。Collinsella (0.7 vs. 0.2%; P=0.031), Sutterella (0.3 vs. 0.1%; P=0.028) 和其他(数据未显示)的丰度水平非常低。在 HLT 组中,未鉴定的毛螺菌科、副普雷沃氏菌、嗜血杆菌、鞘氨醇单胞菌、瘤胃梭菌-1、链霉菌、约翰逊氏菌和无胆原体之间存在显着差异(均 P<0.05;表 IV),但丰度水平非常低(数据未显示) )。

表四。属分类下 KSD 组(男性,n=48;女性,n=43)和 HLT 组(男性,n=44;女性,n=31)的性别差异。

A, KSD groups


Taxonomy

Male

Female

P-value

Collinsella

427.631±946.67

115.771±226.548

0.031

Peptostreptococcus

2.501±5.772

0.491±0.883

0.021

Sutterella

84.771±132.766

207.531±334.135

0.028

Barnesiella

24.150±59.532

88.811±169.650

0.022

Peptococcus

1.791±3.175

0.671±1.796

0.040

Senegalimassilia

4.171±9.924

0.951±2.663

0.035

Butyricimonas

9.001±14.388

27.441±55.455

0.040

Bilophila

11.351±12.790

28.491±46.608

0.024

Ruminiclostridium-9

15.311±19.333

33.811±46.321

0.018

Coprobacter

  2.981±8.721

12.001±26.265

0.037

Mogibacterium

0.331±0.753

0.051±0.213

0.014

Cupriavidus

0.081±0.279

0.001±0.000

0.044


B, HLT groups


Taxonomy

Male

Female

P-value


unidentified-Lachnospiraceae

19.141±29.890

49.190±79.644

0.049

Paraprevotella

23.720±44.767

6.441±6.730

0.016

Haemophilus

28.741±72.885

4.130±5.780

0.033

Sphingomonas

0.261±0.658

0.031±0.177

0.038

Ruminiclostridium-1

0.140±0.351

0.001±0.000

0.013

Streptomyces

0.231±0.611

0.001±0.000

0.017

Johnsonella

0.161±0.433

0.001±0.000

0.018

Acholeplasma

0.121±0.324

0.001±0.000

0.024


最小测量丰度值为 1。使用 χ2 检验和学生 t 检验进行比较。粗体值表示统计显着性(P<0.05)。KSD,肾结石病;HTL,健康控制。

Discussion

      KSs 的组成复杂多样,致病机制受多种因素影响,其中饮食是影响 KSs 形成的最重要因素 (4-6,24,25)。种族和饮食结构的差异显着影响肠道生态系统的组成和功能 (26-29)。本研究表明,KSs 患者有肠道菌群失调,COKS 患者的草酸杆菌水平上调。然而,在其他 KSD 患者中,特定细菌的流行率并不明显。本研究分析了 KSD 患者胃肠道细菌的差异,并对细菌丰度和 KS 的具体组成进行了进一步的比较分析。

     KS形成的机制是复杂的。多种结石成分有助于易感基因控制下的代谢调节 (30)。与其他研究人员 (4-6,25) 类似,目前的结果表明,饮食是影响肾结石形成的最重要因素之一。内源性和外源性草酸代谢紊乱导致 COKS 的形成,其中草酸杆菌是最重要的促成因素之一 (17)。很少有研究报告其他类型的导致胃肠道疾病的细菌与 KS 的形成有关。

    推测代谢产物和肠道细菌定植的异常变化可能触发黏膜免疫炎症机制,当存在肠道菌群失调时,可能会导致机体肾功能的进一步变化。当肾结石成分水平升高时,会发生肾小管上皮损伤、炎症反应和结石易感基因调控,最终导致 KS 形成 (31,32)。

     KSD的高发病率和复发率可能与种族和饮食密切相关;因此,研究肠道菌群失调的变化很重要 (33)。在本研究中,KSD 组中拟杆菌和普氏菌的丰度显着高于 HLT 组(分别为 6.1 倍和 4.6 倍)。所得结果的趋势与 Stern 等人 (2) 报道的趋势一致(分别为 6.1- 对 3.4 倍和 4.6- 对 2.8 倍),差异可能是由于种族和饮食文化的差异招募的患者中。此外,与 HLT 组相比,患者的 Lachnoclostridium、Blautia 和双歧杆菌分别高 1.5、2.1 和 1.9 倍。

进一步分析了 CCKS、UAKS 和 COKS 组之间的差异。与 HLT 组相比,KSD 组中未发现草酸杆菌的丰度水平低,这与 Suryavanshi 等人的发现一致 (17)。然而,在本研究中,这两组之间没有观察到草酸杆菌水平的统计学显着差异,但含钙COKS和CCKS组与不含钙UAKS之间的Prevotella-9丰度存在显着差异。Prevotella-9 与血清尿酸水平呈正相关,而 UAKS 是尿酸代谢紊乱的产物 (34)。因此,有人提出异常高丰度的 Prevotella-9 可能导致尿酸结石的形成。然而,应该指出的是,Stern 等人 (2) 在比较尿酸和非 UAKS 时没有发现细菌的任何显着差异,这可能归因于研究人群的日常高纤维饮食。此外,在本研究中,在 COKS 和 UAKS 组之间观察到 Pseudobutyrivibrio、Lachnoclostridium 和 Ruminococcus 2 的丰度水平存在差异,所有这些都属于幽门螺杆菌家族。主要代谢物之一是短链脂肪酸,它参与身体的新陈代谢 (35) 和炎症反应 (36,37)。推测存在于肠道菌群失调中的细菌可能通过尿酸短链脂肪酸代谢紊乱干扰人体正常的炎症反应和物质代谢,最终导致肾脏中钙和UAKS的形成。

      一般来说,肠道微生物群的组成会随着年龄、饮食和药物使用而变化,并且因种族和地理区域而异 (2,3,5,8,17)。由于 Oxalobacter forigeneses 在肠道中代谢草酸盐,因此假设 Oxalobacter forigeneses 的丢失是产生 COKS 的一个因素。然而,几项研究对这一假设的有效性提出了质疑 (2,38)。结石形成的机制尚未完全阐明。需要进一步广泛的基础研究和临床数据进行确认。尽管居住在同一地区的个人倾向于食用相似的食物,但个人饮食差异也会影响统计结果 (4,6)。现在的研究随机招募了 KSD 和 HLT 组的参与者。收集到的结石大多是混合成分。主要结石成分基于红外光谱分析。在本研究中,参与者没有严格控制日常饮食。由于部分患者选择钬激光碎石术,部分患者不同意进行结石成分分析,因此 COKS、UAKS 和 CCKS 组的患者数量不足以建立统计学意义。

      综上所述,此研究表明特定 KS 成分与肠道菌群之间存在关键关联,为 KS 的新型治疗策略提供了理论基础。此外,本研究的结果表明细菌之间的差异和相互作用可能预测特定类型的尿结石的发生。


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关键词:
肠道菌群失调,肾结石,导致,丰度,差异,饮食

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