科研 | mSystems：间歇性缺氧和高碳酸血症改变肠道微生物组和代谢组的昼夜节律

导读  

阻塞性睡眠呼吸暂停(Obstructive sleep apnea, OSA)以间歇性缺氧和高碳酸血症(Intermittent hypoxia and hypercapnia, IHC)为特征，并影响肠道微生物组和代谢组的组成。肠道微生物组具有昼夜振荡的特性，在调节昼夜节律和整体代谢稳态中起着关键作用。因此，我们假设IHC对关键微生物科和代谢产物的肠道动力学产生不利影响。本研究的目的是确定Apoe-/-小鼠在IHC条件下，暴露一周后粪便微生物组和代谢组的日动态。单独饲养10周大的食用致动脉粥样硬化饮食的Apoe-/-小鼠被分为两组。一组每日暴露于IHC条件下10 h(授时因子时间为2 [ZT2]至ZT12)，另一组维持在室内空气中。IHC条件启动后6天，每4 h采集一次粪便样本，连续采集24 h(6个时间点)。我们进行了16S rRNA基因扩增子测序和非靶向液相色谱-质谱(LC-MS)来评估微生物组和代谢组的变化。IHC诱导了肠道微生物组和代谢组的全球周期性动态变化。瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、S24-7和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)的昼夜振荡变化最大。在代谢组中，胆汁酸、甘油脂(磷酸胆碱和磷酸乙醇胺)和酰基肉碱受到很大影响。这些结果的多组学分析表明，瘤胃菌科和牛磺-β-霉素酸(TβMCA)的共发生与IHC条件相关，而红蝽菌科和鹅去氧胆酸(CDCA)的共发生与对照条件相关。IHC显著改变了粪便微生物组和代谢组的日动态，增加了促炎和致动脉粥样硬化的代谢物，而减少了保护性代谢物。

论文ID

原名：Intermittent Hypoxia and Hypercapnia Alter Diurnal Rhythms of Luminal Gut Microbiome and Metabolome

译名：间歇性缺氧和高碳酸血症改变肠道微生物组和代谢组的昼夜节律

期刊：mSystems

IF：6.496

发表时间：2021.6.29

通讯作者：Amir Zarrinpar

通讯作者单位：美国加州大学圣迭戈分校

DOI号：10.1128/msystems.00116-21

实验设计

结果

1 IHC改变了肠道微生物群的组成

为了确定OSA对肠道微生物组的早期影响，我们使用了容易发生动脉粥样硬化的Apoe-/-小鼠模型，并将半数小鼠暴露于IHC条件下，而对照组小鼠暴露于室内空气中。由于实验小鼠是单独饲养的，笼子效应不是一个混杂变量。我们的分析显示在子操作分类单元(sOTUs)有很大的重叠(图1A)，两组之间共有183个sOTUs。这些重叠的sOTUs占空气对照组总sOTUs的56%，占IHC处理组总sOTUs的69%。空气对照组比IHC处理组具有更多的sOTUs(经Mann-Whitney U 检验P = 0.053)(见补充材料中图S1A)。此外，空气条件下的小鼠总体上比IHC条件下的小鼠具有更高的Faith’s系统发育α多样性(经KruskalWallis检验P = 0.040)(图S1B)。这一发现尤其适用于授时因子时间18 [ZT18]，其中α多样性值在两组之间差异最大(经Mann-Whitney U检验P = 0.015)。肠道微生物群落的多样性，如由Faith’s系统发育多样性所测量的，以前一直被用作微生物群落健康的替代测量方法。

加权UniFrac距离是衡量β-多样性的指标，两组在所有时间点上均存在显著差异(图1B;图S1C)(pseudo-F，6.776；经置换多变量方差分析[PERMANOVA]，P= 0.002)。对这些β-多样性距离的分析表明，黑暗期IHC的微生物组组成与光期的空气对照组更加相似(图1B和C)。成分分析表明，疣微菌科、毛螺菌科和S24-7是两种条件下所有时间点最普遍的微生物组的前三种(图1D)。S24-7科(“恒温菌科”是目前提出的名称之一)是拟杆菌门中一个相对较新的科，被认为参与碳水化合物代谢和其他功能。为了确定IHC是否破坏了腔内环境的日间动态，我们测定了具有日间丰度振荡的细菌科的比例(P＜0.05)。与对照组小鼠相比，IHC条件下的小鼠有大约三分之二的细菌科(空气，13%；IHC，8%)有日间振荡(图S1D)，这些科的序列占比更少(图S1E)。关于在sOTU水平上振荡变化的完整分解见补充材料中的表S3。因此，IHC在24小时内引起了腔内动力学的显著变化。这种腔动态变化的特征是整体循环的减少，其中IHC黑暗期的微生物组成更类似于对照小鼠的光期。我们没有看到节律性的显著变化。

图1 IHC影响肠道微生物群的周期性动态。(A)总体上每个队列中检测到的唯一非零sOTUs韦恩图。紫色表示常用的sOTUs。(B)样本加权UniFrac (β-多样性) PCoA。阴影表示不同的时间点。(C) UniFrac PCoA第一轴随时间的加权。实线表示该组的平均值，虚线表示单个老鼠。(D)前5个微生物科的比例丰度代表。仅暴露在正常空气条件下的对照样本显示为红色(n = 4;每只小鼠5到6个时间点)。IHC条件下的实验样本为蓝色(n = 4;每只小鼠5到6个时间点)。

2 IHC暴露导致每日肠道微生物组的破坏

为了更详细地研究IHC对微生物组日间动态的影响，我们对个体类群进行了随时间推移的研究。IHC诱导了微生物组组成的动态变化，这些变化在门水平上容易被检测到(图S2A至C)。拟杆菌门未可检测到周期性波动(图S2A)。在对照条件下，厚壁菌门存在周期性波动，在光照后期出现峰值(图S2B)，而疣微菌门存在周期性波动，在黑暗后期出现峰值(图S2C)。疣微菌门仅包含艾克曼菌的sOTU。然而，在IHC条件下，厚壁菌门减少，拟杆菌门增加，循环振荡(图S2A和B)。在IHC条件下，疣微菌门保持周期性振荡(图S2C)。然而，在光照和黑暗期，该门的相对丰度显著高于空气对照组(图S2C)。

接下来，我们分析了瘤胃菌科和毛螺菌科的循环动态，这是厚壁菌门中的两个与动脉粥样硬化形成相关的细菌科。在IHC条件下受到干扰的对照组小鼠中，瘤胃菌科(图S2D)和毛螺菌科(图S2E)都有周期性振荡。S24-7是拟杆菌门的一个细菌科，是唯一一个在IHC条件下比在对照条件下具有更强循环能力的细菌(图S2F)。特别是，在IHC暴露期间，S24-7的丰度显著增加，比在对照组条件下测量的丰度高出2-3倍。相比之下，毛螺菌科的相对丰度差异峰值出现在黑暗时期，在IHC条件下，该时期的丰度大约高出2倍。总的来说，IHC扰乱了可影响动脉粥样硬化表型细菌科的周期性动态。

  3 IHC改变粪便代谢组的组成

使用非靶向液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析的粪便代谢组的概述显示，两组之间有显著的分离(pseudo-F, 5.410；经置换多变量方差分析P＜0.001)(图2A;图S3A)。第2轴(10.9%)表示的数据变异性与第1轴(12.2%)几乎相似，随着时间的推移，两组间的分离更加清晰(图2B)。总体而言，IHC条件导致粪便胆汁酸(35%)以及甘油脂，如磷酸乙醇胺(57%)和磷酸胆碱(26%)的相对含量增加(图2C)。IHC暴露显著影响这些与动脉粥样硬化有关的个体代谢物的周期性动态(图2D和E;图S3B)。所有注释代谢物的列表可在补充材料的表S2中找到。

粪便代谢物的亚类分析表明，时间是代谢组差异的一个重要因素。例如，除熊去氧胆酸(UDCA)在光期变化最大外，IHC条件下小鼠和空气对照小鼠的胆汁酸在黑暗期差异最大(图2D)。在动脉粥样硬化中发挥重要作用的代谢物磷酸胆碱、磷酸乙醇胺和酰基肉碱在IHC条件下也会发生改变。在IHC暴露期间(即光期间)(图2E;图S3B)，IHC导致较高水平的磷酸胆碱(图2C和E)和磷酸乙醇胺(图2C;图S3B)。此外，IHC小鼠在黑暗期血红素分解衍生物、粪胆素和尿胆素水平也较高(图S3B)，这可能是肝脏代谢改变的迹象。总的来说，粪便IHC诱导了粪便代谢组学的整体变化，特别是已知的有助于炎症和动脉粥样硬化的次级代谢物。

图2 IHC影响粪便代谢组的周期性动态。所显示代谢物的完整注释和缩写列表见补充材料中的表S1。(A)代谢组学样本的Canberra PCoA。阴影表示不同的时间点。显著性由PERMANOVA测定。(B)第2轴随时间变化的Canberra PCoA。实线表示组的平均值，虚线表示单个老鼠。黄色方框为处理组IHC暴露时间。(C)按条件分离的主要代谢产物组饼状图。(D) 1级胆汁酸热图，使用基于对照的分层聚类组织。黄色表示处理组IHC暴露时间。其他3级胆汁酸见图S3C。(E)选择的磷酸胆碱热图，使用基于对照的分层聚类组织。热图中每个方格的值代表了该时间点所有小鼠在该条件下的相对丰度的平均值。热图在这两种情况下也进行归一化，并按标准比例放置，参考在中心，便于比较。#表示图4和图S4所示的代谢物。空气是红色的(n = 4;每只小鼠5到6个时间点);IHC为蓝色(n = 4;每只小鼠5到6个时间点)。4 在IHC条件下，粪便代谢组的日动态发生改变

我们对IHC可能加剧或预防动脉粥样硬化、影响昼夜节律或影响代谢稳态的腔代谢物的日间动态的影响进行了更详细的分析。胆汁酸是影响外周昼夜节律、宿主代谢和动脉粥样硬化的关键代谢物。脱氧胆酸(DCA)是一种促炎症的次级胆汁酸，在IHC条件下有昼夜振荡，但在对照条件下没有(空气，P = 1.000；IHC，P = 0.002)(图S4A)。在所有时间点，IHC条件下DCA的相对丰度均高于对照条件下，尤其是在黑暗期(P = 0.001)(图S4A)。已知通过法尼酯X受体(FXR)拮抗剂促进动脉粥样硬化发展的牛磺-β-霉素酸(TβMCA)，在IHC条件下小鼠的总体相对丰度较高(图S4B)。在IHC条件组小鼠中，光期TβMCA水平显著升高(P = 0.019)，而黑暗期差异仅接近统计学意义(P = 0.063)。TβMCA似乎有12小时的振荡而不是24小时的振荡。而动脉粥样硬化前的TβMCA在空气或IHC条件下没有周期性振荡(空气，P = 0.270;IHC, P=1.000)，抗动脉粥样硬化剂猪去氧胆酸(HDCA)在IHC下显示出日振荡，但在对照条件下没有(空气，P = 1.000;IHC, P = 0.002)(图S4C)。IHC条件下小鼠抗炎UDCA水平趋于降低;然而，这并没有达到显著性(图S4D)。总体而言，IHC和空气条件下的胆汁酸差异在黑暗期更为明显(图2D)。此外，随着促炎和促动脉粥样硬化胆汁酸水平的升高和抗炎胆汁酸水平的降低，IHC条件似乎使代谢组向对宿主有害的方向转移。

IHC对动脉粥样硬化重要的其他代谢物的循环动力学有显著影响，如酰基肉碱和甘油脂，包括磷酸乙醇胺和磷酸胆碱(图S5)。血清中高水平的长链酰基肉碱，如棕榈酰肉碱(图S5A)和油酰-L-肉碱(图S5B)可促进炎症和动脉粥样硬化。然而，在这两个生理周期内，IHC条件下小鼠的粪便棕榈酰肉碱水平均显著降低(光期，P = 0.013;黑暗期，P=0.017)(图S5A)。油酰-L-肉碱(另一种酰基肉碱)的总体水平也在IHC条件下的小鼠中降低，尤其是在昼夜节律的光期(光期，P = 0.053;黑暗期，P=0.761)(图S5B)。磷酸乙醇胺和磷酸胆碱是被血液吸收的主要促炎甘油脂衍生物。IHC条件下小鼠粪便中磷酸乙醇胺水平普遍升高，尤其是在光期(图2)。其中一种磷酸乙醇胺(LysoPE[18:1(9Z)/0:0] [1-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine])的水平在IHC条件下有强烈的日振荡(P＜0.001)，在光期更高(P＜0.001)(图S5C)。此外，在IHC条件下的小鼠中，磷酸胆碱的总体水平也增加了，特别是在光期(图2)。在我们的研究中，一种磷酸胆碱(PC(18:0/14:0) (1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine))的水平在IHC条件下表现出强劲的循环，而在空气条件下则没有(空气，P = 1.000；IHC, P = 0.002)，在光期升高(P = 0.013)(图S5D)。在其他磷酸胆碱中也可以看到类似的趋势(图S5E和F)。综上所述，我们的结果表明，IHC诱导了肠道代谢产物的快速变化。

  5 微生物组和代谢组的跨组分析揭示了瘤胃菌科和TβMCA之间的关键关系

接下来，我们评估了微生物科和代谢物之间是否存在特定的关系，它们单独与CVD的恶化有关。在使用微生物组数据进行多组分析时，一个特别的挑战是16S扩增子测序会产生总和约束归一化数据(即相对丰度)。因此，这增加了分析中第一类错误的可能性，并使错误发现率(FDRs)的测量变得困难。相对丰度值在不同的研究中会有显著的波动，这是由于人为差异造成的微生物序列总数(即总特征负载)。例如，当某一特定细菌科的相对丰度增加时，我们无法确定这是由于该科内细菌数量的增加还是其他科内细菌数量的减少。通过对这些分析使用对数比率，我们消除了由总特征负载造成的偏差，并可以使用先前建立的方法计算错误发现率。因此，这些基于对数比率的方法更有可能在独立进行的研究中产生可重复的趋势。

我们使用机器学习神经网络预测微生物代谢物相互作用的概率(mmvec)，以及多项对数回归微分排序分析(songbird)。该分析创建了微生物和代谢物同时出现的基于排序对数的条件概率，并确定了微生物组和代谢物数据之间的关系，然后使用单个对数比率进行验证。这项分析不仅揭示了哪些微生物和代谢物同时发生，而且还揭示了它们是否与IHC和对照条件之间的差异相关。

基于多重组学分析，鹅去氧胆酸(CDCA)和TβMCA是在IHC和对照条件下差异最大的两种胆汁酸(图3A)。与空气条件相关的CDCA与红蝽菌科共发生(图S2G)，与IHC条件相关的TβMCA与瘤胃菌科共发生(图3A和B)。通过绘制mmvec鉴定的微生物和代谢物，验证了其共发生状态(图3A和B)。最高差异共发生微生物和代谢物的对数比导致两种条件的分离。然而，还需要进一步的研究来确定这些关系是否具有因果关系。我们发现mmvec鉴定的代谢产物(对照条件下的CDCA和IHC条件下的TβMCA)与mmvec鉴定的微生物(对照条件下的红蝽菌科和IHC条件下的瘤胃菌科)的对数比具有显著相关(Pearson’s 相关系数，r = -0.539； R2  = 0.29；P＜0.001)(图3C和D)。因此，IHC暴露1周后，腔环境的周期性动态显示粪便微生物组和代谢组发生显著变化。通过TβMCA向FXR拮抗转变并与瘤胃菌科相关，与OSA相关CVD的病理生理学相关。

然而，相对丰度分析显示，在这些细菌科中，IHC与对照条件之间没有显著差异(图S2D和G)。为了确定总特征负载差异是否会影响这些结果，我们使用对数比率重复了对这两个细菌科的评估。对于这些对数比率的分母，我们使用了疣微菌科，因为它的普遍性和高丰度。差异排序分析预测(图3B)， IHC条件下小鼠瘤胃菌科与疣微菌科的对数比较高，尤其是在光期(图4A)。相反，在光照/失活期，空气条件下的小鼠红蝽菌科与疣微菌科的对数比更高(图4B)。IHC条件下，小鼠瘤胃菌科和红蝽菌科的对数比显示瘤胃菌科水平持续较高，而对照条件下小鼠的红蝽菌科相对水平较高(图4C)。

两种差异最大的胆汁酸(即CDCA和TβMCA)的对数比分析也显示IHC与对照小鼠之间存在明显差异。差异排序分析预测(图3A和B)，IHC条件下的小鼠粪便中TβMCA相对于CDCA的含量远高于对照条件下的小鼠(图4D)。有趣的是，CDCA是FXR兴奋剂，而TβMCA是FXR拮抗剂。FXR是一种胆汁传感器，可调节影响动脉粥样硬化的胆汁酸摄取、代谢和排泄。尽管mmvec分析没有识别出UDCA(一种具有抗炎特性的次级胆汁酸)与任何特定的细菌科或任何情况有关，但我们对这种次级胆汁酸重复了对数比分析。在这种情况下，与对照组相比，IHC条件下小鼠的动脉粥样硬化前胆汁酸TβMC相对于UDCA的含量要高得多(图4E)。

图3 通过mmvec分析确定有连锁表达水平的微生物和代谢物。(A) 基于songbird多项回归微分排序分析(x轴)的mmvec共发生分析(y轴)。除胆酸(CA)、CDCA和穆里多氧胆酸(MDCA)为3级注释外，胆汁酸一般鉴定为1级。(B) 对数条件概率热图，使用层次聚类法组织，列出差异丰度最高的4个微生物科和差异丰度最高的胆汁酸。粉色和绿色方框突出显示相关性值最高的前2个点。(C)图B中最上层相关微生物(x轴)和代谢物(y轴)的对数比。微生物对数比率的确定是：从sOTUs中属于瘤胃菌科的所有序列的数量除以从sOTUs中属于红蝽菌科的所有序列的数量。代谢物对数比率的测定是由CDCA的原始值除以TβMCA的原始值。(D)图B线性回归图使用相同的对数比，与最佳拟合线和阴影区域代表95%置信区间。对数比率是基于自然对数。仅暴露在正常空气条件下的对照样品显示为红色(n = 4;每只小鼠5到6个时间点)。IHC条件下的实验样本为蓝色(n=4;每只小鼠5到6个时间点)。完整的元数据可以在https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14614434的表S3中找到。

  图 4 关键微生物和代谢产物对数比的周期性动态。 其他选定的对数比 ( 自然对数 ) ，它们随时间的周期动态 ( 双线图 )( 上 ) ，以及它们按周期阶段分组的相对丰度 ( 箱形图 )( 下 ) 。 (A) 属于瘤胃菌科 sOTUs 的所有序列数除以属于 疣微菌科 sOTUs 的所有序列数的对数比。 (B) 属于红蝽菌科 sOTUs 的所有序列数除以属于疣微菌科 sOTUs 的所有序列数的对数比。 (C) 属于瘤胃菌科 sOTUs 的所有序列数除以属于红蝽菌科 sOTUs 的所有序列数的对数比。 (D) CDCA 的原始值除以 T β MCA 的原始值的对数比，这是在补充材料中图 S5B 中发现的两种差异最大的胆汁酸。 (E) UDCA 的原始值除以 T β MCA 的原始值的对数比。 实线表示平均值，误差棒表示平均值的标准误差。 单个 老鼠用虚线表示。 阴影表示房间灯关闭的时间 ( 即老鼠的活动 / 喂食时间 ) 。 黄色方块表示在 IHC 条件下小鼠暴露在实验条件下 (ZT2[ 采集后 ] 至 ZT12) 一天中的 10 小时。 使用 JTK 方法的 MetaCycle 来确定周期性。 *, P ＜ 0.05; **, P ＜ 0.01; ***, P ＜ 0.001; ****, P ＜ 0.0001( 通过非参数统计检验 ) 。 @ 表示由 MetaCycle (JTK) 确定的日振荡， P ＜ 0.05 。 仅暴露在正常空气条件下的对照样品显示为红色 (n = 4; 每只小鼠 5 到 6 个时间点 ) 。 IHC 条件下的实验样本为蓝色 (n = 4; 每只小鼠 5 到 6 个时间点 ) 。 对于可用对数比少于 3 的时间点，不设置误差条。  

讨论

在本研究中，我们证明了致动脉粥样化的Apoe-/-小鼠的微生物组和代谢组的组成和日间动态受到IHC条件的显著影响。尽管在本研究中使用的小鼠数量较少(n = 4)，但我们发现在不同的时间点，微生物科和代谢物都存在显著差异。IHC暴露导致次级代谢物的日振荡发生显著变化，而次级代谢物是动脉粥样硬化发病的关键因素。根据文献，目前尚不清楚振荡的增加或减少对疾病结果是否更重要。综上所述，IHC导致肠道微生物组和代谢组的昼夜不同步，促进促炎腔内环境，从而加剧动脉粥样硬化。此外，这表明胆汁酸信号和紊乱的外周昼夜节律可能是IHC诱导心血管风险增加的原因。

在小鼠和人类中进行的几项研究表明，破坏微生物组的昼夜稳态会对代谢产生影响。在人类中，时差引起的微生物组日动态中断导致无菌小鼠肥胖增加。最近，一项大规模的流行病学研究表明，微生物振荡的昼夜不同步与2型糖尿病有关。此外，这些不规律的微生物风险信号可以高度预测代谢性疾病。微生物组昼夜动态的破坏是肥胖和代谢不良动物模型的标志。在这项研究中，我们表明，肠道微生物组的日间破坏也是OSA临床前模型的一个标志。由于肠道微生物群是调节外周昼夜节律所必需的，OSA可通过诱导昼夜节律不同步而导致代谢异常。这一发现可以解释为什么在许多不同的生理系统中(如高血压和胰岛素抵抗)，OSA会增加心血管疾病的风险。

我们之前对OSA临床前模型的研究表明，IHC在Apoe-/-和Ldlr-/-两种不同的动脉粥样硬化小鼠模型上诱导了可重复的微生物组和代谢组变化。这些管腔改变可预测IHC暴露，并可潜在地用于突出动脉粥样硬化风险。尽管在开始每日IHC干预后仅1周就测量了微生物组和代谢组组成，但我们在本研究中发现了类似的变化。此外，由于这项研究仅仅集中在OSA和IHC的影响，我们使用了最明确的模型(致动脉粥样硬化饮食的Apoe-/-老鼠)，确定了加剧动脉粥样硬化的单一因素的影响(气体环境变化)以及是否影响肠道微生物组的动态。由于在我们的实验和对照条件下，遗传学和饮食都得到了充分的控制，因此没有必要将它们的影响与IHC的观察效果分开。虽然在动脉粥样硬化的背景下，基因和饮食对昼夜节律的影响尚未被研究，但一些研究表明，它们会影响肠道微生物组的昼夜动态。采用最佳实践指导原则进行实验，以最小化母性、建立者和笼效应。此外，所有小鼠均来自同一来源的体内、房间和母系(以减少母系影响);被驯化在共同饲养的笼子中(以控制建立者效应)；然后被伪随机地放入单独放置的笼子中(以控制笼效应)。

IHC使微生物组的组成发生变化，这些变化通常在代谢异常状态下观察到，包括特定细菌科的多样性和丰度的变化。在暴露1周内，IHC诱导的微生物多样性和丰富度降低。这一观察结果表明，IHC可能通过改变环境的微尺度，使腔内许多共生微生物无法生存。此外，这些变化不仅限于暴露于IHC的时间(即光照时间);即使在一天中动物没有接触IHC的时候，肠道微生物群也会发生全球变化。有趣的是，IHC的黑暗期菌群与对照小鼠的光期菌群组成更为相似。重要的是，在IHC暴露后的1周内，微生物群振荡的变化几乎立即发生，这证实了这种变化是IHC的结果，而不是需要10周才能形成的动脉粥样硬化表型。重要的是，这些变化可以对宿主的代谢健康产生持久而深远的影响。

以前的研究调查了肠道微生物组的日循环，使用了在24小时和48小时条件下收集的样本。虽然一般来说，使用48小时数据进行昼夜节律研究更可取，因为它减少了I型错误，但最近生物信息学工具的进步，如MetaCycle，允许对24小时昼夜节律数据进行严格分析。这使得研究人员可以从更有限的数据中确定昼夜/日循环，同时仍然减少I型错误。尽管这些工具是为转录数据而创建的，而不是微生物组数据，由于我们的工作最终复制和扩展了以前微生物组IHC研究的结果，并与每日微生物组研究一致，这些潜在的问题并不会显著影响解释。然而，对于比较24小时和48小时的每日微生物组数据，有必要进行更彻底的研究，以确定MetaCycle对这类数据是否像对转录数据一样可靠。

IHC显著影响肠道微生物组的日动态。疣微菌门，厚壁菌门和拟杆菌门，这些门组成超过90%的肠道微生物，都受到IHC条件的影响。在对照组小鼠中，涉及动脉粥样硬化相对丰富的科(瘤胃菌科和毛螺菌科)有昼夜振荡，但在IHC条件下小鼠中则失去了这种振荡。特别是，在黑暗期IHC条件下，小鼠中的毛螺菌科【一种与动脉粥样硬化前TMA N-oxide(TMAO)和血栓表型增加相关的细菌科】显著升高。IHC还导致了艾克曼菌的相对减少（是在哺乳动物肠道环境中发现的唯一一种疣微菌门微生物）。艾克曼菌对肠道屏障的完整性至关重要，它通过阻碍腔内化合物进入门静脉系统，帮助防止促炎状态。在以西式饮食喂养Apoe-/-小鼠的微生物组中补充这些物种可减少动脉粥样硬化病变。此外，IHC加剧了拟杆菌门S24-7科的振荡。在光期，该科的相对丰度显著增加。S24-7的一些细菌含有SpeB同源物，半胱氨酸蛋白酶，可以帮助这些细菌避免被免疫系统检测，并可能降解存在于粘膜层表面的保护性生物膜。总之，S24-7的增加和艾克曼菌的减少表明宿主粘膜层和肠道屏障功能的破坏。这些微生物组的改变是否是IHC诱发CVD疾病风险增加的唯一原因，还是代谢异常表型的加剧因素，值得进一步研究。

随着肠道微生物群的改变，IHC条件代谢组也随着促炎代谢物(尤其是胆汁酸)水平的增加而改变。一项对比分析表明，在IHC小鼠中，无论收集时间如何，黑暗期与光期的粪便样本中，促炎和促动脉粥样硬化胆汁酸(如DCA和TβMCA)的水平都较高。此外，动脉粥样硬化研究在光期收集粪便颗粒进行代谢组学分析，可能低估了它们在与IHC相关的CVD风险中的潜在作用。在IHC小鼠中，DCA发生昼夜振荡，与对照组相比，最显著的变化发生在黑暗期。粪便中DCA的升高会加剧全身炎症，在肠道屏障可能被破坏的情况下，IHC尤其有问题。TβMCA(一种自然发生的FXR拮抗剂)在IHC中也显著升高，特别是在IHC暴露期间。FXR在动脉粥样硬化发展和进展中的作用存在相互矛盾的证据，因此，这些促炎变化可能是保护性的，而不是致病性的。然而，在Apoe-/-小鼠中FXR的缺失会导致病变加重，提示在我们的OSA临床前模型中，FXR拮抗剂与过度的TβMCA在IHC条件下会导致CVD恶化。此外，抗炎和抗动脉粥样硬化胆汁酸(如UDCA)在IHC条件下降低。

IHC组和对照组之间胆汁酸水平的总体差异在黑暗期更为明显。此外，我们的跨组分析(mmvec +排名多项回归)揭示了与我们的实验条件相关的腔内微生物组成和腔内代谢物之间的关系，得出了有两个关键发现的条件概率。首先，瘤胃菌科的丰度与TβMCA共生。许多瘤胃菌科成员具有7α-脱羟基和7β -去氢基因，帮助他们进行胆汁酸生物转化。事实上，瘤胃菌科与粪便DCA水平呈正相关，它可能有助于产生7α-脱羟基。瘤胃菌科和TβMCA水平的升高与IHC暴露有关，进一步强调了这些条件下促炎、促动脉粥样硬化环境的存在。其次，我们的跨组分析发现，红蝽菌科的丰度与CDCA共发生。在对照条件下，红蝽菌科和CDCA水平的增加与小鼠有关。FXR激动剂与CDCA保护Apoe-/-小鼠血脂异常和动脉粥样硬化。需要进一步研究了解CDCA和红蝽菌科之间的联系。红蝽菌科被认为具有有益的代谢作用，包括抵抗肥胖和肝脏疾病。

胆汁酸并不是唯一受IHC影响的动脉粥样硬化相关代谢物。在IHC条件下，动脉粥样硬化前甘油脂(包括磷酸胆碱和磷酸乙醇胺)也显著增加。众所周知，磷酸胆碱是低密度脂蛋白(“坏”)胆固醇的组成成分，并与C-反应蛋白相互作用，促进炎症和动脉粥样硬化。IHC条件下，胆红素分解产物、固醇胆素和尿胆素的排泄增加可能是肝脏代谢异常的早期生物标志物。有趣的是，与对照组小鼠相比，IHC条件下的小鼠酰基肉碱水平在一天中的两个阶段都显著下降，这是我们测量到的在IHC化条件下减少的唯一前动脉粥样硬化代谢物。因为微生物组的变化表明肠道通透性增加，粪便中酰基肉碱水平的下降可能表明血清吸收增加，在那里它们会促进炎症并增加心肌梗死的风险，或者这可能表明IHC诱导的动脉粥样硬化不是由酰基肉碱驱动的。未来的研究需要确定粪便和血清酰基肉碱之间的关系，以帮助确定是否存在这种情况。

由于方法的限制，我们无法分别评估已知的促动脉粥样硬化小分子和抗炎小分子【如TMA(然后在肝脏当中转化为TMAO)和SCFAs】的水平和昼夜振荡。在对照小鼠和那些代谢异常表型的小鼠中已经记录了SCFAs的周期性波动，SCFAs可以影响肝脏外周昼夜节律。考虑到IHC对腔内环境日变化的影响程度，毫无疑问，这些代谢物也可能随着OSA而波动。综上所述，肠道微生物群振荡和不同类型代谢物的变化具有复杂的病理影响，需要进一步的研究。

因为IHC对腔内肠道微生物组和代谢组的振荡有显著影响，并且由于IHC由O2和CO2的相反方向同步变化组成，我们在这项工作中的结果表明，每个特定的气体变化可能会影响相关肠道微生物组的周期性。另一方面，管腔动力学的扰动表明养分有效性发生了改变。IHC可能会扰乱正常的喂养模式，很可能是因为这些小鼠的压力增加或睡眠不足所致。正常的进食模式对维持外周生物钟至关重要。限时摄食(TRF)是指通过只在活动时段巩固食物获取来维持正常的摄食模式，强制中枢和外周生物钟同步，并防止代谢异常表型在许多营养和非营养条件下，挑战代谢稳态。TRF是否能预防IHC诱发的心血管疾病尚不清楚。此外，了解肠道微生物组的胆汁酸修饰如何调节宿主代谢机制，将为IHC诱导的动脉粥样硬化的病理生理学提供有价值的见解。虽然有足够的证据表明胆汁酸信号在动脉粥样硬化中发挥重要作用，但是更好地了解细菌胆汁酸的生物转化及其对IHC诱导的发病机制的贡献将产生新的治疗靶点。由于本研究发现胆汁酸的变化主要集中在FXR的表达，未来的实验需要进一步研究胆汁酸受体(即FXR和TGR5)在IHC条件下介导的宿主动脉粥样硬化中的作用。重要的是，我们的研究清楚地表明了在实验设计中考虑样本收集时间的重要性，因为如果在单个时间点或仅在光期收集样本，我们在研究中观察到的许多差异可能会被忽略。