科研 | 川大：植物乳杆菌通过调节肠道微生物中的精氨酸代谢减少肾草酸钙结石（国人佳作）

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读   肾草酸钙结石是一种常见的肾脏疾病。减少这些结石形成的方法很少。然而，益生菌减少肾结石的潜力已经受到越来越多的关注。我们从中国传统奶酪中分离到一株植物乳杆菌N-1（Lactiplantibacillus plantarum N-1）。本研究旨在探讨N-1对肾CaOx晶体沉积的影响。将30只大鼠随机分为3组 : 对照组 (灌胃ddH2O)、模型组 [灌胃ddH2O并在饮水中添加1%乙二醇 (EG) ]和乳杆菌组 (N-1灌胃并在饮水中添加1% EG)。4周后，与模型组比较，N-1补充组肾脏晶体明显减少 (P＜0.05)。在回肠和盲肠中，对照组的乳杆菌 (Lactobacillus) 和凸腹真杆菌 (Eubacterium ventriosum) 相对丰度较高，N-1补充组的Ruminococcaceae UCG 007和Rikenellaceae RC9相对丰度较高。相比之下，模型组葡萄球菌(Staphylococcus)、棒状杆菌1 (Corynebacterium 1)、Jeotgalicoccus、嗜冷杆菌 (Psychrobacter) 和气球菌 (Aerococcus) 的相对丰度较高。我们还通过PICRUSt2预测模型组回肠菌群中精氨酸酶水平将高于N-1补充组。模型组回肠中精氨酸酶活性高于N-1补充组，而精氨酸水平低于N-1补充组。N-1补充组血液精氨酸水平也高于模型组。体外研究表明，精氨酸可降低CaOx晶体对肾上皮HK-2细胞的粘附。我们的发现强调了N-1通过调节肠道菌群中的精氨酸代谢在减少肾CaOx晶体中的重要作用。含有L. plantarum N-1的益生菌可能是预防肾结石的潜在疗法。    

论文ID

原名：Lactiplantibacillus plantarum Reduced Renal Calcium Oxalate Stones by Regulating Arginine Metabolism in Gut Microbiota 

译名：植物乳杆菌通过调节肠道微生物中的精氨酸代谢减少肾草酸钙结石

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：5.640

发表时间：2021.9.24

通讯作者：王坤杰＆孙群

通讯作者单位：四川大学华西医院泌尿外科；四川大学生命科学学院

DOI号：10.3389/fmicb.2021.743097

实验设计

结果

1 植物乳杆菌N-1还原肾草酸钙结晶

为了探讨N-1对肾CaOx晶体形成的影响，我们提供了N-1模型大鼠。4周后HE染色显示1% EG成功诱导肾内CaOx晶体形成，VK染色也证实了这一点。补充N-1可显著减少肾脏晶体形成 (图1A)。模型组HE染色评分和VK染色值 (面积) 均显著升高，N-1补充组显著降低 (P＜0.05) (图1B,C)。模型大鼠尿草酸水平高于对照组 (P＜0.05)。N-1对尿草酸排泄无影响 (P＞0.05) (图1D)。三组患者24小时尿量无统计学差异 (P＞0.05) (图S1)。从实验开始到实验结束，所有大鼠体重均稳步增加。4周后，模型大鼠体重明显低于对照组 (P＜0.05)，补充N-1后无明显变化 (P＞0.05) (图1E)。

图1 对照组 (n = 10)、模型组 (n = 10)、乳杆菌组 (n = 10) 大鼠肾组织、尿草酸水平和体重的苏木精伊红 (HE) 染色和von Kossa (VK) 染色。(A) 肾组织HE和VK染色图像。(B) 肾组织HE染色评分和 (C) VK染色区域(每种染色选取三个不同的切片)。(D) 三组患者尿草酸水平。(E) 三组大鼠从实验开始到实验结束每周的体重。数据以平均值±标准差表示，Student’s t检验进行组间分析。***, P＜0.001，n.s, P＞0.05。

2 植物乳杆菌N-1逆转回肠肠道菌群β多样性

为了探究N-1是否通过调节肠道菌群来减少肾脏晶体，我们接下来检查了肠道菌群。我们发现在OTU水平上，所有组的覆盖指数均大于0.99，说明所有样本的测序深度足够。对照组、模型组和N-1补充组回肠、盲肠和结肠肠道菌群α多样性无显著差异（表S2）。

采用Bray Curtis指数进行主坐标分析 (PCoA)，评估肠道菌群beta多样性。在回肠中，对照组和模型大鼠PCoA明显分离 (P = 0.019, ADONIS)。模型组肠道菌群beta多样性与乳杆菌组差异具有统计学意义 (P = 0.045, ADONIS)。对照组和N-1补充组的beta多样性差异减小 (P = 0.190, ADONIS) (图2A)。在盲肠和结肠中，虽然对照组和模型组的beta多样性也有差异，但N-1补充组与模型组相比没有变化 (P＞0.05, ADONIS) (图S2A,B)。这表明N-1对肠道微生物群有显著影响，尤其是回肠。

图2 对照组 (n = 10)、模型组 (n = 10)、乳杆菌组 (n = 10) 回肠肠道菌群分析。(A) 采用Bray-Curtis指数进行主坐标分析 (PCoA)，评估三组间回肠肠道菌群beta多样性。(B) 三组间回肠菌属水平的相对丰度用彩色柱表示。(C) 采用线性判别分析效应量 (LEfSe) 在属水平分析回肠中相对丰度较高的菌群，模型组 (红色条形图)、模型组 (蓝色条形图)、乳杆菌组 (绿色条形图)。

3 植物乳杆菌N-1改变肠道菌群

在门水平上，厚壁菌门 (Firmicutes) 为主要菌群(79-97%)。在属水平上，乳杆菌属 (Lactobacillus) 是最常见的细菌。乳杆菌属的相对丰度从回肠的65-83%下降到盲肠的16-36%，结肠的18-46%。在回肠中，乳杆菌的比例由对照组的83%下降到模型组的65%，然后在N-1添加组中上升到75% (图2B) 。在盲肠和结肠中，与对照组相比，乳杆菌在模型组和N-1补充组的盲肠和结肠中的百分比有所下降；与N-1补充组相比，模型组和N-1补充组之间无显著差异 (图S2C,D)。这一证据再次表明，N-1显著地调节了回肠的肠道微生物群，而不是盲肠或结肠微生物群。

在属水平上，我们使用线性判别分析效应量 (LEfSe) 来探索对照组、模型组和N-1补充组之间的细菌差异。在回肠中，模型组葡萄球菌 (Staphylococcus) 、棒状杆菌1 (Corynebacterium 1)、Jeotgalicoccus、嗜冷杆菌 (Psychrobacter) 和气球菌 (Aerococcus) 较为丰富。相比之下，对照组中乳杆菌 (Lactobacillus) 和凸腹真杆菌 (Eubacterium ventriosum) 的相对丰度较高，而在N-1补充组的盲肠 (图S3A) 和结肠 (图S3B) 中瘤胃球菌科UCG 007（Ruminococcaceae UCG 007）和理研菌科RC9（Rikenellaceae RC9）的相对丰度较高。

4 植物乳杆菌N-1调控肠道代谢酶和氨基酸代谢

除细菌外，我们还利用PICRUSt2来预测肠道菌群的代谢酶，并分析三组间的差异。利用LEfSe分析，我们发现19种酶的水平在回肠模型组中更高(如精氨酸酶)。此外，补充N-1后回肠中12种酶(如L-丝氨酸解氨酶)水平升高。然而，模型组和N-1补充组间在盲肠和结肠中酶的显著差异小于回肠 (表1)。

为了验证精氨酸酶及其代谢底物是否参与肾脏晶体的形成，我们检测了精氨酸酶的活性，发现N-1补充组的回肠内容物中精氨酸酶的活性低于模型组 (图3A)。

我们还检测了回肠 (表S3) 和血液 (表S4) 中不同氨基酸的水平。对照组 (P = 0.040) 和N-1补充组 (P = 0.029) 回肠内容物中精氨酸水平高于模型组 (图3B)。模型组血液中精氨酸水平(P = 0.010) 也低于对照组和N-1补充组 (P = 0.021) (图3C)。回肠内容物和血液中的鸟氨酸和瓜氨酸水平在三组间无显著差异 (图S4)。回肠内容物 (图3D) 或血液 (图3E) 中的精氨酸水平与对照组中丰度较大的细菌正相关，与模型组中丰度较大的细菌呈负相关关系。

表1 较高的预测酶水平涉及模型组和植物乳杆菌组的回肠、盲肠和结肠中肠道微生物群的代谢途径。

图3 对照组 (n = 5)、模型组 (n = 5)、乳杆菌组 (n = 5) 回肠内容物中精氨酸酶活性及回肠内容物和血液中精氨酸水平。(A) 回肠内容物精氨酸酶活性。(B) 回肠内容物中的精氨酸水平。(C) 血液中的精氨酸水平。(D) 对照组或模型组回肠中丰度较高的细菌与回肠内容物中氨基酸的相关性。(E) 对照组或模型组回肠中丰度较高的细菌与血液中氨基酸的相关性。*, P ＜0.05，n.s, P ＞0.05。  

5 精氨酸改善草酸钙结晶与肾细胞的粘附

为了探讨精氨酸在体外是否会影响肾上皮细胞的晶体粘附，我们在细胞培养基中加入CaOx晶体和精氨酸。结果表明，单独用精氨酸处理肾上皮HK-2细胞时，未见CaOx晶体粘附。暴露于0.75 mM草酸盐后晶体粘附增加，当细胞暴露于0.75 mM草酸盐＋1.72 mM或更高的精氨酸时，晶体粘附性降低 (P = 0.023) (图4)。

图4 草酸盐和精氨酸对CaOx晶体与肾上皮HK-2细胞粘附的影响。暴露于 (A) 生理盐水，(B)  4.31 mM精氨酸，(C) 0.75 mM草酸盐，(D) 0.86 mM精氨酸+ 0.75 mM草酸盐，(E) 1.72 mM精氨酸+0.75 mM草酸盐，(F) 4.31 mM精氨酸+0.75 mM草酸盐，(G) 8.61 mM精氨酸+0.75 mM草酸盐，(H) 17.22 mM精氨酸+0.75 mM草酸盐，(I) 43.05 mM精氨酸+0.75 mM草酸盐(×100)时，CaOx晶体与肾上皮HK-2细胞粘附。红色箭头指的是CaOx晶体。(J)上述细胞粘附CaOx晶体的定量数据。*, P＜0.05，**, P＜0.01，***, P＜0.001，n.s, P＞0.05。

讨论

我们前期的研究表明，L. plantarum N-1对酸和胆盐具有抗性，与其他菌株相比，在pH为3.5和胆盐为0.1%的条件下，其存活率最高，分别为98.0和99.1%。该菌株具有粘附肠道的能力和抗菌活性。此外，N-1培养上清液能抑制大肠杆菌 (Escherichia coli) 的生长。这些特点保证了L. plantarum N-1在肠道中的存活。

在正常健康人体内，食物中的草酸盐被血液吸收，其余部分被肠道微生物降解。此外，一些膳食前体 (如乙醛酸盐和羟脯氨酸) 也会在肝脏中代谢为草酸盐。草酸通过肾和肠排出。因此，肠道菌群可能在调节草酸代谢中发挥关键作用。据报道，Lacticaseibacillus casei能在体外降解草酸，减少大鼠尿草酸排泄和肾脏晶体的形成。然而，本研究并未探讨其潜在机制。后来的一些研究发现，与草酸脱羧酶基因重组的植物乳杆菌 (L. plantarum) 也能降低尿路水平。然而，这些人造细菌对人类可能并不安全。一些临床研究也发现，含有乳杆菌 (Lactobacillus) 的益生菌可降低原发性高草酸尿症或肾结石患者的尿草酸水平，但益生菌治疗组与安慰剂治疗组的下降幅度无显著差异。有趣的是，我们的研究发现，L. plantarum可以减少肾脏晶体而不减少尿草酸排泄。Murphy等人也报道并非所有乳杆菌都能降解草酸。因此，在我们的研究中，L. plantarum N-1可能通过草酸代谢以外的其他机制来减少肾晶体沉积。

已有多项研究报道，肾草酸钙结石患者与健康对照者的肠道菌群不同，表明在肾结石的形成中，重要的是整个肠道菌群，而不是某一种细菌。因此，我们进一步检测了三组间回肠、盲肠和结肠的肠道菌群组成。我们发现乳杆菌属 (Lactobacillus) 是肠道中的优势菌群，尤其是在回肠。我们还发现N-1补充组的肠道菌群β多样性和乳杆菌百分比更接近于对照组，说明N-1可以使模型大鼠的肠道菌群逆转到相对正常的状态。然而，在盲肠或结肠中没有观察到这种现象，最可能的原因可能是回肠环境更适合乳杆菌生长。

我们还发现乳杆菌属 (Lactobacillus) 是肠道菌群的主要菌属。乳杆菌在对照组结肠中的相对丰度要高得多，表明乳杆菌的减少与肾结石有关。我们的研究也证实了补充植物乳杆菌N-1可以减少肾脏晶体的形成。此外，在模型组的肠道菌群中，短链脂肪酸 (SCFA) 产生菌如真细菌属 (Eubacterium) 和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae) 的丰度较低。有报道称SCFAs具有抗炎功能，然而，本研究模型组肠道菌群中葡萄球菌 (Staphylococcus)、棒状杆菌1 (Corynebacterium 1)、Jeotgalicoccus、嗜冷杆菌 (Psychrobacter) 和气球菌 (Aerococcus) 较为丰富，这些菌属与急性或慢性炎症性疾病有关，包括炎症性肠病、坏死性淋巴结炎和糖尿病。这一证据表明，N-1可以通过调节肠道微生物组直接或间接改善肠道菌群的失调，降低各种器官和组织 (如肾脏) 的炎症水平，进而减少对肾细胞的损害和减少晶体。

在本研究中，我们预测模型组的回肠菌群中精氨酸酶水平高于N-1补充组。预测结果还显示，模型组盲肠和结肠内容物中精氨酸酶水平与N-1补充组无显著差异。同时，回肠内容物中乳杆菌的相对丰度高于盲肠和结肠内容物。因此，我们假设添加乳杆菌主要调节回肠内容物中精氨酸酶活性和精氨酸水平。进一步检查证实，补充N-1的大鼠回肠内容物中精氨酸酶活性较模型大鼠低。添加N-1的大鼠回肠和血液中精氨酸水平高于模型大鼠。鸟氨酸和瓜氨酸是精氨酸的关键代谢产物，精氨酸通过精氨酸酶代谢为鸟氨酸。因此，我们也比较了回肠内容物和血液中鸟氨酸和瓜氨酸的水平。虽然3组间差异不显著，但添加N-1后回肠中鸟氨酸含量有降低趋势。

此外，一项体外研究也表明精氨酸可以降低CaOx晶体对肾细胞的粘附。Kandhare等人和Pragasam等人报道称，L-精氨酸给药可提高肾结晶大鼠尿中柠檬酸的含量，降低肾脏中自由基和草酸的含量。Kizivat等人还发现，L-精氨酸可以降低体外暴露于草酸的肾上皮细胞的氧化应激。精氨酸还能抑制肠上皮细胞的炎症反应和凋亡。综上所述，植物乳杆菌N-1可能通过调节肠道菌群代谢和提高肠道精氨酸水平来减少肾脏结晶。

本研究仅在Sprague Dawley大鼠身上进行。N-1对预防人类肾结石的作用还需要进一步研究。然而，我们的研究也具备几个优势。首先，N-1是从中国传统奶酪中分离出来的，对人体无致病性，易于获得。其次，与Kwak等人的研究相比，我们的研究首次探索了植物乳杆菌给药后肠道菌群的变化，并探讨了其通过降低肠道菌群中精氨酸酶水平来预防肾结石的作用。这些结果将有助于进一步研究肾结石形成的机制。

结论

本研究的发现强调了L. plantarum N-1通过调节肠道菌群中的精氨酸代谢在减少肾CaOx晶体中的重要作用。含有L. plantarum N-1的益生菌可能是预防肾结石的潜在疗法。