金属硫蛋白在心肌缺血/再灌注损伤中保护作用的研究进展

遵义医科大学附属医院麻醉科 563000

贵州省卫生健康委科学技术基金（gzwjkj2019‑1‑162）

【综述】

临床中全心停跳心内直视手术的普及使心脏及其血管的病变得到治疗，但该手术过程中将不可避免地发生心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI）。再灌注后氧化应激增加是导致MI/RI的主要原因之一，MI/RI可以使患者产生心律失常、心肌梗死（myocardial infarction, MI）面积扩大、心肌顿抑乃至心力衰竭等，严重影响患者预后。长期以来，众多学者一直致力于减轻MI/RI的基础与临床研究，并取得了一定进展。金属硫蛋白（metallothionein, MT）是一类富含半胱氨酸残基的低分子量金属连接蛋白，在抗重金属毒性、DNA损伤、氧化应激和维持金属稳态中起着重要作用。在大鼠心脏，MT超表达能改善心脏缺血后的心功能，减少心肌酶漏出，有效减少心肌细胞凋亡和MI，起到抗MI/RI的保护作用。本文就MT参与的心肌保护作用及其相关机制的研究进展进行综述。

MT又称镉结合蛋白，1957年由美国哈佛大学的Margoshes和Vallee首次从马的肾脏中分离出来。MT不仅来源于各种高等动物、植物和人类，在真核、原核微生物中也有发现，但是目前尚未从禽类动物中分离得到 。

MT是一种高度保守，相对分子质量约为7×103，由61个氨基酸组成的低分子量蛋白质，其特征为半胱氨酸含量高（30%），缺乏芳香氨基酸，很少或没有组氨酸残基。作为体内重要的金属结合蛋白，MT通过半胱氨酸残基中的硫醇基（SH）与金属结合。蛋白质的化学计量式显示，每20个半胱氨酸与7个离子形成金属硫代酸络合物，使每摩尔MT原子可以与7~10 g金属结合。无金属结合的蛋白称为Apo‑金属硫蛋白或硫蛋白，其具有主要无序的结构，因此极易受到蛋白水解过程的影响。

MT存在多种分类，具有较高的序列异质性，因此各亚型在分子大小、数量和半胱氨酸残基分布上都有差异。至今发现，哺乳动物体内MT共有4种亚型，即MT1~MT4，其中以MT1和MT2为主要异构形式（通常合称为MT1/2）。目前发现MT1存在A、B、E、F、G、H、M和X八种亚亚型，MT2也同样存在多种亚亚型。在哺乳动物中，MT1和MT2在各种组织中表达，并且主要表达于心脏。MT3和MT4则是在较特异的组织中表达，如MT3被认为主要表达于中枢神经系统，MT4主要表达于某些上皮组织。

机体内的MT在抗氧化、重金属解毒、免疫防御、参与细胞周期进展、细胞增殖和分化以及血管生成等方面发挥着重要作用。但不同亚型MT的基本功能并不完全相同，各有特点，下面将对各亚型MT的基本功能逐一论述。

2.1　MT1/2

MT1和MT2是普遍存在、高度诱导的异构体，通常被一起研究，主要与调节金属稳态（锌、铜等）、排毒、氧化应激、免疫防御、细胞周期进程、细胞增殖和分化以及血管生成相关 。MT1/2可以通过调节激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen‑activated protein kinases, MAPK）在抗氧化、抗凋亡、抗炎中发挥关键的病理生理作用 。另外最近研究发现，在七氟醚预处理介导的氧‑葡萄糖剥夺所致神经元损伤的保护中，MT1/2起到神经保护作用 。

虽然MT1/2常结合在一起研究，但是二者的特定功能已开始被阐明。如MT1被发现能增加肺癌风险，参与儿童和青少年骨肉瘤的发生、发展，影响胎盘的结构完整性和功能 ；MT2 则在松弛气道平滑肌细胞，影响黏液表皮样癌细胞的迁徙和侵袭活性方面具有特定作用 。

2.2　MT3

自Uchida等1991年在正常人脑中首次发现MT3以来，人们已经对该金属蛋白的功能作用进行了深入研究。MT3参与了大脑中必需过渡金属锌和铜的体内平衡，具有独特的神经元生长抑制活性，在许多金属相关神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病以及海绵状脑病）患者的大脑中水平明显降低。虽然MT3主要在中枢神经系统中表达，但在肾、生殖系统、胰腺中也被检测到。在调节各肾段Zn2+浓度、调节分娩和早产机制、链脲佐菌素诱导的胰岛细胞死亡和随后的高血糖中起到重要作用 。

2.3　MT4

有关MT4的研究较少，目前只清楚增殖性分层上皮是合成MT4的唯一组织，并起到调节其锌代谢的作用 。

3.1　MI/RI的发病机制

MI/RI的发病机制尚未完全阐明，通常认为与氧化应激、线粒体受损和钙超载相关。

氧化应激是导致MI/RI发生和发展的重要危险因素，代表了自由基产生与细胞解毒能力之间的不平衡状态。氧化应激可由酶源和非酶源产生，常见的酶源包括黄嘌呤氧化酶系统、还原型辅酶Ⅱ氧化酶系统、线粒体电子传递链和非耦联一氧化氮合酶系统；非酶源是氧化应激的一个次要来源（包括Hb和肌红蛋白）。而氧化应激中最重要的环节是大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生，是MI/RI引起心肌损伤的主要原因。ROS包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2−）、羟基自由基（‑OH）和过氧亚硝酸阴离子（ONOO−），它们均随再灌注时间的延长而增加。ROS产生的过程中，由于脂质过氧化，可能发生DNA、蛋白质的氧化和膜损伤，导致蛋白质结构、功能和膜通透性的改变和局部炎性反应 。炎症级联和氧化应激随后可能诱发细胞因子风暴，导致细胞结构受损和细胞死亡。

线粒体是参与能量生产的细胞器，受损后会导致能量产生障碍，甚至不同程度的细胞损伤。在缺血/缺氧过程中，由于电子传输链不能正常工作导致ROS大量产生，而产生的ROS又可进一步导致线粒体DNA的氧化损伤，损害线粒体功能。MI/RI发生后，大量氧自由基介导心脏线粒体形成自氧化羟固醇（如7‑酮胆固醇和胆固醇‑环氧化物等）。自氧化羟固醇在诸多细胞系中被证实可以通过诱导磷酸化、氧化和炎症导致细胞死亡。此外，线粒体膜的氧化损伤也可能发生，导致膜除极和氧化磷酸化耦联，改变细胞呼吸。这最终可能导致线粒体损伤、细胞色素C的释放、caspase的活化和细胞凋亡 。

此外，由于线粒体内ATP产生减少会引起厌氧代谢，细胞表面可能存在钠‑钾泵（Na+‑K+‑ATP酶）和钙泵（Ca2+‑ATP酶）功能障碍。钠‑钾泵的故障导致钠在细胞内滞留，钾在细胞外滞留。细胞中较高水平的钠降低了钠‑氢交换泵（Na+‑H+‑ATP酶）的活性。内质网上的钙泵也会功能失调，限制了钙的再摄取。细胞中H+、Na+和Ca2+积累，从而导致水进入细胞质造成细胞肿胀和死亡。而且，缺血时细胞内钙超载还会导致黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，增加O2−的产生。

3.2　MT减轻MI/RI可能机制

MT是体内的快反应应激蛋白。重金属、内毒素、细胞因子、糖皮质激素、ROS等多种应激和病理状态均可诱导MT合成，MI/RI也不例外。MI/RI后，MT合成增加，显著减弱MI导致的心肌细胞凋亡，减少梗死面积，保留心脏功能。并且在小鼠MI/RI模型中，MT超表达能改善心脏缺血后的心功能，减少心肌酶漏出，起到减轻缺血/再灌注诱导心肌损伤的作用；相反，MT沉默后心脏呈现出细胞凋亡且泵功能受损 ，表明MT参与减轻MI/RI的保护作用。虽然其作用机制尚未彻底明了，但目前研究发现MT主要通过对抗氧化应激、对抗细胞凋亡、抑制钠钙交换减轻细胞钙超载、对抗炎性反应等途径来实现MI/RI的保护作用。

3.2.1　MT抗氧化应激

MI/RI发生后大量ROS产生，会在细胞外释放大量氧自由基。MT是胞质内数量最多的抗氧化物，其主要通过半胱氨酸残基清除自由基、对抗脂质过氧化来保护细胞和组织免受MI/RI的影响。研究发现，MT清除游离羟基自由基的能力比谷胱甘肽高100倍 。MT能减少缺血/再灌注过程产生的丙二醛，提高钠‑钾泵、Ca2+‑Mg2+‑ATP酶活性，改善细胞内外的电解质紊乱；减轻心肌细胞因氧化应激造成的炎性浸润，显著提升机体免疫调节能力及抗氧化能力 ；同时促进抗氧化酶的活化和基因表达，使抗氧化酶更好地清除氧自由基而发挥抗氧化作用；并且介导磷酸化细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase, ERK），调节血红素加氧酶‑1来控制ROS生成，从而减轻ROS对心肌的损害。此外有研究发现，MT还可抑制琥珀酰辅酶A（三羧酸循环关键酶之一）和氧化呼吸链中ATP合酶硝基化，提高葡萄糖利用率及能量供应，这对于MI/RI发生后稳固线粒体功能和细胞代谢具有重要意义 。

3.2.2　MT抗凋亡

凋亡是1972年在动物体内发现的一种程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD），具有稳定内环境和确保正常生长、发育的功能。Fliss和Gattinger 研究发现，MI/RI诱发了细胞凋亡，并认为凋亡是参与MI/RI发病机制的重要细胞事件。Yang等 发现，MT通过抑制心肌细胞凋亡而延缓心力衰竭的进展。此外，MT沉默后呈现出心肌细胞凋亡并且心脏泵功能受损 ，说明MT抗MI/RI的保护作用与抑制心肌细胞凋亡有关。MI/RI发生后，线粒体细胞色素C释放，通过一系列级联反应激活线粒体凋亡分子，导致凋亡；MT能通过抑制ROS相关的线粒体细胞色素C释放和线粒体凋亡分子（B淋巴细胞瘤‑2相关蛋白质、caspase‑3和caspase‑9）和caspase‑12的下调表达，以减少因心脏和血管内皮细胞凋亡所致的细胞死亡 。Duerr等 有关凋亡相关介质的数据还表明，MT的表达与抗凋亡介质B淋巴细胞瘤‑2在预防心肌细胞凋亡方面存在联系。且小鼠α亚型与β亚型肌球蛋白重链的适应功能障碍、较高的底物消耗也被认为与MT抗凋亡作用机制有关 。

3.2.3　MT减轻钙超载

MI/RI后，钙泵和钠‑钾泵受到抑制，心肌细胞钙超载，造成心肌挛缩、室内压升高、质膜分解。研究表明，利用含Ca2+的无钠液培育大鼠原代心肌细胞，Ca2+会经Na+/Ca2+通道大量内流，导致钙超载；而使用含MT的细胞液则可抑制Na+/Ca2+通道作用，并减轻胞内钙超载状况。同时，MT可以显著减少氧自由基对线粒体Ca2+‑Mg2+‑ATP酶活性的抑制，也有助于降低胞内Ca2+浓度 。

3.2.4 MT抗炎症反应

MT可通过抑制NF‑κB通路和内皮细胞过表达脂多糖相关因子‑1来调节细胞炎性反应。MI/RI发生后，氧化应激释放大量炎症因子可能诱发细胞因子风暴。而MT可以抑制促炎细胞因子（如IL‑6、IL‑12和TNF‑α）的激活，从而减轻MI/RI。

学者们通过相关研究找到一些具有临床应用前景的心肌保护防治策略，其中，有部分处理策略涉及MT减轻MI/RI的保护作用机制。

4.1　MT在缺血预处理（ischemic preconditioning, IPC）心肌保护策略中的作用

在明确MI/RI存在后，Murry等 建立了IPC的心脏保护模式，在持续40 min的冠状动脉缺血/再灌注之前，行4个周期的5 min冠状动脉闭塞5 min再灌注能减少MI面积。IPC的具体机制仍未完全明确，其涉及众多内源性物质（如前列腺素、缓激肽、腺苷、儿茶酚胺、一氧化氮等）、受体（α受体、A1受体）、离子通道（钙通道、钾通道）以及某些蛋白或激酶。金慧英等 发现，在乳鼠缺氧/复氧心肌细胞模型中，使用MT抗体阻断其在缺氧预处理的作用后，心肌细胞抗氧化酶的活力明显下降，反映MT确实参与了缺氧预处理的保护效应，并通过保护抗氧化酶的活力来减轻自由基对细胞的损伤。此外，研究表明，IPC可诱导MT合成增加，其上调MT的机制涉及MAPK家族及相关途径。MAPK家族有ERK、c‑Jun氨基末端激酶和P38三种途径，它们都有相似的激活级联反应 ，最终都是通过活化MAPK，由MAPK转位入核后使转录因子磷酸化，从而上调包含MT表达蛋白在内的有关蛋白的表达。

4.2　MT在锌预处理心肌保护策略中的作用

心肌细胞内Zn2+丢失是MI/RI机制中的重要环节之一 。相关理论认为MI/RI所致的Zn2+减少与细胞抗氧化能力下降相关 。补锌可降低动脉粥样硬化的风险，对MI及MI/RI有保护作用。MT作为一种金属结合诱导蛋白，胞质内约有20%的Zn2+与MT紧密结合，可以维持体内Zn2+浓度保持稳定。当细胞内Zn2+浓度降低至不足以稳定MT时，MT迅速水解释放Zn2+以维持其浓度稳定，并且通过调节细胞内Zn2+的分布来调控相关生理过程和密切依赖Zn2+浓度梯度的氧化应激过程。有研究表明：低剂量硫酸锌（50 μmol/L）可以上调MT的表达，通过抑制氧化应激和DNA损伤，降低细胞毒性；而高剂量硫酸锌（100 μmol/L）则通过ERK途径负责神经毒性。Ma等 研究发现，细胞核中MT含量与转录因子对锌的需求有关，MT可以通过调节细胞内游离锌水平，抑制细胞凋亡，促进细胞自噬。并且，预先由硫酸锌诱导的内源性MT能加强心肌抵抗钙超载的能力。

综上所述，MT在机体内在抗氧化、重金属解毒、免疫防御、参与细胞周期进展、细胞增殖和分化以及血管生成等方面发挥着重要作用，并且作为体内数量最多的抗氧化物，能通过抗氧化应激、对抗细胞凋亡、减轻心肌细胞钙超载等途径减轻MI/RI对机体的损伤。IPC、锌预处理等多种处理措施中也涉及MT对MI/RI的保护作用机制。作为一种非特异性内源性可诱导的细胞保护物质，未来对MT的研究可能涉及其在后处理保护策略中的作用机制和与其他抗氧化通路的关系。