文献精读 | 孕期冷应激反应相关的小胶质细胞亚群被激活后干扰周边脑区神经发育进程

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背  景

BACKGROUND

    小胶质细胞是常驻于脑实质的吞噬性免疫细胞。小鼠胚胎中，红细胞-骨髓祖细胞来源的巨噬细胞在胚胎期第9.5天（E9.5）从卵黄囊迁移至脑实质，在神经中枢系统独特微环境的影响下，巨噬细胞转变形成小胶质细胞。胚胎发育阶段，小胶质细胞在特定脑区发挥了重要的角色。例如，皮质中的小胶质细胞影响神经干细胞（NSCs）的维持，在神经发生期结束时吞噬掉多余的NSCs。已报道的单细胞测序（scRNAseq）分析结果显示胚胎阶段的小胶质细胞比成年时期更具有异质性，其形态学和转录组特征上的动态变化都与特定神经发育事件相关。那么是否表明胚胎期，不同亚群的小胶质细胞负责特定的胚胎发育事件。

    下丘脑在维持内环境稳态中起关键作用，参与了体液平衡维持、体温和能量调节、昼夜节律、分娩哺乳、情绪输出以及社交行为等生理过程。其中最为人们所熟知的是当机体受到外界威胁时，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴协调介导的“战斗或逃跑”（fight or flight）反应。与下丘脑相似，中枢系统中发挥免疫监视作用的小胶质细胞也能感受外界环境刺激（例如感染、糖皮质激素、空气污染等）。应激条件下，小胶质细胞会释放促炎信号，可能误伤周围细胞导致神经发育异常。既往研究表明，小胶质细胞在下丘脑发育进程中发挥了多种重要作用。因此研究者假设孕期应激可能干扰胚胎下丘脑小胶质细胞的功能，从而影响周围脑区的神经发育进程。

结 果

RESULTS

1、E15.5下丘脑小胶质细胞ScRNA结果提示存在四个亚群

    予以孕鼠冷应激造模，在E11.5-E15.5连续五天置于4℃ 30min。E15.5分离胚鼠下丘脑进行单细胞化，流式分选小胶质细胞进行后续scRNA-seq。根据测序结果分析表明，该发育阶段小胶质细胞存在四个聚类分群特征，与已知胚胎期和新生儿期的小胶质细胞的状态高度相关，与成年和老年期并不相同。

    测序结果中，除了经典的小胶质细胞基因Fcrls，P2ry12，Trem2，C1qa，Cx3cr1, Csf1r在四个亚群中均存在表达，Apoe、Hexb、 Fcrls、Trem2以及C1qa也在聚类分群1-4中存在。Cx3cr1, Csf1r, Apoe和Hexb还同样表达在单核细胞和巨噬细胞，此外以上两类细胞还特异性表达Ccr2, Ifitm3, Plac8, and H2-Aa。

    小胶质细胞的四个聚类分群，各自也有不同的转录组特征。亚群1的Ms4a7、亚群2的Spp1、亚群3的Birc5以及亚群4的Tmem119均为各自亚群中的特征性转录表达基因。P2ry12也仅在部分聚类1和2亚群中存在。以上结果提示在发育大脑中，所有的小胶质细胞有共同的核心转录组特征，四类小胶质细胞亚群也各具特征（图1）。

▲ 图1

    为进一步确认胚胎期小胶质细胞不同亚群的特征基因表达情况，研究者使用了荧光原位杂交 (FISH)来构建下丘脑图谱（图2）。首先确认单核细胞和巨噬细胞聚类的转录组特征基因表达情况，即Ccr2, Ifitm3, Plac8, and H2-Aa，发现S100a6和Cybb在单核细胞和巨噬细胞中也存在高表达。此外，Ccr2+的细胞并不与小胶质细胞的标志物Fcrls共标，且位于脑实质之外，排列在下丘脑软脑膜外侧，符合单核/巨噬细胞的特征。

    小胶质细胞亚群1的转录组特征是最接近于单核和巨噬细胞的。除了Ms4a7之外，Pf4、F13a1等基因也在亚群1中表达。考虑到小胶质细胞亚群和单核细胞/巨噬细胞存在转录组特征和空间分布上的重叠，推断小胶质细胞亚群1在外界刺激和血脑屏障被破坏时，能够迅速做出反应。小胶质细胞亚群2的转录组特征提示其处于亚群1（过渡态）和亚群3（增殖态）、亚群4（成熟态）之间，以Spp1、Fabp5、Lp1为特征转录组基因表达。然而亚群2 没有分布在脑实质，而是局限于第三脑室附近区域，有一些还位于视上核的软脑膜的边缘以及前联合。小胶质细胞亚群2其细胞表明和分泌的信号分子尤为丰富，提示亚群2与周围的神经干细胞存在互相作用。增殖态的亚群3以 Birc5、E2 C、Hist1h2ap为特色表达的基因，成熟态亚群4以Crybb1，Sparc，P2ry12，Sall1是其特色表达基因。

▲ 图 2

2、小胶质细胞亚群2与NSCs直接作用，对孕期冷应激作出反应

    文献表明胚脑皮质的小胶质细胞会影响神经前体细胞的维持。在上一部分作者发现亚群2细胞位于下丘脑的NSCs的周围。接下来作者利用透明脑技术和光片显微镜观察了在胚脑中下丘脑中小胶质细胞的全面观，使用iba1进行免疫荧光染色观察形态（图3）。结果发现在胚脑的下丘脑区域，小胶质细胞不仅与NSCs（Sox2+细胞）相邻分布，且沿着第三脑室分布。超分辨率图像显示，小胶质细胞的投射纤维直接与NSC相连，一些小胶包围了Sox2-细胞，推测小胶质细胞也能够吞噬新的神经元或者胶质细胞，Sox9的染色也确认了以上推论。此外，研究者还观察到小胶质细胞的吞噬体（CD68标记）在第三脑室的iba1+小胶质细胞中存在。这说明下丘脑区域的小胶质细胞与干细胞存在密切相互作用。

    当来源于卵黄囊的巨噬细胞迁移至中枢神经系统后，其周围特殊的信号分子使巨噬细胞转变为小胶质细胞。鉴于单细胞测序分析结果提示小胶质细胞是亚群2状态是处于过渡态亚群1和成熟态亚群4之间，研究者使用相关标志物进行免疫组化再次确认，发现亚群2细胞高表达F4/80和CD45。

    接下来，为检测小胶质细胞亚群2和孕期冷应激的关系，研究者在E15.5冷应激造模后，分胚胎性别观察下丘脑第三脑室周围iba1+F4/80+细胞，发现在对照野生型小鼠中，该类细胞雌雄之间无差异，而在冷应激之后，该类细胞在雄性胚鼠的小丘脑中显著升高。以上结果表明，小胶质细胞亚群2在胚胎期与冷应激反应相关。

▲ 图 3

3、孕期应激后小胶亚群2在Spp1, Ccl3, and Ccl4的转录、翻译和分泌水平呈性别二态性

    应激是动态变化过程，某些基因的转录翻译可能是一过性的。为了了解应激情况下的细胞间的相互作用，研究者使用细胞间通讯分析（Cell-cell communication inference, CCInx）R包分析单测数据以获得细胞间交互作用情况。分析表明，亚群2小胶质细胞表达的配体（Cst3, Spp1, Apoe等）在下丘脑的前体细胞中存在相应的受体（见补充数据）。

    在后续的研究中作者集中于观察三类主要表达于亚群2细胞中的配体——Spp1, Ccl3, and Ccl4。E15.5的FISH结果表明，下丘脑中的Spp1+小胶质细胞在冷应激组雄性中显著的上调，而冷应激组的雌性中并无变化。Spp1基因编码的骨桥蛋白（OPN）在两组中表达趋势也相似。在mRNA表达水平上两组的雌雄胚鼠下丘脑的小胶质细胞中Ccl3均无差异，Ccl4在冷应激组中表达均高于对照组。

    考虑到转录水平和蛋白水平并不一定反应蛋白分泌的情况，研究者在体外检测了细胞因子和趋化因子的表达水平。取出对照组和冷应激组E15.5胚胎全脑置于体外培养基中37℃ 6h后，进行Elisa分析。与体内转录组水平不同的是，Ccl3和Ccl4的分泌在冷应激后的雄鼠胚脑中均显著上。此外多种细胞因子和趋化因子（G-CSF, IL-10, IL-6等）均在应激后的雄鼠胚脑中分泌增加（图4）。综上，在转录、蛋白表达和蛋白分泌相关实验数据均表明Spp1, Ccl3, Ccl4在孕期冷应激后存在性别二态性。

▲ 图 4

4、体外实验表明OPN，Ccl3和Ccl4影响神经干细胞的增殖分化

    为探究Ccl3、Ccl4、OPN对下丘脑NSCs的作用情况，研究者使用体外培养下丘脑干细胞进行研究（图5）。将E12.5的胚胎下丘脑取出进行原代培养，10天后可见神经球形成以备后续实验。在神经球的培养皿中加入单独Ccl3后，与对照组相比，神经球的数量无变化，而单独加入Ccl4或加入Ccl4 & Ccl3之后神经球的数量出现了的增加。相似的，加入OPN之后也能增加神经球数量。这表明Ccl4和OPN均能影响下丘脑神经干细胞的增殖能力。研究者还检测了下丘脑神经干细胞干性，将OPN，Ccl3，Ccl4以及Ccl4 & Ccl3分别加入神经球的培养基，在10天后观察第二代神经球。结果表明，对照组、单纯Ccl3组以及OPN组的第二代神经球均未出现数量变化，而加入Ccl4或Ccl4 & Ccl3均有所增加。这表明以上不同的分泌蛋白对神经干细胞的作用不同。

    接下来，研究者检测了Ccl3、Ccl4、OPN对下丘脑神经干细胞的分化能力的影响，在予以相应处理后检测Tuj1+神经元、PDGFRa+少突胶质细胞和GFAP星形胶质细胞的数量。结果显示三种分泌因子均未能影响神经元的生成，但导致了少突胶质细胞和星形胶质细胞发生的失衡，即少突胶质细胞的减少和星形胶质细胞的增加。值得注意的是，由于进行原代培养的海马神经干细胞是取自神经发生的高峰阶段E12.5，因此神经发生的相关微环境系统已经完善，外界环境可能难以影响。

▲ 图 5

5、孕期应激影响胚胎下丘脑室旁核神经元和少突胶质前体细胞的数量

    在以上实验中，研究者发现了Ccl3、Ccl4、OPN对下丘脑神经干细胞增殖分化的影响以及孕期冷应激影响雄鼠大脑Ccl3和Ccl4蛋白分泌的增加，接下来将进行体内实验确认孕期冷应激会影响神经发育（图6）。在胚胎大脑下丘脑中，表达Ccl3、Ccl4和OPN的小胶细胞亚群2基本位于室旁核（PVN）区域，该区域的神经干细胞所分化的神经元也被认为是与应激反应相关的。因此在E15.5冷应激处理后，进行CRH和vasopressin以及oxytocin神经元标志物染色，发现仅有PVN的oxytocin神经元数量在雄性胚胎中出现下降情况，雌性中未观察到变化。

    为明确在孕期冷应激中小胶质细胞是否参与oxytocin神经元数量下降过程，研究者在胚鼠E3.5-E15.5给予孕鼠CSF1R的抑制剂PLX5622敲除胚胎期的小胶质细胞（＞99%），并在E12.5-E15.5给予冷应激，共设置了四个实验组：标准饮食，标准饮食+应激，PLX5677饮食，PLX5622饮食+应激。在标准饮食和标准饮食+应激组，E15.5雄性下丘脑PVN的oxytocin神经元的数量显著下降，但雌性中并未观察到变化。但当敲除了小胶质细胞后，无论雌雄小鼠的oxytocin神经元的数量均未有变化。因此说明，小胶质细胞是介导了周围室PVN神经干细胞的冷应激反应。

    接下来，研究者在E12.5给予CCL3 + CCL4蛋白胚胎电转，检测在E15.5时期oxytocin神经元的数量。结果提示在给予CCL3 + CCL4蛋白后，无论雌雄小鼠冷应激后神经元数量均出现了下降。由于CCL3 和CCL4对应通用受体CCR5，因此在E11.5-E15.5每天使用CCR5选择性拮抗剂DAPTA。与单纯给予孕鼠生理盐水的胚鼠相比，DAPTA组的oxytocin神经元数量有显著的恢复。综上表明，CCL3 + CCL4影响神经干细胞和oxytocin神经元的发育。

    体外实验中，研究者还观察了在给予CCL3, CCL4, and OPN后少突胶质细胞和星形胶质细胞的比例情况，结果提示两者失衡。染色结果提示少突胶质细胞的前体/少突胶质细胞在冷应激后的雄性下丘脑中减少。但星形胶质细胞由于在E15.5才开始发生，且并不推荐GFAP作为标志物染色。因此无法说明星形胶质细胞的情况。综上表明，孕期冷刺激影响雄性胚鼠下丘脑的神经干细胞分化为oxytocin 神经元和少突胶质细胞。

▲ 图 6

6、孕期应激引起的性别相关差异在小胶质细胞敲除后恢复

    为明确在孕期冷应激是否对下丘脑介导的相关行为出现远期持续影响。研究者设立四个组：标准饮食，标准饮食+应激，PLX5677饮食，PLX5622饮食+应激，并通过三箱社交实验检测PVN脑区功能行使（社交行为）的情况（图7）。在成年的P90雌性小鼠进行三箱社交试验检测社交行为，发现给予应激组（包括标准饮食和PLX5677饮食）的小鼠与对照组相比对陌生小鼠的探索时间失去了偏好性。相似的，当研究者将P90的雄性小鼠进行同样的分组和行为学实验后发现，标准标准饮食+应激组检测时发现对陌生小鼠失去了探索的偏好，但PLX5622饮食+应激组小鼠却出现了探索时间更长的现象，提示社交行为功能的存在。综上说明，孕期冷应激能够影响雌雄小鼠的社交行为，但敲除小胶质细胞后仅能恢复雄鼠中的行为异常。

▲图7

总 结

CONCLUSION

    鉴于下丘脑神经元和小胶质细胞都能够感受外界应激原以调控生理稳态，且在前人的研究中小胶质细胞在下丘脑的发育中有重要影响，因此本研究作者探索了下丘脑是否存在与应激相关的小胶质细胞亚群。通过单细胞测序结果分析，研究者发现亚群2在于周围细胞中沟通相对丰富，该细胞群对孕期冷应激能做出反应，且介导雄性大脑中的PVN神经元发生和胶质命运决定，而不是雌性大脑中。

原始文献：

1.Rosin JM, Sinha S, Biernaskie J, Kurrasch DM. A subpopulation of embryonic microglia respond to maternal stress and influence nearby neural progenitors. Dev Cell. 2021;56(9):1326-45 e6.

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