科研 | Genes：使用鸟枪宏基因组研究土壤施肥对玉米根际环境中微生物群落和磷循环基因分布和多样性的影响

编译：微科盟阿昊，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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样本中存在的细菌科为芽胞杆菌科（Bacillaceae）和肉杆菌科（Carnobacteriaceae），其在N2处理中的含量非常丰富；而在Cp8中，而假诺卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、噬纤维菌科（Cytophagaceae）、小单孢菌科（Micromonosporaceae）、高温单孢菌科（Thermomonosporaceae）、拟诺卡菌科（ Nocardiopsaceae）、球形杆菌科（Sphaerobacteraceae）、高温放线菌科（ Thermoactinomycetaceae）、运动球菌科（Planococcaceae）、间孢囊菌科（Intrasporangiaceae）、丰佑菌科（Opitutaceae ）、酸微菌科（Acidimicrobiaceae ）、弗兰克氏菌科（Frankiaceae）最为丰富。在未经处理的对照组中，微球菌科（ Micrococcaceae）和浮霉菌科（ Planctomycetaceae ）的数量最多。拟诺卡菌科（ Nocardiopsaceae）、微杆菌科（Microbacteriaceae）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）在N1中最为丰富，而紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）和黄杆菌科（Flavobacteriaceae）在Cp4中高度富集（图1）。在施肥和未施肥玉米根际土壤样品中，这些细菌的相对丰度存在显著差异（p < 0.001）。

在属水平上，除镰刀菌（Fusarium ）和阿耶罗菌属（Ajellomyces）外，其余的真菌在Cp8中更为丰富。在N1样本中，葡萄孢菌（ Botryotinia）、曲霉（Aspergillus）、核腔菌属（Pyrenophora）、接合酵母菌（ Zygosaccharomyces）、新萨托菌（Neosartorya）和青霉（Penicillium ）也很丰富。而在N2的样本中，镰刀菌（Fusarium ）和酵母菌（Saccharomyces ）占优势（图2）。施肥处理组与对照组之间存在极显著差异（p < 0.001）。真菌属的主成分分析和主坐标分析在讨论部分进行了描述。

除了餐古菌属（Cenarchaeum）, Candidatus Nitrosopumilus之外，古细菌群落在Cp8土壤中的丰度最高。在N2中泉古菌（Nitrosopumilus）非常丰富，硫化叶菌（Sulfolobus）和小盒菌（Haloarcula）是N1中最丰富的古细菌。对照样品中（Cn0）只有甲烷热杆菌（Methanothermobacter）是根际土壤中最丰富的。Cp4处理的玉米根际土壤中几乎没有优势古菌。最后，在无机肥料、堆肥和对照土壤样品中，古细菌属的丰度水平存在显著差异（p < 0.001）（图3）。

施肥处理和对照之间的磷循环基因相对丰度差异显著（p < 0.05）（表1，原文中表2）。磷循环基因可分为以下几类：无机溶磷基因、植酸酶、磷酸酯酶、磷酸盐降解、磷酸盐转运蛋白和磷酸盐饥饿调节基因。编码无机磷增溶酶的基因在Cp8、N1和Cn0中最丰富，而在N2和Cp4中相对丰度最低。多磷酸激酶（ppk）、磷酸转运体编码基因（pstS、pstC、pstB和pstA）、磷酸丙糖异构酶（tpiA）、喹啉葡萄糖脱氢酶（gcd）、碱性磷酸酶（phoD）和磷酸调节子反应调节器（磷饥饿调节）（PhoB）在Cp8、N1和Cn0处理中最为丰富。施肥和未施肥条件下玉米根际磷循环基因丰度差异极显著（p < 0.05）。基因ugpQ（甘油磷酸二酯磷酸二酯酶）在处理Cp8、N1、Cn0和N2中含量丰富，但在处理Cp4中含量最少，这意味着在施肥和未施肥条件下，该酶在玉米根际具有较高的磷矿化能力。微生物酶磷酸酶在根际土壤样品（Cp8、N1和Cn0）中含量丰富，其功能是可启动磷催化水解为正磷酸盐（植物可同化的一种形式）（图4）。

在图4中，磷循环基因、对照组和处理组呈放射状排列，它们之间的关系通过将它们连接在一起的颜色和弦显示。处理组、对照组和基因之间关系的重要性通过ppk、gcd、pstB、pstC、pstS和tpiA基因所见的和弦大小来描述。与其他基因相比，连接这些基因和Cp8的弦更粗。这表明Cp8处理对参与运输、多磷酸盐形成和磷酸盐代谢的磷循环基因的丰度影响最大。弧的粗细也揭示了处理对土壤中磷循环基因相对丰度的影响水平，它是每个处理中存在的所有基因的总和（即每个处理内部弧的数量）。而磷循环基因的弦长是处理组和对照组中每个基因的总和。图中包含的基因为：碱性磷酸酶（phoA）、双组分系统、OmpR家族、磷酸调节子反应调节器PhoB（PhoB）、碱性磷酸酶合成反应调节器PhoP（PhoP）、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（ugpQ），碱性磷酸酶D（phoD）、磷酸盐转运系统渗透蛋白（pstC）、磷酸盐转运系统渗透蛋白（pstA）、磷酸盐转运系统底物结合蛋白（pstS）、磷酸盐转运系统ATP结合蛋白（pstB）、4-植酸酶/酸性磷酸酶（appA）、磷酸盐转运系统渗透蛋白（phnE），膦酸盐转运系统ATP结合蛋白（phnC）、膦酸盐转运系统底物结合蛋白（phnD）、膦酸乙酸酯水解酶（phnA）、2-氨基乙基膦酸丙酮酸转氨酶（phnW）、假定的膦酸盐转运系统ATP结合蛋白（phnK）、假定的膦酸盐转运系统ATP结合蛋白（phnL），2-氨基乙基磷酸酯转运系统ATP结合蛋白（phnT）、磷酸乙醛水解酶（phnX）、胞外多聚磷酸酶（PPX1）、多聚磷酸激酶（ppk）、喹诺酮类葡萄糖脱氢酶（gcd）、锡甘油3-磷酸转运系统透皮蛋白（ugpA）、锡甘油3-磷酸转运系统底物结合蛋白（ugpB），锡甘油3-磷酸转运系统ATP结合蛋白（ugpC）、锡甘油3-磷酸转运系统渗透蛋白（ugpE）、磷酸丙糖异构酶（TIM）（tpiA）。

 表1. 不同处理下玉米根际磷循环基因多样性指数（原文中表2）

农业土壤中微生物在含磷化合物的矿化、同化和增溶中起着积极的作用。磷是植物和微生物生长所必需的营养物质之一。它是一种有限的养分，由于其与土壤矿物的反应性，通常以不溶性形式存在于土壤中。磷以磷脂、磷酸单酯、植酸盐和磷酸二酯等有机形式存在于土壤中。真菌、细菌和古细菌等微生物参与了这种营养素的提取。由于这种营养素的缺乏，农场主倾向于以无机和有机肥料的形式人工供应。研究发现，土壤施肥可增加土壤中细菌的多样性和丰度。在我们的宏基因组学研究中，与其他施肥处理和对照相比，大量堆肥的土壤施肥增加了玉米根际细菌、真菌和古细菌的丰度和多样性。这与Kamaa等人和Francioli等人的工作一致，他们的报告指出，有机施肥增加了土壤中细菌和真菌的丰度和多样性。另一方面，在我们的研究中观察到，无机肥料对土壤和植物根际微生物的丰度和多样性具有破坏性的影响。Farmer等人的工作支持了这一观察，他们记录了施肥土壤中细菌数量和丰富度的减少。此外，Sapp等人的研究认为，无机肥料降低了微生物多样性，而有机肥料则相反。属于弗兰克氏菌科（Frankiaceae）、热放线菌科（Thermoactinomycetaceae）、链霉菌科（Streptomycetaceae）、拟芽孢杆菌科（Paenibacillaceae）等的细菌在施用堆肥（Cp8）的玉米根际富集。在土壤施肥的影响下，特别是在大量有机肥料的作用下，这些细菌的丰度是促进植物生长的微生物，对维持植物的健康非常有益。它们拥有促进植物生长的基因，其中磷循环基因是必不可少的组成部分。仔细观察有机和无机肥料，发现细菌、真菌和古细菌的丰度和分布因所用肥料的类型和数量而异，如图1、图2和图3所示。主成分分析足以进一步揭示肥料的类型和数量对微生物群落的影响。在主成分分析的负轴1处（图S1），球孢子菌属（Coccidioides）、滑石菌（Talaromyce）、曲霉菌（ Aspergillus）、菌核菌（Sclerotinia）、青霉（Penicillum）等真菌具有较强的负装载（strong negative loading），正轴1处镰刀菌（Fusarium）的正装载较弱。这意味着，使用堆肥和/或低无机肥料的土壤施肥可能会触发不同真菌群落的增殖，这些真菌群落对负轴1处土壤中添加的养分作出反应。有机肥料已知会增加土壤中的营养物质的多样性土壤微生物群落，因为它为微生物生长和代谢提供所需的养分，从而增加土壤微生物丰富度。

在轴2中，镰刀菌（Fusarium）有很强的正负载。这反映了高施用剂量的无机肥对减少真菌多样性和促进能够抵抗肥料诱导的土壤酸化的镰刀菌的影响。镰刀菌是一种已知的植物致病因子，我们的研究结果表明，高剂量的氮肥可能导致镰刀菌病原体引起的植物疾病的发展。阿耶罗菌属（Ajellomyces）和裂殖酵母（Schizosaccharomyces）在轴2处具有较强的负装载。这反映了有机施肥下的土壤可促进参与营养生物地球化学的非植物致病真菌的增殖。施用有机和/或无机肥料的土壤已表明会影响玉米根际磷循环基因的丰度和分布。从堆肥处理（Cp8和Cp4）、无机施肥（N2和N1）和对照（Cn0）样品中获得的亚基因组具有编码磷酸酯酶、无机磷酸盐溶解、磷酸盐运输、磷酸盐降解和饥饿敏感磷酸盐调节基因的基因。我们的研究表明，参与玉米根际磷循环的基因非常丰富。与无机磷增溶相关的基因也很高，这表明根际微生物有能力利用无机磷。堆肥（高剂量）以及无机肥料（低剂量）和对照中的碱性磷酸酶（phoD）正增加，这与Fraser等人的观点一致。

然而，我们的研究在一定程度上观察到了氮磷比化学计量原理，即氮添加量的增加导致了微生物对无机磷需求的上升，特别是在低无机肥料剂量（N1）下−60 kg N/ha），这增加了磷循环基因的丰度，但在非常高剂量的120 kg N/ha（N2）处理下不成立。唯一增加的基因是ugpQ（甘油磷酸二酯磷酸二酯酶），编码一种碱性磷酸酶，能够催化磷脂（甘油磷酸二酯）分解生成甘油3磷酸酯和乙醇。高剂量无机肥确实对磷饥饿调节基因、磷酸二酯酶、磷酸盐降解、无机磷增溶和磷转运基因的丰度有抑制作用（图4）。这意味着，尽管ugpQ基因的丰度略有增加，但高剂量无机氮肥对磷的同化、增溶、转化和运输都有影响。这一观察结果可能是由于无机肥料相关的酸化效应抑制了根际细菌群落的生存能力和活性。为了提高微生物对有机磷的矿化作用，无机氮肥的施用量应适当，以提高微生物从有机化合物中提取磷的能力。令人惊讶的是，低剂量的堆肥对磷循环基因的抑制作用与高剂量的无机氮肥相同，因此，需要进一步的研究来理解这一观察结果背后的原理。

phnX、phnW、phoA、appA和phnA基因（图5）是将N2从对照和处理样品中分离出来的主要驱动因素。沿轴1负值的因子将Cp8与N1和Cn0样本区分开来。磷循环基因的主成分分析轴1显示phnX（磷酸乙酰醛水解酶）的强正装载和pstC、pstB、ppk、phoD、gcd和 pstA等的强负装载。对这些基因的分析反映了有机磷矿化的强烈程度，通过磷酰乙醛水解酶分解碳-磷（C-P）键，产生磷离子和乙醛，以响应正轴1的土壤施肥，增加磷酸盐运输、聚磷酸盐形成，负轴1处土壤有机磷的矿化。在轴2处，碱性磷酸酶（phoA）、2-氨基乙基膦酸丙酮酸转氨酶（phnW）和磷酸乙酸酯水解酶（phnA）具有较强的正负荷。碱性磷酸酶是一种以镁和锌离子为辅助因子的周质酶，是一种耐热和抗蛋白酶的酶，负责在磷限制环境中吸收无机磷。phnW的基因产物通过磷酸酯酶途径参与2-氨基乙基膦酸的细菌矿化。底物作为微生物的碳、氮和磷源，而phnA基因产物（磷酸乙酸水解酶）通过碳-磷键的断裂催化磷酸乙酸转化为乙酸和磷酸离子。产生的醋酸盐是土壤中微生物的唯一碳源。它们是参与玉米根际微生物磷矿化、溶解和吸收的关键酶。

我们的研究还表明，在堆肥（Cp8）、无机肥料（N1）和对照（Cn0）处理下，玉米根际存在的最丰富的磷循环基因是ppk（聚磷酸盐激酶），它催化磷单体聚合生成聚磷酸盐分子。聚磷酸盐分子在微生物中充当能量储存库，用于生物化学过程，包括糖、核酸、蛋白质等生物分子的磷酸化，并增强其在环境中的生存和生长。生物膜的形成、阳离子的隔离、基因的表达和信号传递是微生物细胞中多磷酸盐分子的生物学作用。第二个最丰富的基因家族是pstSBAC（高亲和力磷酸盐转运蛋白），它促进土壤中磷的同化。多聚磷酸激酶基因的丰度与转运蛋白之间存在一定的关系。为了形成聚磷酸盐，磷酸盐转运蛋白必须增强从环境中获取这些磷酸盐分子的能力。因此，ppk基因和pstSBAC的高丰度反映了处理后的玉米根际具有较高的微生物同化磷的能力。在高无机施肥条件下，与磷的运输、吸收和溶解有关的基因减少，这与Bergkemper等人和Ikoyi等人的工作一致。

此外，高堆肥、低无机氮肥料和对照处理均能显著提高醌蛋白葡萄糖脱氢酶（gcd）。该基因合成的酶在无机磷代谢中起着至关重要的作用，因为它使用辅基辅因子吡咯喹啉醌催化葡萄糖分子转化为葡萄糖酸，从而调节并增强土壤中捕获的无机磷的溶解。