前沿观点 | Nature Microbiology：肺微生物群与COVID-19的严重程度

编译：微科盟大头虾，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

已知最早的SARS-CoV-2感染导致COVID-19的病例被认为发生在2019年11月17日。截至2021年8月3日，全球报告了1.987亿例COVID-19确诊病例和420万例死亡。随着全球科学界团结一致，共同努力了解SARS-CoV-2感染，本研究的背景知识基于此前有关人畜共患Beta-冠状病毒中东呼吸综合征冠状病毒 (Middle East Respiratory Syndrome coronavirus，MERS-CoV) 和SARS-CoV-1（可导致十分严重的肺炎）的经验，其重症肺炎致死率分别为34.4%和9%。根据对这些相关冠状病毒的观察，SARS-CoV-2感染可引起不受控制的炎症反应，导致急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome，ARDS) 和多器官衰竭，而这两者都与死亡率增加有关。虽然很大一部分SARS-CoV-2感染人群无症状或病情轻微，但仍有相当一部分人会发展为重症，需要住院治疗，有些人会发展为呼吸衰竭和死亡。其他病毒大流行的死亡率，如1918年H1N1和2009年H1N1流感大流行，部分被归因于细菌联合感染或超级感染。

Sulaiman等人的研究为了确定COVID-19是否也是如此，尝试使用新一代测序 (next generation sequencing，NGS) 来探测微生物环境 (包括RNA和DNA病毒、细菌和真菌) 的复杂性，以及宿主 (人类) 对感染的反应。最近的研究已经使用这种方法来发现ARDS患者的微生物特征。肺部细菌负荷增加和肠道相关细菌的存在导致这些危重患者的预后恶化，突出表明肺微生物组在预测ARDS预后方面的潜在作用。在最近的一项研究中，研究人员使用全基因组测序分析了69名来自香港的患者的肠道微生物群，发现在确诊的COVID-19患者中机会性真菌病原体的丰度增加。虽然人们对了解SARS-CoV-2感染患者的微生物环境越来越感兴趣，但很少有研究试图在疾病活动的原发部位：下呼吸道描述微生物环境。在这项研究中，Sulaiman等人对一组住院的COVID-19患者的肺部微生物群和宿主免疫的下呼吸道标志物进行了特征分析。然而，我们没有发现继发性呼吸道病原体的分离与长时间机械通气 (Mechanical Ventilation，MV；＞28天) 或致命结局（fatal outcome），我们确实确定了与致命结局相关的重要微生物特征，其特征是丰富的口腔共生、高SARS-CoV-2负荷和抗SARS-CoV-2 IgG反应降低，这表明需要更有针对性的抗病毒治疗方法来护理危重型COVID-19患者。

详细的说，作者使用了支气管镜（bronchoscopy）对COVID-19危重患者的下呼吸道进行采样，发现下呼吸道特定部位的微生物学和免疫学特征可以解释病毒载量（viral load）和临床结局的变化。令人遗憾的是，在COVID-19研究中，支气管镜检是一种非常罕见的方法。这些新发现表明，该领域在理解SARS-CoV-2发病机制方面的主要盲点之一是我们未能直接取样和研究肺泡间隙。SARS-CoV-2感染引起的临床异质性是这种冠状病毒成功成为大流行病原体的关键。一方面，如果SARS-CoV-2感染的致命性更为一致，可能更容易控制，因为重症患者倾向于自我隔离，而死亡的患者实际上是非传染性的。而另一方面，如果感染普遍更为轻微，SARS-CoV-2将只是另一种季节性普通感冒（common cold）冠状病毒。SARS-CoV-2的迅速传播及其在全球范围内的持续存在，部分原因在于它似乎具有随机能力，可以让大多数宿主感染无症状或轻微的疾病 (确保了广泛传播)，同时导致少数不幸的人遭受致命的肺部损伤。

随着我们对SARS-CoV-2研究的深入，病毒感染引起的临床异质性仍不能完全解释。从流行病学的粗略水平来看，老年、共病和低社会经济地位会增加严重疾病或死亡的风险。全基因组关联研究（Genome-wide association studies）已经确定了几个与严重疾病相关的基因位点²，外周血白细胞免疫表型显示免疫变异具有合理的预后和病理生理意义³。然而，COVID-19临床严重程度的患者水平变化在很大程度上仍然无法解释。

重症COVID-19首先是一种病毒性肺炎，可引起下呼吸道上皮和内皮损伤。不幸的是，肺泡间隙的取样是具有挑战性的，因为肺泡间隙是疾病发病的主要部位。几十年来，最有用和最有信息的方法 (在Sulaiman等人的研究中使用) 一直是使用支气管镜检查。这包括通过喉部插入一根细而灵活的管子到下呼吸道，在那里它可以用来取样小气道 (通过刷拭) 和肺泡空间 (通过支气管肺泡灌洗) (图1)。在SARS-CoV-2大流行早期，大多数临床中心和研究人员选择避免对COVID-19患者进行支气管镜检查，因为担心病毒雾化和随后增加的传播风险。因此，迄今几乎所有关于SARS-CoV-2感染生物学的人类研究都没有采集肺部样本。相反，文献中主要是使用血液、咽拭子和其他更方便的标本类型的研究。

图1 在SARS-CoV-2感染中，直接采样肺部的重要性被忽视。在人的下呼吸道取样的标准方法是支气管镜，其中肺泡空间可以通过盐水灌洗取样。由于担心雾化和传播风险，COVID-19患者已避免使用支气管镜检查，转而使用替代测量 (例如，从血液和咽拭子)。Sulaiman等人的研究揭示了这种方法的不足。在COVID-19危重患者中，下呼吸道特定部位的微生物学和免疫学特征可以解释病毒载量和临床结局的变化。

回顾过去，我们在COVID-19研究中放弃支气管镜取样的决定是一个错误。首先，我们现在知道，当使用适当的预防措施和个人防护装备时，传染给支气管镜医生和后勤人员的风险非常低⁴。其次，在生物学相关性方面，我们已经从COVID-19之前的研究中知道，在严重的肺损伤中，肺泡炎症几乎 (如果有的话) 与外周血中测量的全身炎症指数相关^5,6。肺泡内发生的免疫学、微生物学或病理学变化不能通过研究血液推断出来。在COVID-19时代，过度解释使用替代测量的研究，使我们对疾病发病机制的理解变得模糊。例如，所谓的‘细胞因子风暴cytokine storm’⁷，夸大肺微血栓的临床重要性⁸，以及广泛传播但被彻底否定的严重COVID-19 ‘ 亚表型（subphenotypes）’，源自不够成熟的和动力不足的生理观察而衍生的病理生理学推断⁹。最后，已有学者证明，到目前为止为数不多的对COVID-19患者支气管镜标本进行特征分析的研究，其在阐明SARS-CoV-2的发病机制方面具有革命性意义¹⁰。

在他们的研究中，Sulaiman等人对142名感染SARS-CoV-2的患者进行了支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage），并使用互补分子技术（complementary molecular techniques）研究了下呼吸道的微生物群 (细菌和病毒) 和宿主免疫反应。通过利用这些方法的可靠性和解剖学相关的测量值，并收集严格判定的临床结局数据，作者确定了不良临床结局 (死亡或机械通气延长) 的新的分子预测因子¹。作者发现，下呼吸道细菌的总负担和分类特性 (通过支气管肺泡灌洗标本的分子特征) 是死亡和延长机械通气的独立预测因素。这一新的发现证实了之前对严重肺损伤的其他原因的观察结果¹¹，无论使用传统的基于培养的技术还是咽拭子，都未得到重视：在这个队列中，培养检测到的细菌联合感染不仅不能预测不良结果，而且时间匹配的上呼吸道群落中包含的细菌群落特征与肺泡标本不同。虽然一些研究试图将咽和直肠微生物群与COVID-19的临床特征联系起来，但当前的发现与先前的报道保持一致，即肺微生物群在校准肺泡免疫方面比口腔或较低肠道微生物群发挥更直接的作用¹²。

同样，作者发现SARS-CoV-2病毒载量 (一个相当有争议的话题) 的预后意义完全取决于取样的解剖位置。虽然肺泡标本中的病毒载量是一个令人信服的死亡率预测指标，但在时间匹配的上呼吸道标本中并非如此。虽然配对的上、下呼吸道标本的病毒载量在患者之间存在相关性，但不同解剖部位的预后意义差异肯定了COVID-19危重患者病毒复制的位点特异性，以及依赖替代样本的局限性。

最后，通过分析支气管肺泡灌洗标本中的宿主反应，作者发现死亡患者肺泡中SARS-CoV-2抗体 (抗刺突和抗-RBD) 浓度较低，且与病毒复制呈负相关 (使用亚基因组RNA进行量化)。同样，肺泡基因表达的差异，包括产生免疫球蛋白 (IgA和IgG) 所需基因的下调，预测了较差的临床结果。因此，与广为流传 (在概念上令人担忧) 的观点相反，作者为分子和位点特异性 (肺泡，alveolar) 提供了证据，表明病毒特异性免疫缺陷在进行性、非解决性肺损伤中发挥作用。

综上所述，Sulaiman等人的发现相当清楚地揭示了COVID-19异质性的暗物质。临床结果的变化部分是由肺泡病毒负荷、肺微生物群落和适应性肺泡免疫反应不足解释的。除了这些发现提出的直接研究问题 (例如，这些微生物和免疫肺泡特征是否代表严重COVID-19的可治疗特征，肺泡间隙的细菌负荷和病毒负荷是否是COVID-19危重患者的可行治疗靶点，以及肺泡抗SARS-CoV-2免疫球蛋白反应是否可以从治疗上增强) ，这些发现也提醒我们：如果我们渴望了解COVID-19等严重肺部感染的生物学原理，研究肺部本身是不可替代的。

本次调查使用的样本是在纽约市COVID-19病例首次激增期间获得的，处理手段反映了当时的临床实践。与当前COVID-19患者治疗方法有所不同的其中一个方面在于，在第一次激增期间，皮质类固醇和瑞德西韦这2种可能影响下呼吸道微生物环境的药物使用率较低。其他药物，如抗生素和消炎药，可能会影响我们的发现，因此我们认为它们是潜在的混杂因素。然而，我们并没有观察到这些药物的使用与临床结果相关。值得注意的是，尽管Sulaiman等人的院校以 ‘ 激增模式（surge mode）’ 响应，长岛和曼哈顿校区都没有遭受医务人员、物资或设备短缺的问题，启动MV的决定与护理标准没有区别。横断面研究设计排除了对该队列中微生物群落或宿主免疫反应的时间动态的评价，这可能为该疾病的发病机制提供了重要的见解。对于这些患者，在没有临床指征的情况下进行再一次支气管镜检查将是一项挑战，可能需要考虑其他侵袭性较小的方法来研究早期的下呼吸道，以及其在呼吸衰竭患者中随时间的连续变化。值得注意的是，在3个结果组的样本收集时间上并没有统计学上的显著差异。评估疾病过程中较早时间点的微生物信号，对于确定在使用广谱抗菌剂之前发生的变化也可能很重要。此外，本文所给出的下呼吸道样本数据仅限于那些在临床护理中接受过支气管镜检查的受试者。因此，非培养数据偏向于COVID-19患者，这些患者虽然病情危重，但在疾病严重程度谱中不能代表极端值。集中于早期样本收集时间点的调查可能有必要包括早期死亡或早期成功停用MV的患者。

总而言之，Sulaiman等人在此首次评估了使用宏基因组和宏转录组方法以及宿主免疫谱对需要侵袭性MV的COVID-19危重患者的下呼吸道微生物组。RNA宏转录组分析（RNA metatranscriptome analysis）显示，SARS-CoV-2的丰度与死亡率之间存在关联，这与通过靶向rRT-PCR评估病毒载量时发现的信息一致。这些病毒特征与较低的抗SARS-CoV-2尖峰IgG以及不良预后相关的下呼吸道宿主转录组特征相关。重要的是，通过培养和NGS数据，Sulaiman等人并没有发现继发性呼吸道病原体未经治疗感染与死亡率之间存在关联的证据。总之，这些数据表明，活跃的下呼吸道SARS-CoV-2复制和SARS-CoV-2特异性抗体反应差是需要MV的COVID-19患者死亡率上升的主要驱动因素。口腔共生菌 (如唾液支原体M. salivarium) 的潜在作用需要进一步探索。M. salivarium 可能会影响关键的免疫细胞，最近有报道称它在呼吸机获得性肺炎（ventilator-acquired pneumonia）患者中发病率很高。关键的是，Sulaiman的研究团队发现SARS-CoV-2回避和/或偏离了有效的固有/适应性免疫应答，这表明旨在控制病毒复制或诱导靶向抗病毒免疫应答的治疗可能是需要侵袭性MV的SARS-CoV-2感染住院患者最有希望的方法。

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