科研 | 北工大：连续流系统中实现部分硝化、增强生物除磷和原位发酵（PNPRF）及其转录水平的机制分析（国人佳作）

导读   

在连续流系统中同时进行部分硝化、生物除磷和污泥发酵在污水处理厂（WWTP）中面临着许多挑战。在这项研究中，开发了一种新工艺，在以Tetrasphaera为主的连续流系统中实现部分硝化、增强生物除磷和原位发酵（PNPRF）处理低碳/氮比（COD/N）实际生活污水。在进水没有外加碳源的情况下运行80天后，亚硝酸盐累积率（NAR）达到99.4%，PO43--P的去除效率为 100%；出水的总无机氮（TIN）浓度低于2 mg/L。与传统的生物脱氮除磷工艺相比，连续流PNPRF的日污泥排放量减少了61.9%。厌氧区下游污泥上清液DNA浓度为厌氧区上游的2.26倍，完整细胞百分比下降6.9%，坏死细胞增加8.3%，表明细胞裂解导致污泥排放量减少。厌氧期延长对nxrB基因转录反应的负面影响比amoA和hao基因更显著，从而导致稳定的部分硝化。氨氧化细菌（AOB）的活性高于亚硝酸盐氧化细菌（NOB），RT-PCR显示AOB的RNA表达高于NOB。在以Tetrasphaera为主导的连续流系统中实现部分硝化、强化生物除磷和原位发酵，解决了实际生活污水处理过程中碳源缺乏和污泥排放量大的问题。    

论文ID

原名：Achieving partial nitrification, enhanced biological phosphorus removal and in-situ fermentation (PNPRF) in continuous-flow system and mechanism analysis at transcriptional level

译名：连续流系统中实现部分硝化、增强生物除磷和原位发酵（PNPRF）及其转录水平的机制分析

期刊：Chemical Engineering Journal

IF：13.273

发表时间：2021.7.2

通讯作者：曾薇

通讯作者单位：北京工业大学城镇污水深度处理与资源化利用国家工程实验室

DOI号：10.1016/j.cej.2021.131098

实验设计

结果与讨论

1 连续流PNPRF反应器中的养分去除性能

图1显示了连续流反应器214天的养分去除性能，包括出水氮浓度、COD和总无机氮（TIN）、好氧区末端的NO2 --N和 NO3--N浓度，好氧区的NAR、出水PO43--P的浓度和PO43--P的去除效率。在第I阶段（第1-40天），连续流反应器中接种来自市政污水处理厂的污泥，没有亚硝酸盐积累。实际生活污水进水的COD/N比低于4，NH4+-N和COD的去除率分别达到100%和82%。好氧段末端亚硝酸盐浓度为0 mg/L。由于碳源缺乏，脱氮除磷效果不佳。出水总无机氮（TIN）和PO43--P的浓度分别约为20 mg/L和2 mg/L。

在第II阶段（第41-80天），将醋酸钠作为外部碳源添加到进水的实际生活污水中。连续流反应器进水COD/N比增加到5左右，出水COD浓度低于40 mg/L。II期HRT与I期一致。II期未观察到亚硝酸盐积累。TIN的出水浓度从I阶段的约20 mg/L下降到II阶段的约11 mg/L。随着进水中加入醋酸钠，与第I阶段相比，更多的碳源可能被PAOs同化并以PHA形式储存在厌氧区。在随后的好氧和缺氧区，使用PHA作为碳源去除了更多的PO43--P。结果，出水PO43--P的浓度为0，PO43--P的去除效率达到100%。

在第III阶段（第81-214天），为了解决实际生活污水处理的碳限制问题，建立了以Tetrasphaera为主的连续流PNPRF反应器。如图1a所示，流入的实际生活污水中没有添加外部碳，这与阶段I一致。连续流反应器厌氧区的HRT从阶段I和II的2 h增加到15 h。第III阶段，厌氧培养11 h后，挥发性脂肪酸（VFA）通过发酵排出，而Tetrasphaera对废弃活性污泥的发酵提供了去除生物养分的碳源。出水TIN浓度低于2 mg/L，TIN去除效率达到97.4%。在好氧段末端，NO2--N浓度超过30 mg/L，好氧段内NAR达到99.4%。在不添加外部碳源的情况下，PO43--P的去除效率达到了100%。与传统的硝化-反硝化和除磷工艺相比，通过建立以Tetrasphaera为主的连续流PNPRF反应器，大大降低了添加外源碳源的成本。

图1 连续流反应器中的养分去除性能。

2 连续流PNPRF反应器中的养分去除机理

为了研究连续流PNPRF反应器中的养分去除机理，对其中典型的循环进行了分析。图2a、图2c和图2e分别显示了阶段I中第36天、阶段II中第76天和阶段III中第210天的养分去除性能。图2b、图2d和图2f显示了PHB、PHV和糖原（Gly）的变化。

在第I阶段（第36天）和第II阶段（第76天），由于添加了外部碳源，厌氧段末端PO43--P的释放浓度从第36天的19.2 mg/L增加到第76天的27.51 mg/L。 出水PO43--P浓度从第36天的2.09 mg/L下降到第76天的0 mg/L。在第76天，缺氧相的TIN去除量是第36天的1.43倍。反硝化和除磷在第II阶段得到加强。该阶段PHA储存量是I阶段的1.38倍，好氧段和缺氧段PHA消耗量分别是I阶段的2.89倍和1.50倍（图2b和d）。

在阶段III（第210天）中，由于没有添加外部碳源，进水COD比阶段II降低了43%。需要说明的是，由于Tetrasphaera作为PAOs具有进行活性污泥发酵的能力，因此厌氧培养11 h后COD浓度增加，VFAs通过发酵排出至19.4 mg/L（图2e）。这或许可以解释第III阶段碳源添加的节省。由于发酵，在厌氧阶段也观察到NH4+-N释放。厌氧阶段结束时PO43--P的释放浓度是阶段II的1.57倍。在I期、II期和III期，缺氧区磷和亚硝酸盐/硝酸盐浓度均下降，表明该系统发生了反硝化除磷。微生物群落的分析也证实了反硝化磷酸盐积累生物的存在。I、II期PHA储存量分别下降45.42%和60.56%，PHA消耗量比I期和II期分别下降60.18%和82.93%（图2b，d和f）。出水PO43--P浓度为 0 mg/L，第III阶段去除效率达到100%。这些数据表明，本研究中的连续流PNPRF系统不依赖于PHA去除PO43--P，这由表1中所示的化学计量证实。III期无氧糖原消耗/乙酸吸收（Gly/HAc）显著高于I期和II期（p < 0.05），这表明在I期和II期中，相较于以Candidatus Accumulibacter为主的传统EBPR系统，由Tetrasphaera主导的连续流PNPRF反应器中P的去除使用糖酵解途径比三羧酸（TCA）循环更具可能。III期厌氧PHA产量/醋酸吸收（PHA/HAc）显著低于I和II期（p < 0.05），III期有氧P吸收/PHA消耗（P/PHA）显著高于I期和II期（p < 0.05）。这表明由Tetrasphaera主导的连续流PNPRF系统不依赖PHA进行内部碳储存和PO43--P去除。III期厌氧磷释放/乙酸吸收（P/HAc）为0.48 mol P/mol C，显著高于I期和II期（p < 0.05）。这表明与III期相比，糖原累积类生物代谢在I期和II期进行的更多。由于Tetrasphaera可以代谢氨基酸以去除P，因此测量了典型循环中氨基酸的变化，如图3a所示。图3a中的值由lg x计算，其中x是氨基酸对LC-MS/MS的响应。如图3a所示，随着PO43--P的释放，氨基酸在厌氧阶段储存，然后随着PO43--P的吸收在好氧和缺氧阶段逐渐消耗。这表明氨基酸是连续流PNPRF反应器中重要的细胞内代谢物。在本研究中检测到的氨基酸中，谷氨酸储存量最高。NAR在好氧阶段末端达到99.4%。在第210天，缺氧阶段的TIN去除量分别是第36天和第76天的2.56倍和1.79倍。在第210天，TIN的出水浓度为1.9 mg/L（图2e）。III阶段通过厌氧发酵提供VFAs，反硝化的电子受体由II期的NO3--N变为NO2--N，进一步降低了碳源的消耗。这些数据表明在不添加外部碳源的情况下在缺氧段中去除TIN的良好性能。此外，缺氧区反硝化除磷有利于连续流PNPRF反应器的脱氮除磷。

图S2显示了连续流反应器三阶段中COD、TIN和PO43--P的质量平衡。如图S2a和图S2g所示，虽然I期和III期的进水COD负荷相似，但由于污泥发酵，III期厌氧区的出水COD负荷约为I期的1.65倍，大大减少了外加碳源的需求，节约了污水处理的运行成本。在好氧区和缺氧区消耗碳源后，连续流反应器的出水COD负荷在III期（480.4 mg/d）低于I期（538.6 mg/d）和II期（572.1 mg/d），说明厌氧区污泥发酵不会对出水水质造成任何问题。如图S2b、图S2e和图S2h所示，TIN负荷仅在阶段III的厌氧区增加，而在阶段I和阶段II的厌氧区减少。这是因为污泥发酵导致第III阶段厌氧阶段的NH4+-N释放。III期缺氧区的TIN去除量（-1394.4 mg/d）高于I期（-523.2 mg/d）和II期（-792 mg/d），表明在缺氧区，无需添加外部碳源。因此，第III阶段连续流反应器的出水TIN负荷（45.4 mg/d）低于第I阶段（464.5 mg/d）和第II阶段（270.5 mg/d）。如图S2c、图S2f 和图S2i所示，虽然没有向进水中添加外部碳，但厌氧区的PO43--P释放负荷和III期好氧和缺氧区的PO43--P吸收负荷是三个阶段中最高的。III期连续流反应器出水PO43--P为0，在低COD/N比的实际生活污水处理中实现了良好的除磷性能。

 图2 典型循环中养分去除和内部碳源的变化。（a）和（b）在第一阶段的第36天；（c）和（d）在第二阶段的第76天;（e）和（f）在第三阶段的第210天。

表1 连续流PNPRF反应器中的PAOs化学计量（平均值 ± 标准偏差；n = 3）（原文表3）。

3 连续流PNPRF反应器中的污泥减量

如上节所述，活性污泥作为III期厌氧阶段发酵的底物。由Tetrasphaera主导的连续流PNPRF系统中，除了稳定的部分硝化作用外，还观察到污泥产量减少。图S3显示了连续流反应器中日污泥产量的变化。由于外加碳，II期日污泥产量比I期增加1.50倍。III期进水量与I期相同。但III期日污泥产量下降，在第I阶段和第II阶段分别下降了45.6%和61.90%。

为了研究污泥产量减少的机制，连续流反应器中上清液样品、完整细胞和坏死细胞的DNA浓度如图3b所示。在I期和II期，厌氧区下游完整细胞和坏死细胞的百分比与厌氧区上游无显著差异（p > 0.05）。污泥上清液中的DNA浓度也是如此（p > 0.05）。但在III期，厌氧区下游完整细胞百分比明显低于厌氧区上游（p < 0.05），厌氧区后坏死细胞比例明显高于厌氧区前（p < 0.05）。这表明III期细胞的稳定结构被破坏。此外，在第III阶段，厌氧区下游污泥上清液中的DNA浓度显著高于厌氧区上游（p < 0.05）。这些数据表明细胞裂解是由于污泥发酵而发生的，有机物在连续流PNPRF反应器的第III阶段排出。这解释了厌氧培养11小时后VFA的增加，从而节省了污水处理中的外部碳源，也解释了第III阶段污泥产量减少的原因。与I期和II期以Candidatus Accumulibacter为主的EBPR系统相比，III期以Tetrasphaera为主的连续流PNPRF系统节省了碳源添加量，减少了污泥排放，降低了污水处理的运行成本。

图3 （a）典型循环中氨基酸的变化，（b）污泥上清液、完整细胞和坏死细胞中的DNA浓度。

4 连续流PNPRF反应器中稳定部分硝化的机理

为了研究连续流PNPRF反应器中稳定部分硝化的机制，功能基因的RNA表达、基因和转录水平的种群动态以及AOB和NOB的活性如图4所示。图4a和图4b分别显示了硝化细菌在II期第76天和III期第210天的amoA、hao和nxrB基因的RNA表达。在本研究中，RNA表达定义为 (ax-a0)/a0，其中a0是amoA、hao和nxrB基因在II期开始时的初始转录，拷贝数/g MLSS；ax是amoA、hao和nxrB基因在II期和III期的转录，拷贝数/g MLSS。如图4a所示，在II期厌氧和缺氧阶段，amoA、hao和nxrB基因的RNA表达下降。在好氧段，amoA和hao基因在3 h开始响应，nxrB基因在4 h开始响应。这表明与amoA和hao基因相比，nxrB基因的响应更缓慢。这一结果与前人的研究一致，表明厌氧和缺氧阶段的干扰抑制了NH4+-N氧化为NO2--N和NO3--N，且AOB的活性恢复早于NOB。图4b显示了III期的RNA表达。在厌氧期延长抑制15 h后，amoA、hao和nxrB基因的RNA表达抑制分别是II期的1.75倍、2.62倍和4.64倍。在好氧段，amoA基因在15.5 h开始响应，hao基因在16 h开始响应。然而，nxrB基因在整个好氧阶段都没有响应。与amoA和hao基因相比，延长厌氧阶段对nxrB基因的负面影响更显著，这是在III期连续流PNPRF反应器中实现稳定部分硝化的主要原因。

图4c显示了AOB和NOB在基因和转录水平上的种群动态。该值由lg x计算，其中x是通过QPCR和RT-PCR测量的基因拷贝数和转录拷贝数。III期NOB（Nitrobacter和Nitrospira）丰度显著低于I期和II期（p < 0.05），AOB则较高（p < 0.05）。硝化细菌（AOB+NOB）中AOB的比例从I期的19.12%增加到III期的99.79%。AOB是第III阶段导致连续流PNPRF反应器中稳定的部分硝化作用的主要硝化细菌。此外，AOB和NOB的活性如图4d所示，NOB的活性在I和II阶段高于AOB，在连续流反应器中没有亚硝酸盐积累。在阶段III中，AOB的活性约为NOB的10倍，导致连续流PNPRF反应器中的NAR为99.4%。

图4 （a）和（b）功能基因在II期第76天和III期第210天的RNA表达谱，（c）基因和转录水平的种群动态，（d）连续流反应器中AOB和NOB的活性。

5 基因和转录水平的微生物群落分析

图5显示了通过高通量测序测量的基因和转录水平的前8位微生物。确定了II期和III期微生物群落的cDNA差异。需要注意的是，Candidatus Accumulibacter是I期和II期的优势PAO，而Tetrasphaera的相对丰度为0。先前的研究表明，内源性反硝化以Candidatus Competibacter为主，以还原NO2--N和NO3--N。在本研究中，A/O/A工艺的后反硝化分别在I和II阶段去除了11.6 mg/L和16.6 mg/L的硝酸盐。Candidatus Competibacter的相对丰度在I期和II期的转录水平上分别为11.2%和18.9%。在II期，Nitrospira（NOB）的基因和转录水平分别相对丰度是Nitrosomonas（AOB）的2.89倍和2.24倍，该结果解释了为什么在第II阶段没有亚硝酸盐积累。

在III期，Candidatus Accumulibacter的相对丰度下降到0。Tetrasphaera在基因和转录水平上的相对丰度分别为31.2%和72.8%，表明Tetrasphaera是III期的优势PAO。这些数据还表明，延长厌氧段对具有发酵能力的Tetrasphaera比Candidatus Accumulibacter更有利。Candidatus Competibacter在III期的相对丰度显著低于II期（p < 0.05）。图S4和图S5显示了Candidatus Accumulibacter和Candidatus Competibacter在III期的丰度和转录活性的变化。在厌氧段的HRT增加到15 h并且没有向进水中添加外部碳的情况下，Candidatus Accumulibacter和Candidatus Competibacter的丰度和活性在阶段III中下降。此外，Candidatus Accumulibacter的丰度和活性衰减率高于Candidatus Competibacter。先前的研究证实，低有机负荷和饥饿会对Candidatus Accumulibacter和Candidatus Competibacter产生负面影响。在第III阶段，Nitrosomonas在基因和转录水平上的相对丰度分别是Nitrospira的13.93倍和29.86倍，确保了连续流PNPRF反应器中稳定的部分硝化。

图5 属水平微生物群落的前8菌属以及II期和III期的cDNA差异。6 本研究的意义

本研究中养分去除性能与其他系统的比较如表2所示。大部分关于同步部分硝化-内源反硝化和除磷的研究都是在SBR中进行的。研究连续流系统中的去除性能与污水处理厂的污水处理更密切相关。先前的研究在连续流反应器中实现了部分硝化，但没有研究去除PO43--P和污泥减产。一项研究通过添加初级污泥发酵物作为外部碳，在连续流系统中实现了N和P去除，而没有亚硝酸盐积累，与厌氧/缺氧/好氧（A2O）工艺相比，观察到污泥产量减少了6%。本研究中，Tetrasphaera在III期基因和转录水平的相对丰度分别为31.2%和72.8%。同时部分硝化-内源性反硝化和除磷过程在连续流系统中运行，没有向进水中添加任何额外的碳。NAR达到99.4%，对TIN和PO43--P的去除效率分别为97.4%和100%。与传统生物脱氮除磷工艺I期和II期相比，以Tetrasphaera为主的连续流PNPRF系统III期污泥日排放量分别下降了45.6%和61.9%。

污水处理厂的污水处理系统碳源缺乏、污泥排放量大和部分硝化不稳定是处理实际生活污水的主要问题。图6显示了本研究中由Tetrasphaera主导的连续流PNPRF工艺与传统的硝化-反硝化和除磷工艺相比的优势。本研究在进水中不添加外加碳源的情况下，仍具有良好的脱氮除磷性能，解决了实际生活污水处理中碳量有限的问题。由于Tetrasphaera作为PAOs具有发酵能力，VFAs通过发酵排出体外，为污水处理提供碳源。细胞裂解解释了减少日污泥排放量的原因，节省了污水处理中的污泥处理成本。此外，在连续流PNPRF系统中建立了稳定的部分硝化作用。与传统硝化-反硝化除磷工艺中作为反硝化电子受体的NO3--N相比，本研究中作为反硝化电子受体的NO2--N减少了对碳源的需求，因为NO2--N的还原当量较少。与传统的以Candidatus Accumulibacter为主的EBPR系统相比，以Tetrasphaera为主的PNPRF系统节省了碳源，减少了污泥排放量，大大降低了污水处理的运行成本。

表2 本研究与其他系统中养分去除性能的比较（平均值 ± 标准偏差；n = 3）（原文表4）。

  图6 与 传统的硝化-反硝化和除磷工艺相比，本研究中以Tetrasphaera为主导的连续流PNPRF工艺的优势。

结论

本研究开发了一种新工艺，在以Tetrasphaera为主的连续流系统中实现部分硝化、EBPR和原位发酵，以处理低COD/N实际生活污水。虽然进水没有添加外部碳源，但本研究取得了良好的脱氮除磷性能。延长厌氧期不仅有利于Tetrasphaera克服具有发酵能力的Candidatus Accumulibacter，而且与amoA和hao基因相比，对nxrB基因的转录反应产生更强的抑制作用，从而导致稳定的部分硝化。此外，在延长的厌氧阶段，由于污泥发酵而发生细胞裂解，导致每日污泥排放量减少。总体而言，本研究解决了连续流系统部分硝化不稳定、碳源不足、处理实际生活污水过程中污泥排放量大等问题。