科研 | 安徽医大：肠道微生物组是否部分介导了空气污染物暴露对肝功能的影响？基于精神分裂症患者的证据（国人佳作）

导读   

空气污染可能会改变肠道微生物的组成，并导致与肝脏相关的代谢紊乱。而精神分裂症常伴有肝功能障碍。但目前尚不清楚空气污染物是否通过肠道微生物影响精神分裂症患者的肝功能。在本文中，我们旨在研究长期空气污染物对精神分裂症患者肠道微生物组和肝功能的影响，并评估微生物组在其中的作用。我们通过招募精神分裂症患者，然后检测其血清生化指标。一年前的空气污染物暴露情况采用反距离权重插值（inverse distance weighting）进行追溯模拟。本研究评估了精神分裂症受试者中空气污染物、肠道微生物群和肝功能指标之间的关联，然后进一步探讨了肠道微生物组在其中的介导作用。

结果表明，二氧化氮（NO2）、一氧化碳（CO）、臭氧（O3）、空气动力学直径≤ 10 μm的颗粒物（PM10）和细颗粒物（PM2.5）解释了2.68% ~ 10.77%的精神分裂症患者肠道微生物组组成（目水平）的变化（所有P < 0.05）。网络相关分析表明，在精神分裂症患者中，空气污染物和肝功能指标主要与厚壁菌门、放线菌门和变形菌门有关。长期暴露于NO2显著增加了精神分裂症患者的γ-谷氨酰转肽酶（GGT）和谷丙转氨酶（GPT）的水平。长期暴露于NO2与GGT和GPT的关系中，Coriobacteriales分别介导了13.98 %和49.56%（所有的P < 0.05）。总之，长期暴露于NO2与精神分裂症患者肝功能损害呈正相关，其中肠道微生物发挥了介导作用。两条途径——“NO2 - Coriobacteriales- GGT”和“NO2 - Coriobacteriales-GPT”将为精神分裂症患者肝功能障碍的干预提供科学依据。

论文ID

原名：Does the gut microbiome partially mediate the impact of air pollutants exposure on liver function? Evidence based on schizophrenia patients.

译名：肠道微生物组是否部分介导了空气污染物暴露对肝功能的影响？基于精神分裂症患者的证据

期刊：Environmental Pollution

IF：8.071

发表时间：2021.9.11

通讯作者：苏虹

通讯作者单位：安徽医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系

DOI号：10.1016/j.envpol.2021.118135

实验设计

为了确保相似的饮食习惯，在同一地区招募了248名精神分裂症受试者（排除了在6个月内使用过抗生素、类固醇等物质，吸烟、饮酒以及长感染，慢性疾病的人群）。记录受试者基本人口统计信息，并采集血液样本，测定生化指标。结合监测站的空气污染物数据，使用IDW法来预测个体的空气污染物暴露情况。在同一天收集受试者的粪便样本，进行16S rRNA测序。分析了空气污染物暴露情况、肠道微生物组和肝功能指标之间的关联。并通过中介分析探索精神分裂症患者可能存在的“空气污染物-肠道微生物组-肝功能”机制途径。    

结果

1 受试者常规指标

受试者常规指标如表1所示。本研究共纳入248名精神分裂症受试者，其中156名为女性（62.9%）。所有受试者的平均年龄为37岁。超过一半的受试者目前正在服用抗精神病药物，其中大部分是非典型抗精神病药物。精神分裂症患者的常规情况（如患病时间和用药情况）与GGT（γ-谷氨酰转肽酶）或GPT（谷丙转氨酶）水平无显著差异。与对照组相比，精神分裂症患者拥有高水平的GGT或GPT往往会与较高的BMI、CO暴露情况、NO2暴露情况、GOT、ALP、TP和GLB相关。

表1 受试者常规指标。

缩写：SCZ，精神分裂症患者；SCZa，GGT或GPT 水平较高的精神分裂症患者；SCZb，GGT和GPT水平正常的精神分裂症患者；BMI，体重指数；CO，一氧化碳；NO2，二氧化氮；O3，臭氧；SO2，二氧化硫；PM2.5，细颗粒物；PM10，空气动力学直径≤10μm的颗粒物；GGT，γ-谷氨酰转移酶；GPT，谷丙转氨酶；GOT，谷草转氨酶；ALP，碱性磷酸酶；TBIL，总胆红素；DBIL，直接胆红素；TBA，总胆汁酸；TP，总蛋白；GLB，球蛋白；ALB，白蛋白；TC，总胆固醇；GLU，葡萄糖。

2 空气污染物暴露对精神分裂症肠道微生物组成的影响 由图S3中的稀释曲线可见，肠道微生物组的多样性随着测序深度的增加没有发生显著的变化，表明本研究中的测序量足够。空气污染物以及受试者常规指标方差扩大因子（VIF）如表S1所示。首先，使用Bray-Curtis相异度对目水平上的肠道微生物组测序数据进行多维尺度变换（multidimensional scaling，MDS）（图1和表S2）。在所有空气污染物变量中，在前一年暴露于NO2、CO、O3、PM2.5和PM10与精神分裂症患者肠道微生物组在目水平上的组成变化具有显著的相关性（R2 = 3.65 %、2.68 %、10.77 %、5.16 %和7.50 %；所有的P < 0.05）。在科水平，RDA分析表明，长期暴露于空气污染物NO2、CO、O3、PM 2.5和PM 10与精神分裂症患者肠道微生物组的组成变化显著相关（表S3）。校正过后的协变量，如患病时间、抗精神病药和采样季节以及住院治疗的时间，同样也影响了肠道微生物组在目和科水平上的组成变化（表S2，S3）。在一周前暴露于空气污染对肠道微生物组（目水平）组成变化的影响如表S4所示。网络相关性分析表明，空气污染物会对特定肠道微生物产生影响。在精神分裂症患者肠道微生物组中，厚壁菌门、放线菌门和变形菌门的相对丰度与空气污染相关（图2）。其中，NO2的暴露与精神分裂症患者肠道微生物组中放线菌目以及Coriobacteriales目的相对丰富度呈负相关。 3 精神分裂症患者肠道微生物组与肝功能指标的相关性

 如图2所示，厚壁菌门、放线菌门、变形菌门与GGT、GPT、GOT、TBIL、DBA以及GLB等几个肝脏功能的生化指标相关。例如，Coriobacteriales目和Eubacteriaes目的相对丰度与GGT和GPT水平呈负相关。

图1. 精神分裂症患者（SCZ）长期空气污染物与肠道微生物组分布（目水平）之间的冗余分析（RDA）。每个圆圈代表一个精神分裂症患者肠道微生物组；R2值对应于由每个变量解释的肠道微生物群组成的变异比例。

 图2. 精神分裂症患者长期空气污染物暴露（前一年）、特定肠道微生物（目水平）与肝功能指标的网络相关性分析。NO2lag365，前一年的二氧化氮暴露；PM2.5lag365，前一年的细颗粒物暴露；PM10 lag365，前一年的颗粒物暴露；COlag365，前一年与二氧化碳的接触；O3lag365，前一年的臭氧暴露。

4 肠道微生物对空气污染物与精神分裂症患者肝功能指标相关性的介导作用  

结合空气污染物对精神分裂症肠道微生物的影响以及精神分裂症患者肠道微生物组与肝脏功能指标相关性的结果。可以发现，Eubacteriales目、Coriobacteriales目以及丙酸杆菌目可能是长期暴露于空气污染物（前一年暴露于NO2、CO、O3、PM2.5和PM10）与某些肝功能指标（GPT、GGT和 GLB）之间关联的关键节点。此外，在网络图中没有发现其他潜在途径。例如，长期暴露于NO2和O3都与Acidaminococcales目相关，但Acidaminococcales目与肝功能生化指标不相关。在短期暴露于空气污染的网络图（图S4）中，Coriobacteriales目可能是“短期NO2暴露 - GGT/GPT”途径的关键节点。

我们在初步发现肠道微生物组在空气污染与肝功能生化指标关系中可能介导作用的基础上，通过调整年龄、性别、BMI、受教育程度、采样季节、患病时间、抗精神病药物使用等协变量，建立多元线性回归模型。如图S5所示，我们发现长期暴露于NO2与Coriobacteriales目（R2 = 0.242, P < 0.01）、GGT（R2 = 0.188, P < 0.05）和GPT（R2 = 0.224，P < 0.01）相关，并且Coriobacteriales目也与GGT（R2 = 0.175，P < 0.01）和GPT（R2 = 0.245，P < 0.01）显著相关。此外，长期CO暴露也与GGT显著相关，其中Coriobacteriales目的介导比例仅为0.06%（图S5和表2）。如表2所示，Coriobacteriales目在“NO2 - GGT”和“NO2 - GPT”途径中起介导作用（所有的P < 0.05），所占比例分别为13.98 %和49.56 %。对于短期空气污染物暴露，Coriobactereriales目在“NO2 - GGT”和“NO2 - GPT”途径中发挥了潜在的介导作用，比例分别为66.54%、55.50%（所有的P < 0.05）（表S5）。

表2. Coriobacteriales在长期NO2暴露与肝功能指标关系中的介导作用

 图3. SCZa组（n = 52）与SCZb组（n = 52）肠道微生物组（目水平）的差异。SCZa：GGT或GPT水平升高的精神分裂症患者；SCZb；GGT、GPT水平正常的精神分裂症患者；两组比较采用Wilcoxon秩和检验；*P< 0.05，**P < 0.01。

5 肠道微生物对空气污染物与精神分裂症患者肝功能指标相关性的介导作用 根据医学参考值范围将精神分裂症受试者分为肝功能异常组（SCZa，GGT与GPT水平较高的患者）和无肝功能异常组（SCZb，GGT与GPT水平正常的患者）（表1）。肠道微生物多样性的测序结果（Venn图和稀释曲线），如图S3和S6所示，两组受试者肠道微生物α多样性无统计学差异（表1）。如图3所示，SCZa组受试者的peptostreptococcales - Tisssierellales，Lactobacillales，Coriobacteriales以及Erysipelotrichales的相对丰度显著降低，而Veillonellales - Selenomonadales和clostridia_UGG-014的相对丰度升高。通过建立随机森林模型，来估算不同微生物组（目水平）的预测值，随机森林模型显示出相对较高的敏感性（0.64）和特异性（0.75）（图S7a）。ROC曲线（图S7b）也显示了模型的预测效果较为显著（AUC = 0.696）。通过比较Gini指数的平均下降值，我们发现Coriobacteriales目的Gini指数最高，表明了它是预测模型中最重要的预测因子（图S7c）。

讨论

在本研究中，我们提出了以精神分裂症患者为研究对象的两种可能途径， “NO2 - Coriobacteriales-GGT”和“NO2-Coriobacteriales-GPT”。这一发现可以作为与空气污染物相关对人体健康产生危害的新证据。我们的研究是第一个将空气污染与精神分裂症患者的肠道微生物群和肝功能联系起来的研究。我们发现，长期NO2暴露显著增加了精神分裂症患者GGT和GPT水平，肠道微生物Coriobacteriales目分别介导了13.98%和49.56%。此外，考虑到精神分裂症与肝功能障碍之间存在严重的合并症，我们同样研究了Coriobacteriales目对肝功能障碍的精神分裂症的潜在诊断价值。本研究的结果将为空气污染所致精神分裂症患者肝功能障碍的机制研究提供依据，并为探索“肠-肝”轴提供新的研究方向。

人们已经在啮齿动物模型中广泛的探索了空气污染如何导致肠道微生物组失调以及可能对健康产生不良影响，但是对于人类的研究仍然十分有限。最近的两项研究与我们发现暴露于高水平的NO2可以显著改变肠道微生物组的组成结果一致。在一项针对43名超重和肥胖青少年的研究中，分析了与交通相关污染物与肠道微生物组之间的关系，结果发现，Bacteroidaceae与Coriobacteriaceae可以解释24%和29%的NO2暴露与空腹血糖水平之间的相关性。我们的研究还发现长期暴露于NO2、CO、O3、PM2.5和PM10与肠道微生物组的组成变化之间存在显著关联。前人的研究表明，O3暴露显著解释了肠道微生物组成的11.2%，，这与我们的研究结果（10.77%）高度一致。但是，由于不同国家或地区的空气污染物分布特征和浓度可能不同，在与其他研究进行比较应谨慎。

精神分裂症患者与空气污染相关的肠道微生物紊乱和肝功能障碍可能具有其独特的机制。越来越多的人们认识到，消化道是空气污染物影响肠道微生物组的主要途径。在鼻咽部和口咽部直接沉积以及通过粘液纤毛清除间接沉积的颗粒物（PM）被吞咽后，空气污染物便进入胃并到达胃肠道的其余部分。PM进入肠道后，可通过诱导线粒体活性氧（ROS）产生和细胞死亡直接破坏肠道紧密连接蛋白，增加肠壁通透性，从而加剧细菌迁移。我们的研究结果表明，长期暴露于PM2.5会影响肠道微生物的组成。但是短期暴露PM2.5对肠道微生物的组成没有显著影响，这可能与PM2.5毒理学上的生物积累有关。关于NO2等气态污染物如何影响肠道微生物组的证据不足。研究表明，NO2显著增加了炎症性肠病的发病风险，表明了炎症反应可能是空气污染物参与调节肠道微生物群的关键途径之一。因此，空气污染暴露下促炎细胞因子引发的全身炎症也可能是扰乱肠道微生态的一种方式。此外，最近有研究发现，肠道微生物组及其代谢物如短链脂肪酸（SCFA）可以参与O3相关的呼吸道反应，这表明了肠道微生物组在O3与其对人体健康影响之间的起着介导作用。然而，长期O3暴露对肠道微生物组成的影响与PM2.5等污染物不同，这可能与该地区污染物的特性有关。在未来工作的重点是合作管理各种空气污染物。

空气污染物的源解析可以为空气污染物的化学成分和来源提供依据。例如，之前的一项研究收集了中国安徽省每季度连续的PM2.5和PM10的环境样本进行源解析。结果表明，主要污染源是汽车尾气、二次硝酸盐和粉尘等。此外，作为中国最发达的地区之一，长三角地区（YRD）O3污染问题也十分严重。通过对不同地区来源O3贡献的分析，揭示了安徽地区O3是通过垂直混合和水平平流输送至长三角地区的地区。研究表明，硝酸盐和O3可显著调节肠道微生物组及其代谢以及肝功能（如GPT和GOT水平的升高）。虽然目前还没有关于NO2源解析的研究，但目前关于空气污染物源解析的研究可以证实了我们关于NO2（硝酸盐和O3的前体之一）对肠道微生物组和肝功能影响的发现。尽管如此，未来对日常空气污染物来源的研究将进一步优化区域环境治理和健康促进。

关于是哪一种肠道微生物介导了空气污染与肝功能的关系，还有待进一步研究。属于放线菌门的Coriobacteriales目是NO2暴露与肝功能（GGT和GPT水平）之间的关键节点。最近的一项综述显示，克罗恩病和溃疡性结肠炎患者肠道中Coriobacteriaceae的相对丰度显著低于对照组，表明了Coriobacteriaceae可能是维持肠道环境稳定的关键因素。由于短链脂肪酸的产生是Coriobacteriaceae及其所包含的属主要功能之一，我们推测SCFAs的减少可能是Coriobacteriaceae与肝功能之间的关键因素。在一项为了探究三种主要SCFAs（醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐）对小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）表型的影响的随机、双盲、安慰剂对照临床试验中，研究者发现，SCFAs组的GGT和GPT水平显著降低。此外，SCFAs组可显著降低血清中GGT、GPT水平和肝脏中TC水平，进一步缓解肝脏脂肪变性和炎症。这一研究发现以及我们的结果，证明了产生SCFAs的微生物（如Coriobacteriaceae）在维持肠道稳态和正常肝功能方面的关键作用。此外，我们还发现患有肝功能障碍的精神分裂症患者的Lactobacillus（SCFAs生产菌）丰度降低。

在过去的研究中，主要关注的是精神分裂症患者肠道微生物组的变化，探索肠道微生物组的诊断价值。在本研究中，肠道微生物组紊乱可能是精神分裂症伴随代谢紊乱的危险因素。鉴于精神分裂症患者肝功能障碍的共病严重，因此探索肠道微生物组对肝功能障碍精神分裂症患者的诊断价值具有重要意义。随机森林模型显示，肠道微生物组对精神分裂症患者肝功能障碍预测准确性相对较高，揭示了Coriobacteriales目、Erysipelotrichailes目和Lactobacilales目作为生物标志物具有潜在价值。这使我们更加确信了肠道微生物群失调导致精神分裂症患者肝功能障碍的假设。在接下来的研究中，需要进一步研究差异微生物尤其是Coriobacteriales的作用机制，并进一步开发它们作为精神分裂症患者肝功能障碍的生物疗法。

本研究的创新性在于，我们在精神分裂症患者中，将受空气污染物影响、肠道微生物组和肝功能指标相联系，并初步提出了空气污染物影响精神分裂症“肠 - 肝轴”的机制证据，对精神分裂症患者肝功能障碍患者的早期干预具有重要意义。

在暴露情况的测定方面，我们采用IDW方法来评估患者对空气污染物的暴露程度，这比直接从相邻监测站获得的数据更能准确反映个体暴露情况。此外，在控制了年龄、性别、BMI、教育程度、采样季节、患病时间、抗精神病药物等协变量后，通过中介分析及计算了肠道微生物组的介导比例，增加了我们结果的可信度。在本研究中，同样也存在一些局限性。首先，饮食会影响肠道微生物组。由于在本研究中可行性的限制，我们没有收集到足够的所有受试者的饮食数据。参与研究的受试者来自中国的同一省份，这表明受试者的饮食习惯普遍相似，但在未来的研究中还需要对更详细的饮食数据进行调查。其次，虽然我们选择了处于发病期的患者（PANSS评分 > 60），以尽可能保持疾病状态的一致性，但其中超过一半的患者正在服用抗精神病药物。为了消除抗精神病药物对肝功能的不良反应，接下来的研究需要在回归模型中控制抗精神病药物使用的情况下，招募未使用药物精神分裂症患者。第三，没有获得户外活动时间、室内污染情况等其它信息，可能导致暴露分类错误。仅使用监测站的数据，对个体暴露的准确性测定不够，需要在进一步研究中获取更准确的信息。最后，肠道微生物组的高通量16s rRNA测序可能不足以探索肠道微生物组的功能，越来越多的研究倾向于使用鸟枪宏基因组测序，来进一步测定遗传功能的潜力。

结论

精神分裂症患者长期暴露于NO2与肝功能障碍呈正相关，其中肠道微生物组失调在其中发挥着介导的作用。 鉴于精神分裂症与肝功能障碍严重共病，创新性的提出了“NO2 - Coriobacteriales - GGT”和“NO2 - Coriobacteriales - GPT”两条通路，这将为肝功能障碍精神分裂症的早期识别和靶向干预提供科学依据。