Nature重大突破：张毅团队破解染色体外环状DNA三大谜团

作为生命的遗传物质，DNA可分为线性和环状两种。真核生物基因组染色体DNA以线性方式存在，而细胞器 （线粒体和叶绿体） 、绝大多数细菌、部分病毒基因组DNA则以环状形式存在。 染色体之外环状DNA （eccDNA，extrachromosomal circular DNA） 指在真核生物中发现的，染色体外的、非线粒体、非叶绿体环状结构DNA。eccDNA的发现 （1964） 甚至早于广泛熟知的线粒体DNA 和细菌质粒DNA ，两者分别于1966年和 1967年被显微镜观察证实为环状。 历经多半个世纪的研究，人们对eccDNA与基因组DNA的序列高度同源，已经达成共识，但因其尺寸差异巨大：从数百bp到数百kb不等，研究人员据此提出了多种命名，microDNA主要指400bp以内的环状DNA ，ecDNA （extrachromosomal DNA） 被用以描述在癌细胞中发现的、尺寸数百kb以上的染色体外DNA，其巨大尺寸，足以容纳全长基因和DNA复制起始位点，因此能自主复制和扩增，并与癌基因的扩增和癌症的发生有关。 而eccDNA被用来指比ecDNA小的所有染色体外环状DNA，这些eccDNA几乎存在于所有的真核细胞系和组织器官中，与染色体DNA相比较，其丰度极低，含量易变。 迄今为止，关于eccDNA三大基本问题仍然没有答案： 1，eccDNA与基因组的序列同源性是否具备特异性 （ 从哪来 ） ？ 2，eccDNA的产生机制是什么 （ 怎么来 ） ？ 3，eccDNA有无生物学功能 （ 做什么 ） ？ 2021年10月20日，美国哈佛医学院、波士顿儿童医院 张毅 教授实验室在 Nature 期刊在线发表了题为： eccDNAs are apoptotic products with high innate immunostimulatory activity 的研究，对上述三个基本问题做出了回答。

张毅 教授实验室在表观遗传在胚胎早期发育的调控作用，做了大量杰出的工作 。早期胚胎发育过程中，基因组中大量的转座子、逆转座子会被激活。这些激活的转座子及逆转座子可能会再插入，破坏基因组稳定性。因此胚胎如何避免活性转座子、逆转座子对基因组的破坏，是一个重要的科学问题。其中一个合理的假说是：激活后转座子和逆转座子最终以eccDNA方式存在，而避免了重新插入破坏基因组。为了验证这一假说，张毅教授实验室五年前开始对eccDNA展开研究。 有效地分离和纯化研究对象，是取得研究进展的先决条件。eccDNA在生物样本中丰度极低而其环状结构又极易受损，双链上任意位点的断裂均会将环状变成线性，而导致其丢失。有效的分离纯化一直是eccDNA 研究的一大难题。 传统的eccDNA分离纯化方法主要分为两步：1、碱性裂解复性粗提环状DNA；2、核酸外切酶选择性消化线性DNA。然而，文章作者发现，传统的eccDNA纯化方法远不能有效分离到满意纯度的环状DNA, eccDNA样品中60-80%的分子仍然呈线性，这与近10年来的研究报道中的结果一致。作者推测，天然生物样本中的DNA，可能存在多种修饰和复杂结构，如氧化 （oxidation） 、交联 （cross-link） ，DNA复制叉、十字结 （Cruciform） 、脱氧鸟嘌呤四联体 （G-quadruplex） 等。这些复杂结构，极可能抑制了核酸外切酶的作用，使单依靠核酸外切酶消化、得到纯环状DNA，变得不可能。 鉴于此，研究人员在优化传统的碱性粗提环状DNA和核酸外切酶消化线性DNA的基础上，增加了一个纯化步骤：从核酸外切酶消化产物中选择性回收环状DNA。新的方法实现了eccDNA样品在显微镜镜检时，95%以上的DNA分子呈环状 （图1） 。与此同时，新方法还有耗时短、稳定性高的特点：将传统耗时一周的分离纯化过程压缩到一天内完成；对平行样品、批次样品间的eccDNA纯化，表现出很好的平行性和高可再现性。 为了得到每一个eccDNA分子环的准确序列信息，研究人员还将滚环扩增 （rolling cycle amplification） 和第三代的纳米孔测序技术 （Oxford Nanopore） 结合 （图1） ,实现了仅用三代测序获取eccDNA的全长序列。  

图1，(a) 新的环状DNA的纯化和测序方法；(b) eccDNA琼脂糖凝胶电泳图；（c）eccDNA分子的原子力显微镜镜检图。 为了避免普通细胞系基因组中可能存在的突变、重组、结构紊乱等因素对其eccDNA与参考基因组DNA （reference genome） 序列同源比对分析的影响，作者选择从基因组相对稳定的小鼠胚胎干细胞系中提取eccDNA进行研究，获取了160多万个eccDNA分子的全长序列信息及基因组来源位置信息。分析发现，eccDNA随机来源于基因组片段，包括单片段自环化和多片段连接环化，大小集中在200bp到3kb之间，分布近似于寡聚核小体 （oligo-nucleosome） 间的尺寸分布规律。这些结果预示eccDNA可能是基因组DNA随机断裂产生片段的环化产物。 细胞凋亡是广泛发生于真核生物体内、和体外培养细胞中的程序性细胞死亡，其中一个重要特征就是细胞凋亡过程中，特定的核酸酶会在核小体的间区切断基因组DNA，形成寡聚核小体大小规律分布的线性片段化DNA （ladder-like） 。因此作者比较了正常培养细胞和诱导凋亡的细胞中的eccDNA含量，发现凋亡细胞中的eccDNA量明显增加，说明凋亡能诱导eccDNA的发生。 为了弄清eccDNA的产生是否源于片段化的DNA，作者鉴定并敲除了小鼠干细胞中负责凋亡DNA片段化的核酸酶DNase1l3，得到了凋亡DNA片段化缺陷的细胞株 （DNase1l3 KO） ，DNase1l3的敲除并不影响细胞凋亡导致的细胞死亡，但其凋亡寡聚核小体样的DNA片段化的现象则完全丧失，相应的是，DNase1l3 KO细胞系也失去了凋亡诱导的eccDNA发生的能力 （图2） ；这说明eccDNA发生源于凋亡产生的DNA片段。 线性DNA片段的环化离不开DNA连接酶 （DNA ligase） ，真核生物共有三个DNA连接酶基因：Lig1，Lig3和Lig4。通过建立DNA连接酶的单基因敲除和多基因敲除细胞系。研究人员发现，Lig1和Lig4的缺失完全不妨碍eccDNA的生成，而Lig3缺失的细胞系中的eccDNA产量则急剧降低，说明Lig3是最主要的负责DNA环化的连接酶 （图2） 。这回答了eccDNA是怎么发生的问题。  

图2，（a-b）凋亡DNA片段化缺失细胞（DNase1l3 KO）不能产生eccDNA；（c）Lig3的缺失抑制了eccDNA的产生。 随后，研究人员挑战了eccDNA的第三大基本问题：eccDNA是否有功能？ 鉴于eccDNA在序列上没有表现出明显的特征，作者首先排除基于序列来探索eccDNA的整体生物学功能的可能。文章作者通过检阅文献发现，先天免疫 （innate immunity） 过程中的重要蛋白，如HMGB1，TLR9等对DNA的弯折 （curvature，bending） 结构表现出了更高的亲和力，因此推测，所有eccDNA分子的共性——环状结构或许在先天免疫反应中有特殊作用。 随后的研究证实了这一推测：eccDNA的环状特性赋予其超强的刺激先天免疫反应的能力。在典型的免疫细胞——树突细胞 （BMDC，bone marrow derived dendritic cells） 和巨噬细胞 （BMDM，bone marrow derived macrophages） 中，相比于同大小的线性基因组DNA片段， eccDNA能诱导出更高的细胞因子 （图3） （Ⅰ型干扰素（IFN-α，β） ， 白介素6 （IL-6） ， 肿瘤坏死因子 （TNF-α） 等）的表达，显示出超强的刺激免疫反应的能力。当eccDNA分子环被单位点切断成对应的线性分子后，即失去了刺激免疫反应的超强能力 （图3） ，证实了eccDNA的强效免疫刺激能力依赖于其环状结构。为了进一步排除eccDNA序列及潜在的转录对免疫刺激影响，作者用与eccDNA相似大小、但序列为随机生成的、人工合成环状DNA处理免疫细胞，不出预料，人工合成的DNA环完美再现了纯化的天然eccDNA对免疫细胞的超强刺激能力 （图3） 。深入研究显示，eccDNA的超强先天免疫刺激能力依赖于胞内Sting信号途径而非Myd88信号途径。

图3，（a）eccDNA具有超强的诱导干扰素IFN-β表达的能力（d）eccDNA被线性化（Li-DNA）后失去诱导干扰素IFN-β表达的能力；（c）人工合成的随机序列DNA环具有超强的诱导干扰素IFN-β表达的能力；（d）eccDNA对免疫的刺激依赖于Sting信号途径而非Myd88信号途径。 总之， 该研究就长达半个多世纪的eccDNA谜题，在三个最基本的方向上给出了清晰的答案 ： 1，eccDNA随机来源于染色体基因组DNA，没有明显的位置或序列的特异性 （从哪来） ； 2，eccDNA是Lig3介导的凋亡DNA片段的环化产物 （怎么来） ； 3，eccDNA具有超强的刺激先天免疫反应的能力 （能做什么） 。 该研究对细胞凋亡和先天免疫两大领域具有深远的影响，特别是对短时间内产生大量细胞死亡的多种疾病、或疾病治疗过程，如细菌、病毒的急性致命传染病、癌症的免疫治疗等。此外，该研究也对核酸疫苗和疫苗佐剂的设计提供了新的设计思路和路径。   张毅 教授为本文的通讯作者，王元高博士为本文的第一作者。王萌博士、Mohamed Nadhir Djekidel博士、陈欢博士、刘迪博士和Frederick Alt教授亦对本研究做出重要贡献。该研究中，原子力显微镜的使用得到了Wyss研究所的Yin Peng教授的倾情相助。 

论文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-021-04009-w