科研 | Cell Host & Microbe：肠道病毒引起广泛的宿主免疫反应，类似于细菌微生物群引起的免疫反应

编译：微科盟蓝胖儿，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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病毒共生关系的研究因缺乏建立动物模型受到阻碍。已建立的模型通常涉及腹膜或静脉接种病毒以绕过局部防御，或使用敲除小鼠抑制抗病毒的途径。另一个挑战来自广泛存在于动物体内的分段丝状细菌（SFB）和小鼠星形病毒抑制肠道病毒感染的能力。因此，细菌或病毒微生物群可能阻碍了对某些病毒的研究。这些问题促使我们对口服不同肠道病毒的常规无特定病原体（SPF）小鼠和GF小鼠进行病毒负荷的比较。

我们从巴尔的摩分类的第一、第二、第三和第四组中选择了10种肠道病毒株，包括6个科：两种腺病毒（MAdV1和2）、一种星形病毒（MuAstV）、两种杯状病毒（MNV CR6和CW3）、一种小核糖核酸病毒（CVB3）、两种细小病毒（MVMi和MVMp）和两种呼肠孤病毒（T1L和RRV）。表S1总结了我们目前对其组织取向的认识。然而，在大多数情况下野生型C57BL/6小鼠接种病毒后感染的详细时间过程和相应的免疫反应尚未确定。在2个月内，对接种了每种病毒的常规小鼠和GF小鼠的疾病症状及粪便和血液中的病毒进行了监测。在感染高峰期，我们无法从MNV CW3中回收感染颗粒，同时发现粪便的含量抑制了感染性病毒颗粒的检测，从而阻止了在所有条件下的菌斑分析（图S1A）。一个相关的问题是，一旦产生中和抗体，尤其是血液样本，感染性微粒的检测可能容易出现假阴性结果。因此，我们使用qPCR技术，这是一种灵敏度很高的检测病毒清除的方法，并且便于病毒之间的比较。除T1L和RRV外，我们使用菌斑分析，因为呼肠孤病毒科基因组的多段性混淆了qPCR的定量。

几乎所有小鼠都没有出现疾病症状，如腹泻和驼背姿势，对接种后28天采集的肠道组织（dpi）的评估显示没有产生组织学异常（图S1B和S1C）。接种CVB3的小鼠是唯一出现疾病的。尽管给予血清转化所需的最低剂量的病毒，约50%的常规和GF小鼠都未能存活（图S1D）。考虑到我们对共生性的关注，我们在后续研究中排除了CVB3。我们在常规和GF小鼠中检测到其余9种病毒的复制（图1A和1B）。虽然无法检测粪便中的RRV（图S1E），但我们检测到抗RRV中和抗体，表明已被感染（图1C）。不同条件下抗体效价的潜在差异可能是由于细菌在调节RRV体液反应中的作用。MAdV1、MuAstV和MVMi基因组在两个或多个时间点在血液中检测到。一般来说，血液中这些病毒的存在预示着需要在粪便中长期检测（30 dpi）。

图1 肠道病毒在自然感染途径下的定植和细菌依赖性。（A和B）从接种了指定病毒的常规（黑色）和GF（有色）小鼠身上随时间收集的粪便（A）和血液（B）。病毒滴度通过菌斑试验或qPCR进行定量。符号表示单个样本。直线在每个时间点都经过平均值。阴影区域表示SEM。灰色区域表示检测的极限。每个条件N = 4-8只小鼠，结合两个独立的实验。（C）小鼠接种RRV后28天（dpi）血清中的中和抗体通过斑块减少中和试验进行量化。与对照组相比，斑块形成单位（PFU）的减少显示出较高的百分比。结果来自3-9只小鼠，分别进行了3次独立实验。N/D，不确定。

表1 病毒特性概述。本研究中使用的每种病毒的科属分类、巴尔的摩分类、病毒株名称及其缩写以及图1和S1中无菌（GF）小鼠接种后的结果总结。如果在至少75%的感染小鼠血液或粪便中检测到30 dpi的病毒核酸，则将病毒归类为持久性病毒。病毒血症定义为至少一个时间点内至少75%感染小鼠血液中存在病毒核酸。引起病理学的能力是基于组织学或宏观疾病体征的表现。N/D，不确定。

图2 肠道病毒促进免疫细胞群的变化。（A）热图显示与FDR < 0.1的GF对照相比，接种单个病毒或MDF小鼠的cLP和siLP免疫群体的平均倍数变化（见图S2中的控制策略）。灰色：FDR>0.1。顶部的柱状图表示FDR<0.1且倍数变化>1.5的免疫群体比例。（B-E）CD62L⁺CD44^-（B）、CD62L⁺CD44^-（C）、T-bet⁺（D）、pDCs（E）、CD4⁺（B-D）、CD8⁺（B-C）、或CD45⁺（E）在cLP的群体倍数变化。每个点代表一个样本。方框图表示从最小值到最大值的值。（F和G）Foxp3⁺细胞在cLP（F）或在siLP（G）占CD4⁺群体的百分比。每个点代表一个样本。方框图表示从最小值到最大值的值。（H和I）基于cLP（H）和siLP（I）种群频率的分层聚类。（J和K）由病毒特征的db-RDA确定的效应大小：作为cLP（J）和siLP（K）群体频率方差解释变量的特性、基因组、持久性和病毒血症。饼图表示基因组、持久性和病毒血症的综合效应大小。通过单因素方差分析和Dunn事后分析计算统计显著性，并通过Benjamini-Hochberg程序（A-E）或非参数Mann-Whitney检验（F和G）进行多次检验。

我们的结果证实了几个预期的结果，验证了我们的方法。我们观察到CD4⁺和CD8⁺原始T细胞（CD62L⁺ CD44^-）减少，CD4⁺和CD8⁺相应的效应记忆T细胞（CD62L^- CD44⁺）增加（图2B和2C）。我们还检测到T-bet⁺ T细胞的增加，证实了Th1反应的存在（图2D）。对于MNV CW3反应，cLP中巨噬细胞数量增加，与传统接种该病毒小鼠的效果一致。此外，至少有三种肠道病毒引起结肠pDCs的扩张（图2E），这是一个受细菌微生物群调节的群体。尽管有这种共性，接种病毒的小鼠和MDF之间的重叠是有限的。MDF最显著的作用之一是诱导FOXP3^- RORγt⁺ CD4⁺ Th17细胞，但病毒暴露对这一群体的影响是可忽略不计（图2A）。相反，我们观察到cLP中，MVMi使FOXP3⁺ CD4⁺ T细胞（Tregs）增加（图2F）和siLP中T1L和MAdV1使Tregs增加（图2G）。该群体中RORγt的缺失表明这些Tregs不同于细菌诱导的外周Tregs（图2A）。

我们使用层次聚类来定义不同条件下整体免疫细胞组成的相对相似性（图2H和2I）。在cLP和siLP中，MDF处于不同于单个病毒和GF对照的分支中。病毒没有根据分类学关系进行分离，这表明观察到的免疫调节特性是病毒科或属的固有特性。

为了量化病毒相关变量如何解释样本之间的差异，我们基于共生特征进行了基于距离的冗余分析（db-RDA）（表1）：基因组类型（DNA与RNA），定义为血液或粪便中可检测的30 dpi病毒（持久性），以及血液中可检测的病毒（病毒血症）。我们将病毒的特性（identity）作为基准变量。事实上，identity是主要的原因，约占方差的25%，支持单个病毒显著促进不同的免疫调节结果的结论（图2J和2K）。第二个较强的原因是基因组，尽管效应量不大。基因组、持久性和病毒血症变量的综合效应使许多差异无法解释。

在检查的其他组织中，mLNs和肺在病毒感染后显示出最大的变化（图S3A）。与肠固有层一样，我们观察到，在较小程度上，肺中原始T细胞减少，CD4⁺和CD8⁺效应T细胞增加。在这些组织中，identity是主要的原因（图S3C）。总之，这些数据表明肠道病毒影响免疫细胞的组成，其中大部分是病毒序列特异性的。

在PMA-离子霉素刺激每个组织的单细胞悬浮液后评估细胞因子的产生（图3A、S4A、S4B和表S2）。接种几种病毒导致产生Th1细胞因子IFN-γ的cLP T细胞增加（图3B），与T-bet⁺淋巴细胞增加相关（图S4C）。IL-17⁺ CD4⁺ T细胞的增加是MDF定植小鼠特有的（图3A）。IL-22是一种组织再生细胞因子，在肠道损伤和细菌感染模型中介导MNV的保护作用。大多数病毒增强多种cLP和siLP淋巴样细胞（CD4⁺ T细胞、γδ⁺ T细胞和ILCs）产生的IL-22（图3A）。6种和5种病毒分别增加了cLP和siLP中IL-22⁺细胞的总比例（图3C和3D）。IL-22的产生与cLP中粒细胞和单核吞噬细胞的比例相关（图S4D）。在非持久性病毒（尤其是T1L）接种的小鼠中，IL-22⁺细胞明显增加，表明免疫细胞功能的改变是可以持续的（图3A）。

图3 肠道病毒增加免疫细胞产生细胞因子。（A）热图显示用所示病毒接种小鼠的cLP和siLP中细胞因子产生免疫细胞的平均倍数变化，或相对于FDR<0.1的GF对照组的MDF。灰色：FDR>0.1。（B-D）IFN-γ⁺（B）和IL-22⁺（C-D）细胞在cLP CD4⁺和CD8⁺（B）、cLP CD45⁺（C）和siLP CD45⁺（D）中的倍数变化。每个点代表一个样本。方框图表示从最小值到最大值的值。（E和F）代表性点图（E）和IFN-γ⁺ IL-10⁺细胞在cLP CD4⁺ T细胞群体中的百分比（F）。每个点代表一个样本。方框图表示从最小值到最大值的值。（G和H）基于cLP（G）和siLP（H）细胞因子产生频率的不同微生物关联的层次聚类。（I和J）由病毒特征的db-RDA确定的效应大小：作为产生cLP（I）和siLP（J）细胞因子的免疫细胞频率方差的解释变量的特性、基因组、持久性和病毒血症。饼图表示基因组、持久性和病毒血症的综合效应大小。通过单因素方差分析和Dunn事后分析计算统计显著性，并通过Benjamini-Hochberg程序（A和B）、Kruskal-Wallis检验和Dunn的事后分析（C和D）或非参数Mann-Whitney检验（F）进行修正。

虽然与固有层中观察到IL-22不同，我们在其他组织中没有观察到细胞因子产生的相同的变化，但我们注意到一些病毒株特异性变化（图S4A）。例如，IFN-γ⁺ IL-10⁺ CD4⁺T细胞（Tr1细胞），一个具有调节功能的辅助T细胞亚群，在cLP和mLN中感染持续株MNV CR6的小鼠中增加（图3E和3F）。

cLP和siLP细胞中细胞因子产生的分层聚类显示，病毒感染小鼠并不像我们基于细胞表面标记物和转录因子分析免疫细胞群时那样明显地形成独立于GF和MDF小鼠的分支（图3G和3H）。与之前的分析一样，来自同一科的病毒并不均匀地聚集在一起，细胞因子产生的主要原因是同源性，其次是基因组（图3I、3J和S4E）。因此，这些结果表明，病毒感染的小鼠中产生细胞因子的免疫细胞增加，这些细胞是常见的和病毒株特异性的。

 图4 病毒感染小鼠的肠道转录组（A和B）热图显示与GF小鼠相比，病毒感染小鼠的结肠（A）和小肠（B）中的DE基因（GF≥2的平均倍数变化和未调整的p值≤0.01）。C，结肠；SI，小肠。（C）与GF小鼠相比，每种情况下结肠和小肠中DE基因的数量。（D和E）描绘了结肠（D）和小肠（E）中所有病毒感染和MDF相关小鼠中DE基因的数量和重叠的维恩图。（F和G）病毒感染和MDF相关小鼠的结肠（F）和小肠（G）中DE基因的前15个高富集生物过程的GO术语。（H和I）各条件下结肠（H）和小肠（I）DE基因群中心之间的欧氏距离的热图。黑色框表示显著差异（PERMANOVA<0.05）。（J和K）通过病毒特征的db-RDA确定的效应大小作为结肠（J）和小肠（K）DE基因方差的解释变量。饼状图表示基因组、持久性和病毒血症的综合效应大小。（L）利用图2中免疫群体频率的db-RDA确定结肠和小肠DE基因变异的效应大小。黑色框表示p值<0.05。

我们在结肠和小肠中分别观察到15个和3个DE基因，至少有一半研究的病毒共享这些基因，包括免疫球蛋白基因Igha、Igkc、Iglc1、Jchain和Pou2af1（图5A和5B）。这一发现与B细胞激活相关基因表达增加（图4F和4G）以及先前发现的MNV CR6增强GF小鼠局部和全身抗体产生以及在病毒感染期间经常观察到IgA产生一致。

抗菌基因表达增加是共生细菌肠道定植的标志。我们通过构建一个抗菌基因集来检测病毒感染期间抗菌基因的表达，其中基因注释为GO：0050829（对革兰氏阴性细菌的防御反应）、GO：0050830（对革兰氏阳性细菌的防御反应），和GO：0061844（由抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应）。与GF对照组相比，病毒感染小鼠中许多抗菌基因的表达增加（≥1.5倍，p≤0.01）（图5C和5D）。但总体反应不如MDF强。尽管如此，仍然存在完全由病毒诱导的转录物，包括甘露糖结合蛋白C（Mbl2）和干扰素诱导的GTPase、Iigp1、Irgm2和Gbp2。

MNV CR6通过诱导局部IFN-I反应加强肠道屏障，但MNV CW3不能。IFN-I（IFN-α和-β）和III型干扰素（IFN-l）是针对病毒核酸产生的抗病毒细胞因子，这些病毒核酸引起一组类似的干扰素刺激基因（ISG），我们在此统称为“IFN信号”。与我们之前的研究结果一致，接种MNV CR6而不是MNV CW3与IFN信号有关（图5E）。令人惊讶的是，一些病毒（如MuAstV）产生了高水平的病毒核酸，我们小组中其他病毒没有产生IFN信号。此外，只有MNV CR6与ISG调控因子下游的转录增加有关（图5F）。我们确认代表性ISGs Isg15、Ifit1和Oas1a的表达仅在MNV CR6定殖的小鼠中增加（图S6A）。

与IFN-I相反，IL-22应根据其对转录变异的影响大小调节多种病毒的DE基因（图S5D）。我们使用基因集富集分析（GSEA）确定小鼠肠道中改变的Il-22^-/-转录物是否在病毒感染小鼠中受到差异调节。该分析证实，大多数病毒感染小鼠产生IL-22信号（图S6B和S6C）。

我们使用GSEA方法对病毒感染小鼠的转录组与53种细菌微生物群个体定植小鼠的基因表达特征进行比较（图6A-6D；表S4）。在我们的研究中，MDF定植小鼠的结肠转录物在充满微生物群的条件下（传统SPF小鼠）表达上调的基因，这表明阳性对照的一致性（图6A）。类似地，MDF定植小鼠的小肠转录组显示了传统SPF小鼠中下调基因的负富集评分（图6D）。使用这种方法，53种细菌中有20种与一种或多种病毒有关系。我们鉴定了91对病毒-细菌，其中60对表现出相同的调控方向（即在病毒相关转录物中，上调细菌基因集的正富集和下调细菌基因集的负富集）（图6A-6D）。某些细菌基因集显示出与一种病毒的排他性配对，如在结肠中观察到的几种拟杆菌（Bacteroides）和Parabacteroides以及T1L。T1L和拟杆菌目之间的这种一致配对表明，这种病毒对这种典型的共生细菌群的定植也有类似的反应。MNV CR6诱导的基因集也与结肠中多个细菌上调的基因集配对，包括对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）特征的强富集（图6E）。

由于用于识别细胞类型的控制策略和标记物的差异，将流式细胞术数据与用细菌单克隆小鼠收集的结果进行比较时，我们将比较限制在16个免疫细胞亚群，这些亚群在数据集中以类似的方式进行量化（表S5）。使用两个数据集的Z分数进行分层聚类表明，两个数据集的GF组聚集在一起，正如我们研究的MDF和Geva-Zator-sky等人的SPF一样（图6F和6G）。大多数细菌和病毒与GF或与MDF和SPF不同的相邻分支聚集在一起，表明单独存在的特定细菌或病毒的贡献仅占微生物依赖于免疫细胞组成的总影响的一小部分。病毒散布在细菌之间，而不是聚集在一个分支中，这表明病毒诱导的免疫细胞频率变化并不能反映对病毒的统一免疫反应，这与细菌诱发的反应不同。

我们研究了真核病毒引起的亚临床肠道感染是否会影响粘膜免疫系统，正如微生物群中许多细菌成员所证明的那样。研究中选择的10种病毒中只有1种会导致疾病或死亡，这使我们能够在没有疾病的情况下确定9种病毒的免疫效果。在建立病毒感染模型的过程中，我们对感染的动力学进行了一些观察。首先，几种病毒的核酸可以长时间检测到。对麻疹病毒感染的观察表明，病毒抗原和RNA可以持续存在，即使对于没有建立潜伏期或没有将DNA拷贝整合到宿主基因组中的病毒也是如此。对于某些病毒，如MNV所言，这种持久性可能是由免疫逃避介导的。此外，我们还发现微生物群对持久性有很强的影响。抗生素治疗可阻止某些肠道病毒的感染，我们的数据显示，并非所有病毒都受益于细菌的存在。未来的一个重要目标是确定肠道中介导常规小鼠对病毒感染抗性的特定固有病毒和细菌。

我们的流式细胞术和转录分析支持肠道病毒无症状感染的假设。尽管每种病毒都有独特的免疫特征，但病毒感染通常会促进T细胞的成熟和Th1极化。淋巴细胞群的变化可能是抗原特异性的，对B细胞和T细胞受体多样性的检测将提供信息。或者，通过细胞因子（如IFNγ）的旁观者效应可以介导对无关的感染因子和食物抗原的异源免疫反应。胃肠道中存在具有固有特性的非经典淋巴细胞，也可能参与此类反应，例如我们在感染几种病毒后观察到的IL-22信号。与肠道内稳态相关的IL-22诱导可能抵消肠道病毒造成的损害，从而促进共生关系。由于减少了对微生物的接触，实验室小鼠表现出成熟淋巴细胞的缺陷。在这种情况下，值得注意的是，具有更成熟淋巴细胞的野生型小鼠和宠物店小鼠对与我们研究密切相关的病毒（腺病毒、MNV、细小病毒、呼肠孤病毒和轮状病毒）呈血清阳性。这些常见的肠道病毒可能有助于免疫系统在自然环境中的成熟。

精确的组织和细胞取向性可能是我们观察到的分类相关病毒的不同免疫反应的原因之一。病毒基因组的核酸组成（DNA与RNA）对变异的贡献不大，但可重复，而病毒的传播和持久性似乎不能解释此差异。因此，一个显著的发现是，在病毒核酸不再被检测到的小鼠中，很容易观察到免疫细胞和基因表达的变化。如果病毒的这种持续作用转化为对人类的影响，那么对患者群体的横断面研究可能会遗漏疾病发病前可能有意义的病毒暴露。对T1D基因易感儿童的纵向病毒分析发现，早期腺病毒和圆环病毒暴露与随后出现的血清自身抗体呈负相关。因此，我们提倡在可能的情况下对病毒组相关性研究进行前瞻性和纵向抽样。

将我们的结果与使用细菌单克隆小鼠收集的类似数据集进行比较，确定了刺激重叠反应的病毒-细菌对。例如，粪肠球菌（E. faecalis）和MNV CR6具有相同的结肠基因表达特征，这增加了我们对该方法的信心，因为这两种感染因子在肠道损伤DSS模型中也具有相同的保护能力。一些引起与病毒重叠的免疫反应的细菌与疾病有关，如IBD中的活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）和普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）。在疾病依赖于这些细菌的动物模型中测试匹配病毒的作用将是有趣的。

我们的调查仅限于有限数量的病毒，并没有捕捉到在人类中发现的大量病毒的多样性。虽然从人类肠道分离的细菌通常会在GF小鼠体内定植，但许多医学上重要的病毒在接种到小鼠体内时表现出狭窄的物种趋向性或改变毒性。更广泛的病毒调查可能会发现更多的细胞类型和受病毒感染影响的途径。另一个限制是，我们选择了单一感染方法来识别直接反应，避免遗漏与现有微生物群重叠的免疫效应。这种方法也使我们能够在计算机上比较病毒诱导的免疫反应与细菌单菌落小鼠诱导的免疫反应。。

我们设想了两种情况，在这两种情况下，我们的结果可以指导研究肠道病毒组如何在存在细菌的情况下调节免疫。首先，与特定菌群相关的小鼠可用于评估复杂群落中单个细菌的免疫效应。这种合成生态学方法可以结合我们小组中具有免疫原性潜力的病毒，更好地反映现实世界微生物组的复杂性。第二，我们要在炎症性疾病的动物模型中测试这些病毒和其他病毒的作用，许多炎症疾病被认为依赖于微生物群中的细菌成员。尽管野生型C57BL/6小鼠对MNV CR6的Th1反应无关紧要，但IBD易感基因ATG16L1的突变使肠上皮对病毒感染的其他细微影响敏感。通过对MNV感染的突变小鼠的观察，我们可以确定人体屏障完整性的稳态机制。因此，将病毒纳入遗传疾病模型可以揭示促进健康的重要途径。

我们的研究结果表明，肠道中的真核病毒除了作为胃肠炎病原体的作用外，还有未被认识到的免疫调节能力。在适当的环境下，对病毒感染的反应可能是有益的，这一点已通过原理性实验证明，预防性使用MNV和MuAstV菌株可保护小鼠免受肠致病性大肠杆菌（E. coli）感染。且为治疗目的操纵肠道病毒组是有先例的，口服脊髓灰质炎病毒疫苗提供了对其他病原体的交叉保护，这是已被用作在脊髓灰质炎流行地区接种这种减毒病毒而不是灭活疫苗的理由。正在进行的动物模型研究将有助于对基于病毒组的干预措施进行未来的安全性和有效性评估。

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