组蛋白去乙酰化酶抑制剂在全身麻醉药致发育期脑神经毒性中的作用及机制

中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳 110004

国家自然科学基金面上项目（81870838，81671311）；

辽宁省重点研发计划（2018225004）

【综述】

全球每年有数百万新生儿或儿童在外科手术和影像学检查中接受全身麻醉。大量研究表明全身麻醉药物对发育期脑具有潜在神经毒性，可能引起神经系统结构和功能改变 。美国食品和药物管理局曾发布药物安全通告称，妊娠后3个月的孕妇或3岁以下的小儿多次或长时间（3 h以上）使用全身麻醉药物可能影响胎儿或小儿神经发育 。因此，探究全身麻醉药致发育期脑神经毒性的机制及改善措施对制定临床麻醉方案、指导产科及儿科麻醉具有重要意义。

表观遗传修饰指在DNA序列不发生变化而基因表达发生可遗传的改变 。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA 。其中，组蛋白乙酰化是组蛋白修饰中研究最为广泛的翻译后修饰 。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors, HDACIs）是一类通过诱导组蛋白乙酰化修饰从而在转录水平调控基因表达的化合物 ，现就HDACIs对全身麻醉药致发育期脑神经毒性的作用及机制进行综述。

核小体是真核生物染色质的基本结构单元，由4组核心组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的八聚体及其包绕的147个DNA碱基对组成。组蛋白乙酰化修饰通常发生在组蛋白氨基末端赖氨酸残基 ，在组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase, HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDACs）的双重调控下保持动态平衡。HATs将乙酰辅酶A的乙酰基团转移至组蛋白氨基末端中特定的赖氨酸残基上，带有正电荷的赖氨酸转化为不带电的乙酰化赖氨酸，降低组蛋白与带负电荷的DNA的亲和性，使得染色质空间结构处于疏松状态，促进各种转录因子和协同转录因子与DNA结合位点特异性结合，激活基因转录。相反，HDACs通过组蛋白的去乙酰化使染色质呈致密卷曲结构，抑制基因转录。

HDACs既能去乙酰化修饰组蛋白八聚体，也能调节转录因子、信号级联分子、细胞周期素等非组蛋白发生去乙酰化，参与基因转录调控、细胞周期、信号转导等生命活动 。HDACs家族由一系列高度保守的具有去乙酰化酶活性的蛋白质组成，目前在哺乳动物体内共发现了18种不同亚型的HDACs 。根据其与酵母的同源性可分为4类：Ⅰ型、Ⅱ型（a型、b型）、Ⅲ型和Ⅳ型。其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型是Zn2+依赖型HDACs，而Ⅲ型是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型HDACs。I型主要包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8；Ⅱa型包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9；Ⅱb型由HDAC6和HDAC10构成；Ⅲ型包括SIRTl‑7；Ⅳ型目前只包括HDAC11。

HDACIs靶向作用于HDACs，干扰HDACs活性，通过提高组蛋白乙酰化水平调控基因表达，具有广泛的神经保护、延缓细胞衰老、抗肿瘤等作用 。根据化学结构的不同，HDACIs可以分为四类：脂肪酸类、羟肟酸类、环肽类和苯甲酰胺类 。脂肪酸类主要包括丁酸钠（sodium butyrate, NaB）、丙戊酸钠等，羟肟酸类主要包括辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A等，环肽类主要包括罗米地辛、apicidin等，苯甲酰胺类主要包括MS‑275、MGCD0103等。

4.1　调节环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein, CREB）转录因子活性

CREB是真核生物细胞核内的一种环腺苷酸转录效应因子。环腺苷酸效应元件是细胞内基因启动子中的一种顺式作用元件，CREB通过结合环磷酸腺苷反应元件的DNA序列，调控下游目的基因转录表达。CREB作为多种信号通路的交汇点，与其介导的上下游信号分子共同调控神经环路的形成、功能与可塑性 。CREB能够招募CREB结合蛋白（CREB‐binding protein, CBP）并形成CREB‑CBP复合物，共同激活相关信号分子及其靶基因的转录 。海马是执行大脑认知、记忆等高级神经活动的重要区域。另有研究发现，原代培养小鼠神经元暴露于1.4%异氟醚4 h，HDAC4核转运增加且与核内CREB相互作用，导致CREB与CBP结合降低，CREB转录活性降低，下游c‑Fos等认知相关蛋白表达降低，神经元突起生长能力减弱；进一步实验证实，曲古菌素A能够通过HDAC4依赖性途径增强CREB转录活性，减轻异氟醚神经毒性 。

4.2　促进脑源性神经营养因子（brain‑derived neurotrophic factor, BDNF）表达

BDNF是神经营养因子家族成员之一，主要分布于中枢神经系统，在大脑皮质和海马部位表达尤为丰富 。BDNF不仅能够维持中枢神经系统和周围神经系统的正常生理功能，促进神经元的存活和分化，而且有助于损伤神经元的再生与修复、防治神经退行性病变等。越来越多证据表明，BDNF基因转录表达受到表观遗传修饰调控。大鼠BDNF基因包含9个外显子（exon Ⅰ~exon Ⅸ），分别对应一个启动子（promotor Ⅰ~promotor Ⅸ）。外显子由8个5'端非编码外显子（exon Ⅰ~exon Ⅷ）和一个编码蛋白的3'端外显子（exon Ⅸ）组成 。8个5'端外显子任何一个都可以与exon Ⅸ进行选择性拼接，转录形成BDNF mRNA。新生7 d大鼠暴露于1.5%异氟醚6 h后，染色质免疫沉淀技术检测海马BDNF基因exon Ⅳ启动子区域组蛋白H3乙酰化水平降低、HDAC2蛋白结合增加，引起BDNF蛋白表达降低，大鼠海马依赖性空间学习记忆能力受损 。HDACIs能够通过重建组蛋白乙酰化修饰与HDACs之间的平衡参与BDNF基因转录调节，减轻麻醉药物神经毒性。研究发现，将6日龄新生大鼠连续3 d（每天2 h）暴露于3%七氟醚，海马组织中HDAC3和HDAC8表达显著升高。出生后第6天起至行为学测试结束前每日进行NaB（250 mg/kg）腹腔注射，结果发现广谱HDAC活性抑制剂NaB能够抑制HDAC3、HDAC8表达，促进BDNF蛋白表达，改善学习记忆功能障碍 。为了更贴近临床麻醉联合用药方案，Dalla Massara等 将出生7 d大鼠首先腹腔注射镇静剂量的咪达唑仑（9 mg/kg），随后0.75%异氟醚复合70%一氧化二氮联合吸入麻醉6 h，海马BDNF基因exon Ⅳ启动子Ace‑H3水平降低，BDNF蛋白表达降低；腹腔注射NaB（1.2 g/kg）能够通过提高海马组蛋白乙酰化修饰逆转全身麻醉对BDNF基因表达的抑制作用。

4.3　降低谷氨酸兴奋性毒性

谷氨酸是哺乳动物脑内重要的兴奋性氨基酸，在突触稳定性的维持及可塑性变化中起重要作用。神经冲动发生时，突触前膜释放的谷氨酸与突触后膜上的谷氨酸受体相结合，产生兴奋性神经传导。谷氨酸受体包括离子依赖型和代谢型，其中代谢型谷氨酸受体是与G蛋白耦联的跨膜结构 ，目前已经共发现8个亚基（mGluR1~mGluR8）。由于细胞外没有分解谷氨酸的酶，因此谷氨酸主要由高亲和力谷氨酸转运体所摄取，以维持正常的细胞外液谷氨酸水平。谷氨酸转运体‑1广泛分布于前脑、大脑皮质、海马等部位，负责清除胞外80%~90%的谷氨酸 。当谷氨酸释放增加或重摄取出现障碍时，导致Ca2+内流及钙依赖通路的异常激活，最终导致细胞坏死、凋亡和自噬过程的启动。研究发现，出生后7 d大鼠连续4 d（35 min/d）暴露于1.7%异氟醚，尽管海马HDAC2和HDAC4蛋白表达无变化，但HDAC2活性显著下降，谷氨酸转运体‑1、mGLuR1、mGLuR5基因启动子区域Ace‑H3修饰水平降低；立体定位注射NaB至海马能够通过调节乙酰化修饰减轻谷氨酸兴奋性毒性 。

4.4　促进突触可塑性相关蛋白表达

突触是两个神经元之间或神经元与效应器细胞之间信息快速准确传递的结构基础。突触的活动并非单一不变，突触的形态和功能会根据神经元的活动发生较为持久的改变，称为突触可塑性。突触可塑性不仅是神经系统疾病信号转导的分子机制，也是学习和记忆的细胞分子学基础。突触前可塑性蛋白主要包括生长相关蛋白‑43、突触素等，突触后可塑性蛋白主要包括突触后致密蛋白‑95、钙调素依赖性蛋白激酶等。多项研究表明，麻醉相关神经毒性大多以突触可塑性改变为病理特征，包括树突棘的形态异常、突触密度异常、突触可塑性相关蛋白表达降低和信号转导异常。NaB、辛二酰苯胺异羟肟酸等HDACIs能够通过促进突触后致密蛋白‑95、突触素Ⅰ、突触素Ⅱ、钙调素依赖性蛋白激酶ⅡA等突触可塑性相关蛋白表达减轻麻醉药物引起的突触可塑性受损 。

4.5　纠正神经网络电活动的紊乱

γ‑氨基丁酸（γ‑aminobutyric acid, GABA）是哺乳动物脑内重要的抑制性神经递质。全身麻醉药增强神经递质GABA在GABAA受体上的作用，从而增强抑制性神经传递。然而，过度激活GABAA受体能够触发脑内广泛的神经退行性病变。GABA受体介导的微型抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic currents, mIPSCs）的频率反映突触前递质的变化，幅度反映突触后受体的变化。出生后7 d大鼠接受咪达唑仑复合一氧化二氮、异氟醚麻醉后，通过全细胞膜片钳技术记录到海马脑片mIPSCs频率显著降低，提示麻醉改变了抑制性神经传递的突触前成分，并且进一步实验表明，这种改变受Ace‑H3修饰的影响。表观遗传机制与抑制性突触传递的变化有关，选择性HDACⅠ型抑制剂MS‑275能够促进Ace‑H3表达，提高mIPSCs频率 。

目前，药物研究人员通过天然提取、人工合成等手段开发研制了大量的HDACIs。现阶段HDACIs主要应用于临床肿瘤治疗，在神经系统疾病的治疗上还有很大的挖掘空间，尤其是全身麻醉药致发育期脑神经毒性方面。HDACIs可在基因转录水平对麻醉相关神经毒性发生、发展过程中的多种信号进行调控。随着分子生物学研究的不断深入，HDACIs防治麻醉相关神经毒性将会有一个良好的应用前景。值得注意的是，目前应用的HDACIs多为广谱抑制剂，作用机制十分复杂，所致不良反应尚不明确，故仍需进一步深入研究。