科研 | 华东理工：宏基因组和宏转录组学揭示反硝化脱硫颗粒污泥反应器中与高S0产量相关的微生物群落（国人佳作）

编译：微科盟HushKuo，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

图1 不同S/N比下反应器的性能。（A）脱氮效率；（B）进水S^2-和出水氮浓度之间的关系；（C）S^2-去除效率和元素硫转化率；（D）进水S^2-和S⁰或硫酸盐产量之间的关系。

图2 污泥表面和出水中元素硫的分析。（A）颗粒污泥表面的拉曼光谱分析；（B）反应器出水和回收的固体；（C）出水中回收固体的XRD结果；（D）出水中回收固体的XPS结果。

2 反硝化与硫循环关键基因分析

3 微生物群落分析

组装来自III、IV和V阶段的读长，从每个样本生成大量高质量（完整性>70%，污染<10%）宏基因组组装基因组（MAGs）草图（图4）。确定每个MAGs的分类以评估它们的相关性，通过DNA读长的映射评估它们对群落的贡献，通过RNA读长的映射评估它们的转录活性，这些结果在图4中显示。出乎意料的是，在阶段III和IV丰度为14.8-20.11%的最普遍的MAG是古细菌的成员，GTDBtk通过ANI和pplacer将其注释为Methanothrix soehngenii物种水平。图5中显示的系统发育树也包含Methanothrix soehngenii，表明它与来自反应器的MAG之间具有高度的一致性。该生物体已被证明是一种乙酸发酵型产甲烷菌。这类产甲烷菌的存在是出乎意料的，因为流入物中不存在固定碳。这种细菌在V阶段显著下降，可能是因为硫化物含量高的缘故。来自该生物体的读长在RNA读长中也很少，但如果它在代谢上不活跃，它似乎不太可能在群落中保持如此高的比例。

其次最常见的MAGs是硫化物氧化细菌（SOB）。SOB逐渐富集并最终成为V阶段的优势细菌，从群落的1.74%增加到38.89%，如读长映射所示（图4）。此处鉴定的大多数SOB编码不完整的sox依赖型酶复合基因，表明它们不能通过sox途径产生硫酸盐。然而，产生S⁰的功能基因（fccB或SQR）分布在所有SOB基因组中。这些结果与阶段IV和V期间80.0%的S⁰转化率一致。硫酸盐还原菌（SRB）在反应器中被检出，但它们的丰度仍然很低（0.2-2.1%）。

完全或接近完全反硝化菌的SOB具有转录活性，这表明来自硫化物氧化的电子被传递给氮氧化物以生成ATP（图5）。该组中的大多数还包含编码CO₂固定蛋白核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的基因。在群落中占主导地位的任何其他MAGs中都没有发现Rubisco，这表明该群体也负责很大一部分的CO₂固定。这种分布可能反映了与硫化物依赖型呼吸相关的能量优势，因为卡尔文循环需要大量的ATP和NADPH输入。使用Wood-Ljungdahl固定途径的生物体通常在生长的热力学极限附近生长活动，因此认为其不会成为该系统中CO₂固定的主要来源。一些MAGs具有制造蛋白质所需的基因，允许通过Wood-Ljungdahl途径固定CO₂，但它们在任何阶段的群落中都不占主导。

用于支持乙酸发酵型产甲烷菌的乙酸盐通常通过发酵产生，因为它在发酵过程中的产生会增加ATP产量。在MAG中，有两组可能是醋酸盐的来源。其中一组被预测为Tissierellaceae科的成员，它们的基因组包含编码甘氨酸还原酶的基因，该酶用于Stickland发酵并产生乙酸盐作为最终产物。这些生物体在群落中的代表性并不高，但转录非常活跃，表明它们是醋酸盐的重要来源。另一组在分类学上被注释为Acholeplasmatales。该组的MAGs具有相对较小的基因组，并且无法像该家族的其他成员一样进行呼吸。它们确实包含完整的糖酵解途径以及从丙酮酸生产醋酸盐所需的基因，表明这些反应可能是醋酸盐的来源，因为其他ATP生产途径并不明显。与Stickland的MAGs一样，这组MAGs在群落中的代表性不高，但转录非常活跃（图4）。许多MAGs在分类学上被指定为Anaerolineales的成员，但根据现有信息很难确定它们的新陈代谢，该组还包括许多具有转录活性的其他生物。

此处注释为Acholeplasmatales和Tissierellaceae MAGs的所有MAGs的基因组都很小。Acholeplasmatales成员基因组的平均大小为~1.4 × 10⁶个碱基对，Tissierellaceae为2.0 × 10⁶个碱基对。相比之下，SOB基因组平均为3.0 × 10⁶个碱基对。鉴于进水不含固定碳，因此发现这么多基因组减少的MAGs十分意外。GEMs模型发现，平均需要79次间隙填充反应才能使Acholeplasmatales MAGs在含有葡萄糖的培养基上生长。相比之下，SOB MAGs生长只需要2次间隙填充反应。具有小基因组和众多营养缺陷型的生物体的这种常见现象表明，该反应器中的微生物群落具有整体协同代谢。这一结论得到了来自群落主要成员的MAGs通量模拟的支持，该模拟给出了0.56的MRO分值，表明生物体不竞争公共资源以及相对较高的代谢相互作用潜力（MIP为10）。相比之下，在SRB和SOB中仅具有独特MAGs的群落建模的MRO为0.76，并且没有代谢交换的迹象。

  图4 各阶段中单个MAGs的存在和相对表达。圆圈的大小表示映射到给定MAG的读长总数。平均丰度反映了DNA读长的映射，平均表达表示RNA读长的映射。

 图5 基于分箱分析的III、IV和V阶段系统的微生物群落结构。粉红色突出显示的MAGs是MET表示的产甲烷菌；以青色突出显示的MAGs是SOB表示的硫酸盐氧化菌，。以橙色突出显示的MAGs是STI表示的Stickland发酵菌。以紫色突出显示的分箱是Acholeplasmatales的成员。以橄榄色突出显示的分箱是Anaerolineales的成员。相关基因的数量在树的右侧用橙色方块表示。前七个标签表示本文中描述的反硝化基因。RuBi代表Rubisco，GlRe代表甘氨酸还原酶。SQR和Dsr如文中所述。

建成反应器后，该系统的S⁰转化率和负荷速率分别达到94.5%和1.06 kg-S•m^-3•d^-1。生成的S⁰很容易通过反洗从反应器中分离（图2B），这为解决与生物处理系统中元素硫的回收困难相关的问题提供了一种有效方案。此外，回收的元素硫纯度为92%，具有很高的利用价值。在以往的研究中，较高元素硫转化率的最佳S/N比一般控制在5:3-5:2的范围内，不适用于高硫化物浓度废水中硫化物的去除和元素硫的回收。然而，在该反应器中，硫化物去除率和S⁰回收率可以保持在高达7:2的S/N比。该研究可扩展基于厌氧颗粒污泥接种的反硝化依赖元素硫回收技术的应用。

TN的去除在大多数阶段也很有效，其中大部分在前三个阶段被去除。然而，当V阶段进水S^2-从314.6增加到352.1 mgS•L^-1时，TN去除率下降了70%（图1）。V阶段的进水S^2-浓度高于所报道的反硝化抑制阈值水平，其范围为200-300 mgS•L^-1，这可能是V阶段脱氮效率相对较低的原因。然而，硝酸盐还原功能基因的表达水平并未降低（图3）。存在一种可能性为硫化物通过与反硝化酶的金属辅因子直接反应来抑制微生物活动。

由于高硫化物浓度，即使在V阶段，硫化物氧化速率亦没有显示出明显的抑制（图1）。在最近的工作中，动力学分析发现硫化物氧化遵循Monod型动力学，这表明只要硫化物浓度范围低于1800 mgS•L^-1，较高的硫化物浓度不会显著抑制硫化物氧化。此外，S⁰的转化率线性增加并近似符合本研究中的一级动力学方程，这表明S⁰产生酶的活性不是限制因素。这种推论得到了SQR编码的S⁰的高表达水平的支持。

硫酸盐，另一种主要的硫化物氧化产物，在前三个阶段在流出物中保持恒定浓度，但在第V阶段其浓度显著下降了83.1%。然而，编码sox依赖型酶复合物的基因表达水平在阶段V中没有显著下降（图3）。不确定这是否是由于硫化物对sox依赖型途径的抑制而发生的。然而，另一种可能性是观察到的硫酸盐减少是硫酸盐还原增强导致的，因为硫酸盐还原的关键基因在高硫化物浓度下表达显著增加。

宏基因组组装产生了许多出乎意料的在系统发育和生理上具有多样性的高质量MAGs（图4）。正如预期的那样，有硫化物氧化反硝化菌，但也有产甲烷菌、硫氧化菌和似乎来自发酵细菌的生物体的各种MAGs。鉴于进水中没有固定碳，这种多样性有点出乎意料。产甲烷菌出乎意料地在III期和IV期占主导地位，但它们的丰度在V期显著下降，可能是由硫化物抑制导致的（图4）。同时，编码Rubisco和SQR的SOB逐渐富集并最终在V阶段占主导地位。将固定碳发酵成乙酸盐以生成产甲烷菌的生物体在群落中的代表性并不高，但转录非常活跃，尤其是在第III和第IV阶段。宏基因组学和转录组学分析表明微生物群落的主要成员具有潜在作用，这些成员被整合到基于基因组的反应器模型中（图6）。在这个模型中，硫化物氧化菌起到两个关键作用：（i）氧化硫化物和（ii）固定碳。与反硝化相关的硫化物氧化相关的能量学特征足以通过卡尔文循环固定大量的碳。然后这种固定碳被其他细菌用作碳源和能源。后者的一个很好的例子是细菌的出现，这些细菌显然是通过使用甘氨酸还原酶的Stickland发酵产生ATP。该反应以及其他发酵细菌产生的醋酸盐可能是第III和第IV阶段反应器中产甲烷菌含量较高的原因。其中一个古菌MAGs与先前表征的Methanothrix soehngenii几乎相同，后者是一种乙酸发酵型产甲烷菌。产甲烷菌在V阶段急剧下降，由于APB在该阶段保持活跃，因此尚不确定在V阶段期间醋酸盐的去向。

图6 SOB、SRB、产乙酸菌（APB，包括Stickland细菌和其他发酵菌）和系统在III、IV和V阶段的产甲烷菌之间可能的代谢相互作用。SOB固定无机碳并合成氨基酸和EPS。APB降解SOB代谢过程中产生的有机碳并产生醋酸盐。在第III和第IV阶段，产甲烷菌使用醋酸盐作为碳源来维持新陈代谢。在V阶段，SRB在呼吸醋酸盐时还原硫酸盐。