导读
人体肠道微生物组会随着一系列环境状况、生活事件和疾病状态变化。妊娠是一个自然的生命事件，会出现一些生理性的适应性变化，但目前对妊娠期微生物组的研究有限并且结果并不一致。妊娠合并1型糖尿病(T1D)与孕妇和胎儿的风险增加有关，但尚未研究过此背景下的肠道微生物组。本研究通过宏基因组(WMS)测序，对70例孕妇(36例T1D患者)的肠道细菌微生物组的组成和功能进行了分析。结果显示，T1D和非T1D女性的肠道微生物组组成和功能在整个妊娠期间表现出显著变化。T1D女性的变化独特，表现为产脂多糖的细菌增加以及产短链脂肪酸的细菌减少，尤其是在孕晚期。此外，T1D女性的粪便钙网蛋白和血清中肠道来源的脂肪酸结合蛋白(I-FABP)浓度升高，前者是肠道炎症标志，而后者是肠上皮损伤的标志。因此，T1D女性肠道微生物组在怀孕期间的转变更倾向于促进炎症，这与肠道炎症的证据相关。这些变化可能会增加T1D女性发生妊娠并发症的风险，但这些改变也可能通过饮食干预进行调节。
原名：Type 1 diabetes in pregnancy is associated with distinct changes in the composition and function of the gut microbiome
译名：妊娠期1型糖尿病与肠道微生物组的组成和功能发生明显变化有关
期刊：Microbiome
IF：14.650
发表时间：2021.8.6
通讯作者：Leonard C. Harrison
通讯作者单位：澳大利亚沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所
澳大利亚的ENDIA研究是一项前瞻性、妊娠分娩队列研究，队列随访了1500名一级亲属患T1D的澳大利亚儿童。2013年2月至2017年10月收集粪便样本。其中，35名T1D女性（36次妊娠，其中1人妊娠两次）和31名非T1D女性（34次妊娠，其中3人妊娠两次）分别提供了一至三份妊娠期粪便样本（总共134份样本），用于鸟枪法全基因组测序分析(图1)。表1总结和比较了T1D女性妊娠和非T1D女性妊娠的特征。使用Illumina NovaSeq 6000进行全基因组测序，每个样本平均有47,766,763±10,956,057（平均值±标准差）条序列。原始序列使用KneadData bioBakery工具进行预处理（
SRA
登录号：PRJNA604850），以消除人类DNA序列和质量差的序列，平均删除了6%的序列。经过质量控制和序列过滤步骤后，每个样本获得了44,940,628±10,572,188（平均值±标准差）条序列。
图1. 妊娠期间收集的粪便样本。N：样品数量；T1：孕早期；T2：孕中期；T3：孕晚期；T1D：1型糖尿病女性；非T1D：非1型糖尿病的女性。
表1. T1D和非T1D妊娠的特征总结。受孕时父性年龄采用对数转换。
2 妊娠期T1D和非T1D女性肠道微生物组的分类多样性和组成通过MetaPhLan2的HUMAnN2进行分析。共鉴定了340种细菌，平均每个样本有93±13（平均值±标准差）个物种。计算每个样本的α多样性（观察到的丰富度或物种数量），并应用广义估计方程(GEE)来检测T1D和非T1D女性之间以及妊娠期之间是否存在差异，并确定T1D状态和妊娠期是否存在交互作用。结果显示T1D状态或时间或二者的相互作用均不存在显著差异。为分析β多样性，我们计算了样本间的Bray-Curtis系数，并进行了每个分类学水平的主坐标分析(PCoA)的排序与绘图(图2)。为检验β多样性的差异，我们对比例对数转换的Bray-Curtis系数数据进行了重复测量置换方差分析(RMA-PERMANOVA)。结果表明在所有分类水平上，T1D状态与时间之间存在显著的交互作用。因此，我们分别在妊娠的三个时期中对T1D和非T1D女性间的差异进行了评估。在孕早期和孕中期没有发现显著差异，但孕晚期在菌株(P=0.002)、种(P=0.001)、属(P=0.070)和科(P=0.034)水平上均发现显著差异。
图2. 按T1D状态进行的β多样性分析。PCoA图是基于妊娠三期的菌株和物种水平的样本间Bray-Curtis距离。T1D：1型糖尿病女性（红色）；非T1D：非1型糖尿病的女性（蓝色）。
β多样性的差异反映了细菌组成上的差异。为了确定妊娠期T1D和非T1D女性之间特定菌群的差异，我们分析了细菌丰度的差异。只考虑至少在一组中流行率（即具有这些分类群的样本比例）高于50%且log2倍数变化(logFC)大于0.5或小于-0.5的分类群。在整个妊娠期中，T1D女性的粪拟杆菌(Bacteroides caccae)(FDR 0.03)及其独特菌株(未分类)(FDR 0.03)，以及肠杆菌目(Enterobacteriales)(FDR 0.07)均有所增加(图3)。另一方面，Bacteroidales bacterium ph8(FDR 0.034)、Bacteroidales bacterium ph8菌株GCF000311925(FDR 0.03)、所属的属(FDR 0.08)和科(FDR 0.08)、以及双歧杆菌目(Bifidobacteriales)(FDR 0.07)在T1D女性中减少(图3)。我们还在三个妊娠期中分别评估了T1D和非T1D女性之间的差异。T1D和非T1D女性的细菌分类群在孕早期和孕中期没有明显差异，但在孕晚期发现了一些差异。其中，T1D女性的粪拟杆菌(Bacteroides caccae) (FDR 0.004)及其独特菌株(未分类)(FDR 0.004)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)(FDR 0.04)及其独特菌株(未分类)(FDR 0.04)和单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)(FDR 0.04)增加，而Bacteroidales bacterium ph8及其菌株GCF000311925(FDR 0.005)、所属的属(FDR 0.08)和科(FDR 0.08)和双歧杆菌目(FDR 0.07)减少(图3)。粪拟杆菌和普通拟杆菌之间发现了显著的Spearman相关性（R2=+0.43 > 0.4；adj.P=0.013）。为了确定肠杆菌目和双歧杆菌目中最丰富的细菌种类，我们绘制了T1D和非T1D女性的平均相对丰度图（图S5A）。大肠杆菌(Escherichiacoli)是肠杆菌目中含量最高的物种，与大肠杆菌属(Escherichia)的一个未分类物种一起，几乎占了该目的全部丰度。此外，在大肠杆菌和Coprococcus sp. ART55_1之间发现了显著的Spearman负相关性（R2=−0.6，adj.P=0.09）。青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是双歧杆菌目中最丰富的物种。采用lmer检测T1D和非T1D女性之间这四种物种丰度是否存在差异，结果显示T1D和非T1D女性孕晚期的大肠杆菌和孕早期的青春双歧杆菌的丰度存在显著差异（P=0.01）。
图3. T1D（红色）和非T1D（蓝色）女性妊娠三期中显著差异丰度细菌分类群的log2转换拟合值的平均值和标准误。右上角*表示整个妊娠期的两组间存在显著差异（FDR<0.1）；两点之间*表示该孕期的两组间存在显著差异（FDR<0.1）。
无论是按照妊娠天数
(P值0.5)还是妊娠期(P>0.6)（分别作为连续变量或分类变量），在T1D和非T1D女性中均未观察到α多样性随时间的显著变化。对于β多样性，由于T1D状态和时间之间存在显著的相互作用，因此我们分别在T1D和非T1D女性中评估了不同时间（妊娠天数或妊娠期）的β多样性差异。在非T1D女性中，以时间作为连续变量，仅在菌株(P值0.03)和物种(P值0.06)水平上检测到差异。然而，在T1D女性中，除了目和门之外，在所有分类水平上，妊娠天数和妊娠期之间的β多样性差异均显著。这些观察结果表明，T1D女性妊娠期间的微生物群落结构不太稳定。因此，我们进一步在每个组内分别识别不同妊娠期间丰度差异显著的分类群。在整个妊娠期间，在T1D女性中，Peptostreptococcaceae科的未分类种(FDR 0.02)、Odoribacter splanchnicus (FDR 0.098)、由Prevotella copri组成的Prevotella (FDR 0.066)和Verrucomicrobia门(FDR 0.043)的丰度减少，而Streptococcus thermophilus的一个未分类菌株(FDR 0.099)、Streptococcus thermophilus (FDR 0.04)和Porphyromonadaceae (FDR 0.092)增加。在非T1D女性中，Anaerostipes hadrus GCF000332875菌株(FDR 0.038)和Anerostipes hadrus (FDR 0.059)、Haemophilus parainfluenzae的一种未分类菌株(FDR 0.001)、Haemophilus(FDR 0.004)、Pasteurellaceae(FDR 0.002)、菌株GCF000218445(FDR0.04)、Lachnospiraceae bacterium1157FAA(FDR 0.055)和Veillonella属的未分类物种 (FDR 0.083)在妊娠期间减少。此外，在非T1D女性中，菌株Ruminococcus sp. 5139BFAAGCF000159975(FDR 0.063)和Lachnospiraceae bacterium3157FAACT1 GCF000218405(FDR 0.075)及其对应物种(FDR 0.065和0.075)，Streptococcus thermophilus和Bifidobacterium_animalis的未分类菌株(FDR 0.06和0.06)及其及其对应物种(FDR 0.06和0.06)在整个怀孕期间都有所增加。正如预期，T1D和非T1D女性的血清1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)（短期血糖控制的标志物）存在显著差异（表1），并且T1D女性的血清1,5-AG水平与微生物门水平的β多样性相关。生产方式仅与科水平的β多样性相关。β多样性与受孕年龄、体重指数(BMI)、胎次、碳水化合物或纤维摄入量之间未发现显著关联。然而，菌株和物种水平的微生物组组成在人类白细胞抗原(HLA)II类型上存在差异。用于检测T1D和非T1D女性之间β多样性差异的模型校正了HLA类型。HLA类型占孕晚期β多样性变异[R2]的3.2%。在校正了这种影响后，T1D状态解释了2.9%的变异，并且T1D和非T1D女性的β多样性差异具有统计学意义（P=0.004）。最后，即使对于差异丰度分析，模型中也包括了对HLA类型的校正，也进行了额外的分析以检验由于HLA类型而导致的特定分类群的丰度差异，并验证根据T1D状态定为丰度差异的分类群是不受HLA类型的影响的。仅检测到HLADR34和HLADR3X和DR4X之间孕早期Eubacterium ramulus GCF000469345菌株和Eubacterium ramulus，以及孕晚期Eubacterium rectale一个未分类株和Eubacterium rectale差异，这些细菌在HLA DR34女性中有所降低。由于T1D状态而被确定为丰度差异显著的分类群都没有受到HLA类型的显著影响。序列经HUMAnN2处理后进行注释，量化完整的代谢通路，计算基因丰度并重新按照KO和MetaCyc反应进行功能分类。共发现451个完整通路、5628个KO和3204个MetaCyc反应。对于相对丰度，T1D状态和时间之间并未发现显著交互作用。当把时间视为连续变量带入模型时，T1D女性的所有三个功能类别的丰度都显著更高。对于β多样性，T1D状态和时间之间发现显著交互作用。因此，我们在三个妊娠期内分别评估组间的差异，但仅在孕晚期发现了显著的组间差异（图4）。
图4. 1型糖尿病(T1D)状态的β多样性分析。PCoA排序图是基于孕晚期样本的a 通路、b KOs和cMetaCyc的Bray-Curtis距离。T1D：1型糖尿病女性（红色）；非1型糖尿病的女性（蓝色）。
T1D和非T1D女性在代谢通路、KO和MetaCyc类别中的许多特征的丰度表现出显著差异。表2展示了主要的功能以及有助于这些功能的主要细菌种类，包括脂多糖(LPS)产生、维生素K2合成、维生素B6合成、维生素B12合成、短链脂肪酸(SCFA)合成和粘蛋白降解。有趣的是，T1D女性的参与细菌LPS合成的1个通路（PWY1269：CMP-3-脱氧-D-甘露糖-辛糖酸酯合成I）、17个KO基因类别和2个MetaCyc反应（DARAB5PISOM-RXN和UDPGLCNACEPIM-RXN）（表2；图5），以及参与维生素K2合成的7个通路和6个KO基因显著增加（表2；图5）。此外，T1D女性孕晚期的两个KO类别也显著增加，分别涉及抗生素耐受性（K03771）和生物膜形成（K18831）。吡哆醛5'-磷酸合酶(K06215)参与维生素B6合成的脱氧木酮糖5-磷酸(DXP)非依赖性途径；与维生素B12（钴胺素）合成相关的1个途径、5个KO类别和6个MetaCyc反应；参与SCFA合成的5个途径、11个KO类别和13个MetaCyc反应，包括丙酮酸和乙酰辅酶A的产生以及乙酸或乳酸生成丁酸，在T1D女性中均显著减少（表2；图5)。参与黏蛋白降解的β-N-乙酰氨基己糖苷酶(K01207)的丰度在T1D女性中也显著降低，但仅在孕中期（表2；图5)。表2. T1D女性丰度差异明显的通路和酶。
图5. T1D（红色）和非T1D（蓝色）女性的妊娠三期丰度差异明显的功能特征的log2转换拟合值的平均值和标准误。六大类中每一个都展示了一个例子：脂多糖(LPS)产生（CMP–3–脱氧–D–甘露糖–辛糖酸酯合成[PWY–1269]）、维生素K2合成（甲萘醌–8合成的超级途径[PWY–5838])、维生素B6合成（吡哆醛5'-磷酸合酶[K06215]）、维生素B12合成（钴宾酰胺回收腺苷钴胺素[COBALSYN-PWY]）、短链脂肪酸(SCFA)产生（3-羟基丁酰-CoA脱氢酶[K00074]）和粘蛋白降解（β-N-乙酰氨基己糖苷酶[K01207]）。右上角*表示整个妊娠期的两组间存在显著差异（FDR<0.1）；两点之间*表示该孕期的两组间存在显著差异（FDR<0.1）。源自HUMAnN2的丰度明显差异的功能特征并不是来源于单个物种，而是多个物种组合。因此，可以将六个选定功能中每个功能的主要贡献物种的相对丰度分为簇（表2）。对于具有三个或更多特征的功能，只考虑至少三个特征的主要贡献者。对于每个簇，使用与差异丰度分析相同的lmer拟合线性模型。这证实了T1D女性的有助于LPS产生和维生素K2合成的细菌簇丰度增加，而有助于维生素B6和B12合成、SCFA产生和粘蛋白降解的细菌簇丰度减少。由于T1D女性肠道微生物组的组成和功能提示其处于促炎状态，因此我们进一步寻找T1D女性肠道炎症的证据。中性粒细胞和单核细胞释放的粪便钙网蛋白是肠道炎症的标志物，可能导致上皮通透性增加。血清中肠道脂肪酸结合蛋白(I-FABP)是肠上皮损伤的标志物。我们在61名女性（32名T1D患者）和55名女性（27名T1D患者）的孕晚期样本中分别测量了粪便钙网蛋白和血清I-FABP水平。与非T1D女性相比，T1D女性的粪便钙网蛋白（112±148 vs.36±28 [平均值±标准差] mg/kg：P=0.04；Mann-Whitney检验）和血清I-FABP显著增加（587±235 vs. 314±185 [平均值±标准差] pg/mL：P=0.0003；Mann-Whitney检验）。但是，这些标志物与T1D和非T1D女性之间丰度差异明显的任何分类群都没有显著相关性（Spearman R > 0.4）。
此前，Koren等和DiGiulio等曾分别在两项研究中对16S rRNA基因V1-V2和V3-V5区域进行了测序，分析了怀孕期间的肠道微生物组，但得出了不同的结论。据我们所知，本研究是第一个研究妊娠期T1D女性的，这些女性在妊娠期间出现并发症的频率更高，并且有全身性和子宫内炎症的证据，这可能与肠道微生物组有关。Koren等比较了来自91位孕妇的孕早期和孕晚期样本，并报告了孕晚期的α多样性下降并且“肠道微生物群重塑”，特别是产抗炎性SCFA丁酸盐的栖粪杆菌属(Faecalibacterium)减少以及促炎性的变形菌门中的一些分类群增加。另一方面，DiGiulio等对49名女性进行每周抽样，发现怀孕期间的微生物组多样性或组成没有显著变化。与DiGiulio等研究类似，我们在怀孕期间也没有观察到α多样性的差异，但在非T1D女性的微生物菌株和物种水平以及T1D女性的所有分类学水平中观察到了β多样性的差异。此外，我们观察到T1D女性的特定分类群微生物的相对丰度在整个孕期发生了明显变化，发展为更具促炎性的微生物组结构，这与Koren等的研究相似。功能注释加强了T1D和非T1D女性之间的微生物组分类上的差异，揭示了随着妊娠进展，代谢酶和通路的丰度变化情况。这些差异不能归因于人口学或其他因素，包括饮食。但是需要注意的是本发现是基于DNA分析，可能并不一定能反映RNA或蛋白质水平的变化。在检查微生物丰度差异时，我们观察到两种主要模式：（1）在整个妊娠期中，T1D和非T1D女性之间的分类群丰度均存在差异；（2）在妊娠早期，T1D和非T1D女性之间的分类群丰度相似，但在孕晚期明显增多或减少而形成差异。在第一类中，粪拟杆菌(B. caccae)和肠杆菌目在T1D女性的整个妊娠期中均增加。在肠杆菌目中，大肠杆菌是最丰富的物种，并且在T1D女性中富集。大肠杆菌的产物，包括脂多糖和小菌素，都会促进肠道炎症、肠道通透性和轻度的全身炎症，特别是与炎症性肠病的发病机制有关。此外，这些兼性厌氧菌的增加可能会取代那些产生SCFAs的专性厌氧菌，进一步加剧炎症，大肠杆菌和Coprococcus sp. ART55_1丰度的负相关就支持了这一观点。在T1D女性中，这可能导致普氏菌属(Prevotella)的丰度降低，该属几乎完全由Prevotella copri组成，这种菌种会生产琥珀酸盐和SCFAs中的丙酸盐和乙酸盐，而丙酸盐和乙酸盐已知与改善葡萄糖代谢相关。此外，T1D女性的大肠杆菌增多使抗生素耐受性(K18831)和生物膜形成(K03771)相关酶的丰度随之增加。大肠杆菌的细菌生物膜增强了其对抗生素和宿主免疫反应的耐受性，可能使大肠杆菌更利于在肠道内生长，而不是其他更敏感的竞争相同资源的细菌，包括SCFA生产者，这些SCFA生产者细菌在T1D女性肠道丰度较低。在第二类中（在孕晚期变为丰度差异显著的分类群），我们观察到来自拟杆菌目的三个物种，粪拟杆菌、单形拟杆菌(B. uniformis)和普通拟杆菌(B. vulgatus)在T1D女性中显著增加。据报道，具有胰岛自身免疫儿童的拟杆菌属(Bacteroides)比健康对照组多。属于拟杆菌目的拟杆菌属和Alistipes属的细菌（包括B. caccae、B. vulgatus、B. uniformis、B. dorei、B. fragilis、B. faecis、B. Finegoldii、B. thetaiotaomicron、B. xylanisolvens、B. stercoris、B. ovatus和A. Finegoldii、A. onderdonkii、A. shahii）组成了LPS细菌簇的一部分，而LPS细菌簇在T1D女性中富集，尤其是孕晚期。T1D女性的与SCFA产生相关的29项功能特征减少。SCFAs细菌簇由Faecalibacterium prausnitzii、Eubacterium rectale、Anaerostipes hadrus、Lachnospiraceae_bacterium 5 1 63FAA、Ruminococcus torques、Roseburia intestinalis和Roseburia inulinivorans组成，它们都属于梭状芽孢杆菌纲，是主要的丁酸盐生产者。丁酸盐可防止肠道炎症并促进肠道屏障功能。此外，由Eubacterium rectale、 E. siraeum、Ruminococcus bromii、Bifidobacterium adolescentis、B. bifidum和Roseburia intestinalis产生的降解粘蛋白的β-N-乙酰氨基己糖苷酶(K01207)在T1D女性中显著减少，但仅限于孕中期。粘蛋白的降解会产生寡糖、乙酸盐和丙酸盐，三者又会刺激粘液生成并增强上皮完整性，防止“肠道渗漏”以及毒素和膳食抗原易位到体循环中。由于T1D女性的粘蛋白降解较低，因此对粘蛋白的生成刺激更少。这也可能是由于T1D女性中观察到的产生丁酸盐的细菌丰度较低。因此，T1D女性的肠道微生物组表现出的促炎特征可能与轻度全身炎症相关。T1D女性中与维生素K2（甲基萘醌；MK-7）合成相关的细菌功能显著增加，而与B组维生素——B6（吡哆醇）和B12（钴胺素）合成相关的细菌功能显著减少。哺乳动物无法合成这些维生素，必须从饮食或肠道微生物中获取。一项关于肠道微生物组的宏基因组测序的小型研究观察到，2型糖尿病患者的维生素K2通路(PWY-5838)也有类似的增加。维生素K2是凝血和骨骼健康所必需的，但为什么糖尿病患者的维生素K2的肠道细菌合成会增加尚不清楚。所有B族维生素都有助于调节免疫炎症，它们的缺乏与炎症性疾病有关。人群研究显示维生素B6缺乏与炎症标志物有关，并且在T1D中很常见。有趣的是，我们发现维生素B6合成中的关键酶，吡哆醛5'-磷酸合酶(K06215)，在T1D女性的整个妊娠期间均减少。维生素B12具有多种抗氧化特性，并且是普雷沃氏菌(Prevotella)将琥珀酸盐转化为丙酸盐所必需的。大多数T1D和非T1D女性都报告从怀孕早期开始服用多种B族维生素（表1），并且孕晚期的血浆B6和血清B12在T1D和非T1D女性之间没有显著差异（表1）。尽管如此，T1D女性中这些合成维生素的肠道细菌的相对缺乏可能会导致肠道微生物组的其他变化，这强调了膳食补充剂在这组女性中的重要性。我们的研究结果表明，肠道微生物组组成不仅会在怀孕期间发生变化，而且在T1D女性中也会以独特的方式发生变化。孕晚期T1D女性表现出更促炎性和分解代谢性的肠道微生物组特征，这反映在产LPS细菌增加和产SCFA细菌减少上。这些变化可能是我们在T1D女性中观察到的钙网蛋白（肠道炎症标志物）和I-FABP（肠道上皮完整性标志物）增加的原因，已知这些变化与上皮屏障功能受损以及LPS和其他细菌产物渗漏导致的轻度全身炎症有关。我们认为T1D肠道微生物组变化引起的全身性炎症可能会导致T1D妊娠并发症风险增加。此外，母亲体内的促炎性肠道微生物组可能会影响出生后的婴儿。在一项小鼠研究中，Aguero等发现当怀孕期间的无菌母亲肠道短暂接触营养缺陷型大肠杆菌突变体，会加剧其无菌后代肠道中的先天性免疫发育。这种效应是由一系列大肠杆菌产物和母体抗体通过胎盘以及母亲的血清和乳汁转移介导的。因此，母体会在其后代暴露于外部环境之前就为其免疫系统做好准备。如果大肠杆菌和其他产LPS肠道细菌丰度增加的T1D母亲能更好地激发后代的先天免疫，这可以防止生命早期发生潜在的糖尿病感染，并且母亲为T1D患者的婴儿患T1D的风险会比父亲为T1D的风险低。
女性肠道微生物组在怀孕期间会发生变化，但其变化在T1D患者中是独特的。包括促炎特性细菌增加、抗炎特性细菌减少以及合成必需维生素的细菌减少，这些改变可能导致轻度的肠道炎症、上皮屏障功能障碍、上皮通透性增加和轻度的全身炎症。这些是在多种疾病中观察到的肠道微生物群“生态失调”的特征，其中一些可以通过益生菌和其他饮食干预进行改善。这些变化与T1D妊娠过程中母亲和胎儿风险增加的关系需要进一步调查。通过饮食方式干预以改善促炎性的肠道微生物组可能对母亲和胎儿都有好处.
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