科研 | 中科院生态环境中心：芦苇根际锰氧化物加速人工湿地氨氧化（国人佳作）

2021-10-15 09:11

芦苇被广泛用于人工湿地（CWs）以处理废水。

编译：微科盟清韵，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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导读

芦苇被广泛用于人工湿地（CWs）以处理废水。芦苇根际中微生物和铁/锰（Fe/Mn）胶膜的富集在很大程度上促进了污染物的去除。然而，它们在水净化中的相互和潜在的协同作用尚不清楚。为了解决这个问题，本研究首先比较了6个长期运行的CWs中芦苇根际和相邻非根际土壤中的微生物群落特征。结果表明，芦苇根际中富集的微生物和功能基因主要参与了Mn的氧化，导致根际中富集了2-3倍的Mn氧化物。富集的Mn氧化物在驱动微生物群落组成和功能方面发挥了重要作用。为了进一步了解根际中Mn的生物氧化作用，本研究利用以基因组为中心的分析鉴定了Mn氧化细菌，发现92%鉴定的Mn氧化细菌可能参与了氮循环。对Mn氧化基因与不同的氮循环基因之间的关系进行分析，发现Mn氧化基因的丰度与氨氧化基因amoA显著相关（R=0.65）。值得注意的是，占氨氧化菌39.11%的完全氨氧化（comammox）Nitrospira也与Mn氧化微生物呈正相关关系。基于上述观察，本研究推断，在CWs中使用Mn氧化物作为底物可能会增强氨的氧化。为了将其应用到实际工程中，本研究在中试规模的Mn改进的CWs中探索了处理性能。正如预期的那样，氨的去除能力平均提高了23.34%。此外，在Mn改进的CWs中，amoA基因的丰度明显增加，表明生物过程而不是化学反应得到了改善。

论文ID

原名：Manganese oxides in Phragmites rhizosphere accelerates ammonia oxidation in constructed wetlands

译名：芦苇根际锰氧化物加速人工湿地氨氧化

期刊：Water Research

IF：11.236

发表时间：2021.09.23

通讯作者：曲久辉＆柏耀辉

通讯作者单位：中国科学院生态环境研究中心

实验设计

结果

1 芦苇根际Mn氧化菌和Fe/Mn氧化物富集

比较了6个运行的人工湿地（CWs）中芦苇根际和非根际土壤的微生物群落和功能组成（图1a和S1）。根际土壤中最丰富的微生物是Hydrogenophaga、Rhodobacter、Pseudoxanthomonas、Microbacterium和Methylibium，而Desulfurispirillum在非根际土壤中高度富集。由于芦苇根系的好氧根际环境，大多数富集的微生物是好氧细菌。22种富集在根际的微生物中有10种被鉴定为Mn氧化细菌（表S5）。此外，10种Mn氧化细菌中有7种被记录为植物促生菌，可以促进氮或磷的转化。相比之下，在非根际环境中富集的 12种微生物中有4种与Mn还原有关并且是厌氧的。此外，两种非根际富集细菌被鉴定为Mn氧化细菌和植物促生菌。LEfSe分析（图1b）鉴定出在芦苇根际和非根际土壤之间18个不同的功能基因。值得注意的是，编码Fe复合物受体蛋白的基因在芦苇根际显著富集，表明根际存在广泛的Fe循环过程。此外，芦苇根际中也富含与低分子量有机碳转运系统相关的蛋白质，这可能是因为根际微生物组利用了由低分子量有机化合物组成的根系分泌物以维持植物生长。

基于上述发现，比较了根际和非根际土壤中Fe/Mn氧化物的含量。结果表明，根际土壤中Fe和Mn氧化物的含量均显著增加。有磁选和无磁选的非根际土壤中 Mn氧化物（图1c）的平均含量分别为10.19±7.45和110.78±21.16mg/kg，根际土壤中Mn氧化物的平均含量分别为27.11±22.22和244.13±89.10 mg/kg。平均而言，Mn氧化物在根际的富集是非根际的2～3倍。根际土壤中Fe氧化物的平均含量（1 804.65 ± 590.63和5 710.93 ± 1 947.75 mg/kg）比非根际土壤（1235.02 ± 258.00和3328.30 ± 256.40 mg/kg）高2～3倍（图S2）。

图1. 芦苇根际富集的微生物和Fe/Mn氧化物的特征。（a）基于从宏基因组序列中提取的16S rRNA的非根际和根际土壤之间的分类差异。（b）基于KEGG注释的非根际和根际土壤之间的功能差异；红色虚线将根际（上部）或非根际土壤（下部）中较高丰度的属和代谢功能分开。（c）有（左部分）和无（右部分）磁选的CWs非根际和根际土壤中Mn氧化物含量。

2 Mn氧化物可能驱动芦苇根际微生物组

为了确定哪些环境因素导致芦苇根际微生物组的组成差异，将分类学和功能群落组成的距离校正差异与废水特性（电导率、ORP、pH、水温、DO、NO₃^--N、NH₄⁺-N、TN、TP和TOC）和土壤特性（非根际和根际土壤中的Fe/Mn氧化物）联系起来。如图2所示，土壤Fe/Mn氧化物的含量与分类和功能组成高度相关。水温和溶解氧与根际微生物组的功能和分类组成显著相关，表明根际微生物随着CWs中根际环境的季节性（温度）和昼夜（DO）变化而变化。此外，非根际和根际土壤中的Mn氧化物与水温、NH₄⁺-N和TP呈正相关，环境因子之间成对相关均大于0.5。温度和氧气是锰氧化微生物生长的敏感因素，最终会影响锰氧化物的形成。磷酸盐和锰氧化物之间的高度相关性可能是由于磷酸盐对锰氧化物的强烈吸附。铵和锰氧化物之间的强正相关表明氨氧化和锰氧化之间存在关联。

图2. 显示了环境因素之间的成对比较，颜色梯度表示Spearman相关系数。通过部分Mantel测试与每个环境因素相关的分类学（基于宏基因组组装基因组）和功能性（基于KEGG注释）根际微生物群落组成。

3 与氨氧化相关的生物Mn氧化

为了了解芦苇根际微生物组中的生物Mn氧化，本研究获得了2552个宏基因组组装基因组（MAGs，完整性>50%；污染<10%）和101个细菌MAGs（完整性>75%；污染<5%）至少含有1个Mn氧化基因，包括3个过氧化物酶基因（mopA）和9个多铜氧化酶基因（boxA、cotA、cueO、mofA、moxA、mcoA和3种类型的mnxG），被鉴定为推定的Mn氧化细菌（图3）。然后构建了基于101种推定的Mn氧化细菌和11种已发表的Mn氧化细菌（表S3）的系统发育树。Nitrosomonas、Rhodoferax、Hydrogenophaga和Pseudorhodobacter先前已被确定为锰氧化细菌。Hydrogenophaga、Methylibium和Pseudorhodobacter在根际环境中富集，表明这些MAGs可能具有更多的潜在功能来适应根际环境。此外，研究发现大多数锰氧化细菌含有mopA或moxA基因。基于短读长比对结果，mopA和moxA占锰氧化总基因的59.81±6.62%。因此，在CWs环境中，mopA和moxA是芦苇根际中主要的Mn氧化基因。

然后，假设Mn氧化微生物可以通过拥有amoA基因氧化氨来探索Mn氧化和氨氧化之间的关联。因此，针对NCycDB筛选了来自Mn氧化细菌的氨氧化和其他氮循环基因，以确定哪些Mn氧化细菌参与了氨氧化和其他氮循环过程。在101种推定的Mn氧化细菌中，总共有93种与至少一种氮循环过程有关，其中大部分参与反硝化和/或硝酸盐还原（图3）。值得注意的是，8种MAGs被归入Nitrosomonas，其中含有氨氧化细菌。基因组比对结果表明，3种含有功能性氨氧化基因amoA，进一步证实了它们的氨氧化能力。因此，这些结果表明Mn氧化细菌可能参与氮循环，其中一些有助于氨氧化。

图3. 含有Mn氧化基因的MAGs的系统发育树。使用了从NCBI下载的Mn氧化细菌的参考基因组。

将芦苇根际中与氮循环相关的所有类型功能基因的丰度与Mn氧化基因（图4和S3）相关联。Mn氧化基因的含量与amoA之间有显著的线性关系（图4a），而其他氮循环基因（如norZ和nirK）与Mn氧化基因没有显著的线性关系（图S6）。相关分析进一步证实，mopA和moxA均与amoA显示出显著的线性关系（图4b和c）。基于上述结果，本研究提出Mn氧化和氨氧化之间的关系可以通过这两种功能微生物的共存来解释。因此，针对自定义amoA数据库（包含古细菌、细菌和comammox amoA序列）选择了MAGs，并确定了17个包含amoA的MAGs，然后使用基因组分类数据库对其进行分类。其中，5个隶属于Nitrosomonas，7个（具有comammox amoA）隶属于Nitrospira，2个隶属于氨氧化古菌（AOA），3个未归属。基于Mn氧化基因丰度与各种氨氧化菌的相关性分析，Nitrosomonas与Mn氧化基因呈负相关，而comammox Nitrospira与Mn氧化基因呈正相关（图5a）。这些结果表明，Mn氧化过程可能与CWs中的comammox Nitrospira共存。此外，comammox Nitrospira丰度显著高于Nitrosomonas（图5b），表明完全氨氧化过程明显有助于CWs环境中的氨去除。此外，基于丰度，comammox Nitrospira占总氨氧化菌的39.11%，而Nitrosomonas占19.86%，表明完全氨氧化Nitrospira是芦苇根际中的主要氨氧化者。

图4. Mn氧化与氨氧化的线性关系。amoA含量与（a）锰氧化基因、（b）mopA和（c）moxA的Spearman相关性。

图5. （a）含氨氧化细菌/古菌的MAGs丰度与锰氧化基因的Spearman相关性；（b）根际样品中 Nitrospira （comammox）和 Nitrosomonas 的丰度。基于GTDB对所选MAGs进行分类。

4 中试试验中在CWs中添加Mn氧化物可促进氨氧化

实际应用中，在中试规模的CWs中添加了Mn氧化物，以增强其除氨能力。在一年的采样活动中（12个采样时间点），与未改动的CWs相比，用Mn氧化物添加的CWs将氨去除能力提高了24.34±35.50%（图6a）。此外，添加Mn氧化物的CWs的出污水中硝酸盐浓度明显高于未添加Mn氧化物的污水，这表明Mn氧化物添加的CWs对氨的氧化作用得到加强（图S4）。TOC、TN和TP的去除能力在有和没有Mn氧化物添加的CWs之间只显示出轻微的差异（图S4）。进一步量化了4个CWs中氨氧化基因（细菌中的amoA）的含量。对照组在非根际土壤中含有21,694.71±26,754.59拷贝/g，在根际土壤中含有13,990.32± 1,999.12拷贝/g。其他3个Mn氧化物添加的CWs中包含比对照明显更多的amoA基因，表明Mn氧化物可能会刺激amoA基因的产生。古细菌中amoA的丰度也出现了相同的趋势（图S5）。在3个Mn氧化物添加的CWs中，含有更多Mn氧化物的CWs没有表现出明显更高的氨去除能力。首先，这可能是由于进水浓度低导致它们之间的差异很小，这受到其他环境因素的影响（图S4）。其次，amoA的丰度没有表现出显著差异，对应的氨去除能力存在细微差异。总的来说，这些结果表明，Mn氧化物添加可能导致CWs中氨氧化基因的丰度更高，这与本研究的现场采样结果一致。

图6. Mn氧化物提高了氨的去除效率。（a）4种不同氧化锰含量的CWs对氨的日去除能力；（b）4种CWs中锰氧化物在根际土壤和非根际土壤的含量；（c）4种CWs中氨氧化基因（细菌amoA）的丰度。

讨论

1 Mn氧化物和微生物群落的联系

研究了CWs中芦苇根系微生物组的群落和功能组成。与非根际土壤相比，芦苇根际富含更多微生物，Mn氧化细菌分布广泛（图1和S2）。这些Mn氧化细菌可能有助于Mn氧化物的富集。此外，富集的Fe氧化物诱导了Mn氧化物的富集：根际富集的Fe氧化物可以吸收并抑制根际环境中还原的Mn(II)，并被Mn氧化细菌再次氧化（图S7）。此外，Mn氧化物的存在被认为是生物活性的可能指标。芦苇根际环境中的生物质高度富集（图S8），是生物反应的“热点”。在本研究中，与周围金属离子（如Fe和Mn）浓度密切相关的功能性铁络合物转运基因也表明芦苇根系周围存在活跃的金属生物转化和循环。

作为潜在的环境驱动因素，Mn氧化物影响了CWs中的微生物群落（图2）。一方面，富集的Mn氧化物可以通过螯合和氧化有害的金属离子（如As和Cd）以及顽固的微污染物（如诺氟沙星）来保护根际微生物。另一方面，根际富集的Mn氧化物和添加的Mn氧化物都充当电子受体，而还原的Mn(II)是附近微生物群的电子提供者。还原的Mn(II)随后被Mn氧化细菌重新氧化为生物源Mn氧化物。因此，在Mn氧化物添加的CWs中，检测不到流出物Mn(II)。此外，Mn氧化物可以将难降解的有机化合物降解为具有高反应性的不稳定形式，这可能支持更高的细菌生长并导致更加多样化的微生物组。因此，CWs中添加Mn氧化物可能形成高度多样化的微生物群落，这有助于提高污染修复能力。有研究发现，Mn添加的快速砂滤器中微生物组的共生网络分析包含更多的节点和边数，比对照表现出更复杂的相关性，这意味着Mn循环实质上塑造了微生物群落并最终贡献到污染修复中。

2 Mn氧化物增强氨氧化

本研究探讨了Mn氧化物对N循环的影响，结果表明氨氧化能力的增强与生物锰氧化相关（图4）。在CWs中添加Mn氧化物后，氨去除能力更高，amoA基因更多（图5和S6）。尽管温度对微生物的多样性、丰度和活性有明显的影响（图2），但芦苇根际氨氧化和Mn氧化基因之间的相关性在所有6个CWs中都存在。氨氧化基因在添加的Mn氧化物中明显富集，表明Mn氧化物不仅直接氧化氨，更会刺激CWs中的氨氧化菌。此外，更多的Mn氧化物不会引起氨去除能力的显著增加。因此，从工程的角度，本研究提出在CWs中添加100 kg 天然锰砂可以提高氨的氧化能力。同样，网络相关分析表明，氨氧化细菌Nitrosospira multiformis与快速砂滤器中的Mn(II)氧化呈正相关。总的来说，本研究确定氨氧化细菌可能与Mn氧化细菌共存。此外，还确定了哪种类型的氨氧化菌与Mn氧化相关，发现完全氨氧化Nitrospira与Mn氧化基因正相关（图5）。这种完整的硝化菌对氨具有高亲和力和高产的生物量。因此，本研究提出添加后的Mn氧化物通过促进amoA的丰度来增强氨氧化，而amoA主要由完全氨氧化Nitrospira提供。由于大多数Mn氧化细菌不具有amoA，Mn氧化细菌和氨氧化细菌的潜在代谢共存需要在纯培养或合成群体中进一步探索。Mn氧化物添加的CWs中增强的氨氧化导致硝酸盐的过量产生（图S4）。然而，Mn氧化物添加的CWs中硝酸盐的浓度仍低于中国地表水环境质量IV级标准的限值（10 mg/L）。因此，本研究相信锰添加的CWs中具有完全去除氮的巨大潜力。

结论

本研究应用宏基因组测序技术来分析CWs中微生物组的群落组成和功能特征，尤其被认为是一种强大的污染修复材料的芦苇根系微生物组。结果表明，芦苇根系显著富集了氧化锰的微生物和生物量，有助于根际环境中Mn氧化物的富集。此外，Mn氧化物是CWs中芦苇根际微生物群落的环境驱动因素之一。具体而言，Mn氧化物的含量与氨的浓度显著相关，Mn氧化基因的丰度与amoA的丰度呈正相关。相关性分析还表明，根际主要氨氧化菌comammox（完全氨氧化）Nitrospira可能与Mn氧化细菌共存。使用为期一年的中试规模Mn添加的CWs进一步验证了CWs现场采样的推断。添加后的Mn氧化物显著提高了氨去除能力（平均23.34%）。此外，Mn氧化物导致非根际和根际土壤中有更丰富的amoA基因。本研究强调了锰氧化过程的重要性，并支持在CWs中添加锰氧化物来处理废水。