科研 | ISME J：粪便滤液移植可预防坏死性小肠结肠炎

在75头剖腹产早产仔猪中，9头在随机化前被排除（例如复苏失败、死产），而其余66头早产仔猪被纳入后续研究。另外有7只动物因与干预无关的原因（呼吸衰竭、医源性并发症）提前安乐死。2只动物因临床NEC体征提前安乐死（1只在CON组中，1只在FFTr组中），而其余57只动物存活至第5天。在实验过程中，我们观察到31%（5/16）的CON和19%（3/16）的FMT动物出现直肠出血现象，而两个FFT处理组中均未发现该现象（0/13）（与CON相比，p < 0.05）。

2 肠道病理评估

在这种情况下，口服FFT给药显著降低了肉眼可见的NEC的严重程度（p < 0.01，图1B），从而将NEC发生率降低至0%（与CON相比，p < 0.01）。直肠给药FFT也降低了NEC的严重程度（p < 0.01），但与CON相比并没有降低NEC的发病率。然而，直肠给予FMT（我们之前的研究曾发现FMT具有明显的NEC保护作用）未能降低NEC的严重程度和发生率。直肠给药后无出血，直肠给药的动物尸检时也未观察到直肠病变。显微镜的评估支持了口服FFT的宏观的效果，它相对于CON和FMT都减少了组织病理学的NEC严重程度和发生率（p > 0.05，图1C），而在显微镜水平上未发现直肠给予FFT的显著影响。

图1 肠道病理学评价。A代表本研究设计图示；B代表猪胃、小肠和结肠存在极轻微（左上）或重度病理学变化（右上）的代表性尸检照片。箭头指向粘膜中的坏死斑片，箭头突出显示肉眼 可见的肠壁积气。左下图显示了病理学的严重程度，而右下图显示了肉眼可见的NEC的发生率；C代表苏木精和伊红染色完整的小肠（左上）和严重破坏的小肠（右上）的代表性显微照片--在10倍放大下采集。左下图显示了组织病理学严重程度，右下图显示了显微镜下NEC发生率。*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著性差异。

3 安全性评估

图2 安全性评估。A代表从出生至第5天的相对体重生长速率；B从出生至第5天体重生长速率为负值的动物比例。C代表小肠相对重量。D代表小肠通透性。E代表小肠三个节段的刷状缘乳糖酶活性。SI代表小肠；*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著性差异。

4 肠道粘膜和管腔的细菌组成

相对于CON而言，我们在FMT给药的动物的肠腔室中，能够观察到相对丰度差异最多的细菌OTUs，而处理间与粘膜相关的差异丰度细菌的数量相当。相对于CON而言，虽然供体粪便中链球菌（Streptococcus）和乳杆菌（Lactobacillus）这两个菌属的比例都很高，但FFT给药大幅增加了链球菌的相对丰度但没有增加乳杆菌的相对丰度，而FMT则表现出相反的情况，即增加了乳杆菌而非链球菌的相对丰度。有趣的是，虽然肠腔中各组间变形菌门的相对丰度相似（大约在10%左右），但在口服给药FFT的动物粘膜中仅检测到< 1%的变形菌门，而CON的粘膜菌群中有大约10%的细菌由变形菌门（如肠杆菌科Enterobacteriaceae、克雷伯氏菌属Klebsiella）组成，FMT给药动物的粘膜中有约5%的细菌由变形菌门组成（图3C）。

图3 肠道粘膜和肠腔的细菌组成。A代表基于未加权UniFrac度量进行的主成分分析，在相邻表格中给出了成对比较的FDR校正概率水平；B以Shannon指数作为α多样性的指标；C代表在属水平上概述的细菌的相对丰度，图中显示出相对丰度大于1%的细菌属，同时纳入供体粪便的细菌组成作为参考。图中*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著性差异。

5 肠道粘膜和肠腔中病毒和噬菌体组成

FMT动物肠腔病毒与其他处理组之间存在差异，两个FFT给药组与CON组之间也存在区别，而FFT给药途径的影响仅表现出临界显著性（图4A）。有趣的是，与细菌相反，相对于CON，粘膜相关病毒的Shannon指数在FMT和FFTo处理之后有所增加（p < 0.05），但FFTr处理并未增加病毒的Shannon指数（图4B）。肠腔中的病毒Shannon指数也观察到相同的模式。但我们并未观察到粘膜病毒Shannon指数与小肠NEC严重程度之间的相关性（数据未显示）。各组间可识别的病毒大多数为原核病毒（噬菌体），主要属于有尾噬菌体目（Caudovirales，图4C），虽然我们也鉴定出一些真核病毒，但这些真核病毒的相对丰度都相对较低（小于1%）。值得注意的是，相对于CON而言，虽然FMT处理使得一些真核病毒科（如疱疹病毒科Herpesviridae）在粘膜和肠腔中富集，但FFT处理并非引起相同的现象。相对丰富差异的病毒OTUs的数量在FMT受体的肠腔中同样最高，但对于粘膜相关的病毒而言，口服FFT给药方式对病毒OTUs相对丰度的影响与FMT相当。值得注意的是，本身就能够捕获肠杆菌的噬菌体Microviridae科的一些成员，其相对丰度仅在口服FFT处理组的粘膜中有所增加。

图4 肠道粘膜和肠腔的病毒和噬菌体组成。A代表基于限制的Bray-Curtis度量进行的主成分分析，在相邻表格中给出了成对比较的FDR校正概率水平；B以Shannon指数作为α多样性的指标；C代表在科水平上概述了肠道粘膜和肠腔中病毒的平均相对丰度（纳入了组间相对丰度超过0.5%的分类群），同时纳入供体粪便的病毒组成作为参考。标有*的病毒分类群代表噬菌体。A和B中的*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著差异。

6 宿主肠道粘膜转录组分析

图5 宿主肠道粘膜的转录组分析。A代表基于RNA测序的整体差异表达基因的主成分分析；B代表与CON组两两比较的火山图，其中突出强调的点代表差异表达基因；C代表基因互作网络图，其中蓝色代表FMT处理组上调的基因，红色代表FMT处理组下调的基因，圆圈大小代表相互作用数量的多少。

7 系统免疫细胞的特性

最后，我们测量了干预后不久和安乐死时血流中基本免疫细胞亚型的水平，以探究全身免疫的诱导。在实验第3天时，相对于CON组而言，我们发现所有干预组的中性粒细胞计数均略有增加（p值均小于0.05），而单核细胞和总淋巴细胞水平不受影响。而相对于FFTr处理组，FMT中辅助性T细胞（CD4⁺CD8^-）的比例有所增加而初始T细胞比例（CD4^- CD8^-）有所降低（p值均小于0.05）。但在两天后，这些差异都消失了。

为了增加对肠道微生物定向治疗是如何发挥作用来预防肠道病理的理解，我们对宿主肠道粘膜进行了全面的基因表达分析。该分析是基于在解剖标准化的组织标本中进行，这些标本大部分没有严重的病理学。正是由于病理状态造成的偏倚最小，因此这些结果应被解释为孤立的治疗效果。但值得我们注意的是，相对于CON来说，FFT并没有显著影响基因的表达水平，这表明给药病毒（或小分子）和宿主免疫细胞之间没有发生特殊的相互作用，这意味着FFT只对细菌发挥作用。在无菌条件下，已有的研究表明，噬菌体和宿主之间能够通过TLR9信号进行直接相互作用，但在生理条件下，这种效应的重要性可能可以忽略不计。另一方面，FMT治疗调节粘膜基因表达水平，增加对细菌的免疫响应，同时减少宿主对病毒的响应。具体来说，参与LPS信号通路的一系列基因上调，这表明产生LPS的肠杆菌科细菌参与了FMT相关的副作用。此外，FMT导致了给药后不久的循环辅助性T细胞的短暂诱导。从安全性角度来看，FFT的使用对宿主免疫无附带影响，这使得FFT的应用优于FMT。然而，在抗性更强的个体中，FMT诱导的粘膜免疫可能也具有益处。