导读
坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种危及生命的困扰早产儿的胃肠道疾病，目前无法预防。粪便菌群移植（FMT）是一种很有前途的预防疗法，但在移植过程中病原微生物或有毒化合物的转移引起了人们的关注。通过微孔过滤即可以去除供体粪便中的细菌从而可能降低这种细菌感染的风险，而残留的噬菌体又可以维持NEC的预防作用。本研究我们意在评估粪便滤液移植（FFT）的临床前有效性和安全性。使用健康哺乳仔猪的粪便材料，我们在早产、剖腹产仔猪中对直肠FMT给药组（FMT，n = 16）、FFT通过直肠给药组（FFTr，n = 14）、FFT通过口服给药组（FFTo，n = 13）以及生理盐水的对照组（CON，n = 16）进行了比较。我们对肠道病理学进行了评估，并使用16S rRNA基因扩增技术和宏病毒测序分析了粘膜和肠腔细菌和病毒组成。最后，我们使用分离的回肠粘膜，结合RNA-Seq，探究了宿主对不同给药方式的响应。经显微镜证实，口服FFT可完全预防NEC，而FMT的表现并不优于对照组。与对照组相比，口服FFT增加了回肠粘膜中的病毒多样性并降低了变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度。在对FMT的响应中我们观察到粘膜免疫的诱导，但是这一现象在对FFT的响应并未观察到。由于早产儿极易感染，合理的NEC预防策略需要无可争议的安全性表征。我们在临床相关动物模型中表明，与FMT相比，FFT可有效预防NEC，且无任何可识别的副作用。
原名：Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis
译名：粪便滤液移植可预防坏死性小肠结肠炎
期刊：The ISME Journal
IF：10.302
发表时间：2021.9.22
通讯作者：Thomas Thymann
通讯作者单位：丹麦哥本哈根大学卫生和医学学院
在75头剖腹产早产仔猪中，9头在随机化前被排除（例如复苏失败、死产），而其余66头早产仔猪被纳入后续研究。另外有7只动物因与干预无关的原因（呼吸衰竭、医源性并发症）提前安乐死。2只动物因临床NEC体征提前安乐死（1只在CON组中，1只在FFTr组中），而其余57只动物存活至第5天。在实验过程中，我们观察到31%（5/16）的CON和19%（3/16）的FMT动物出现直肠出血现象，而两个FFT处理组中均未发现该现象（0/13）（与CON相比，p < 0.05）。
2 肠道病理评估
基于对回肠和结肠组织病理学的评估，我们对胃肠道进行全面的检查，以评价NEC样病变的严重程度和病变范围。婴儿配方奶喂养早产猪的NEC样病理表型包括广泛的粘膜出血伴有或不伴有片状坏死和肠壁积气，主要影响升结肠和横结肠，而对回肠和胃的影响程度较轻（图1B）。在显微镜水平上，病理观察包括粘膜结构的细微变化，而在最严重的病例中，其可表征为从上皮细胞脱落和出血发展到粘膜完整性的完全破坏（图1C）。在这种情况下，口服FFT给药显著降低了肉眼可见的NEC的严重程度（p < 0.01，图1B），从而将NEC发生率降低至0%（与CON相比，p < 0.01）。直肠给药FFT也降低了NEC的严重程度（p < 0.01），但与CON相比并没有降低NEC的发病率。然而，直肠给予FMT（我们之前的研究曾发现FMT具有明显的NEC保护作用）未能降低NEC的严重程度和发生率。直肠给药后无出血，直肠给药的动物尸检时也未观察到直肠病变。显微镜的评估支持了口服FFT的宏观的效果，它相对于CON和FMT都减少了组织病理学的NEC严重程度和发生率（p > 0.05，图1C），而在显微镜水平上未发现直肠给予FFT的显著影响。
图1 肠道病理学评价。A代表本研究设计图示；B代表猪胃、小肠和结肠存在极轻微（左上）或重度病理学变化（右上）的代表性尸检照片。箭头指向粘膜中的坏死斑片，箭头突出显示肉眼
可见的肠壁积气。左下图显示了病理学的严重程度，而右下图显示了肉眼可见的NEC的发生率；C代表苏木精和伊红染色完整的小肠（左上）和严重破坏的小肠（右上）的代表性显微照片--在10倍放大下采集。左下图显示了组织病理学严重程度，右下图显示了显微镜下NEC发生率。*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著性差异。3 安全性评估
我们进一步探究了一系列安全性参数。最初，我们发现与CON和FFTo相比，FMT组动物中，身体负生长速率动物的比例很高（p值均小于0.05，图2A, B）。再者，相对于FFTo，FMT动物小肠而非结肠的相对重量较低（p < 0.05，2C）。此外，FFTr明显降低了小肠通透性的体内标志物--尿乳果糖与甘露醇比值（与CON相比，p < 0.05，图2D），而FMT组的渗透性显著高于两个FFT组（p值均小于0.05）。最后，相对于FFTr，FMT组粘膜完整性的测量指标--乳糖酶活性显著下降（图2E）。
图2 安全性评估。A代表从出生至第5天的相对体重生长速率；B从出生至第5天体重生长速率为负值的动物比例。C代表小肠相对重量。D代表小肠通透性。E代表小肠三个节段的刷状缘乳糖酶活性。SI代表小肠；*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著性差异。
4 肠道粘膜和管腔的细菌组成
一般情况下，粘膜相关细菌的组成与肠道细菌组成不同（
R2
= 0.11，p < 0.001）。对于粘膜的细菌组成（R2 = 0.17，p < 0.001，图3A）和肠道的细菌组成（R2 = 0.27，p < 0.001）而言，均能观察到明显的干预效果。这其中FMT组的作用最大，尽管如此，两个FFT组在粘膜和肠腔中所产生的干预效果均与CON组之间表现出显著差异。然而，FFT给药途径（FFTr vs FFTo）并不影响细菌组成。各组粘膜相关细菌的Shannon指数相似，但有趣的是我们观察到Shannon指数与小肠NEC严重程度呈正相关关系（p < 0.001）。肠道细菌Shannon指数仅在FMT处理后增加（图3B）。相对于CON而言，我们在FMT给药的动物的肠腔室中，能够观察到相对丰度差异最多的细菌OTUs，而处理间与粘膜相关的差异丰度细菌的数量相当。相对于CON而言，虽然供体粪便中链球菌（Streptococcus）和乳杆菌（Lactobacillus）这两个菌属的比例都很高，但FFT给药大幅增加了链球菌的相对丰度但没有增加乳杆菌的相对丰度，而FMT则表现出相反的情况，即增加了乳杆菌而非链球菌的相对丰度。有趣的是，虽然肠腔中各组间变形菌门的相对丰度相似（大约在10%左右），但在口服给药FFT的动物粘膜中仅检测到< 1%的变形菌门，而CON的粘膜菌群中有大约10%的细菌由变形菌门（如肠杆菌科Enterobacteriaceae、克雷伯氏菌属Klebsiella）组成，FMT给药动物的粘膜中有约5%的细菌由变形菌门组成（图3C）。
图3 肠道粘膜和肠腔的细菌组成。A代表基于未加权UniFrac度量进行的主成分分析，在相邻表格中给出了成对比较的FDR校正概率水平；B以Shannon指数作为α多样性的指标；C代表在属水平上概述的细菌的相对丰度，图中显示出相对丰度大于1%的细菌属，同时纳入供体粪便的细菌组成作为参考。图中*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著性差异。
5 肠道粘膜和肠腔中病毒和噬菌体组成
FMT动物肠腔病毒与其他处理组之间存在差异，两个FFT给药组与CON组之间也存在区别，而FFT给药途径的影响仅表现出临界显著性（图4A）。有趣的是，与细菌相反，相对于CON，粘膜相关病毒的Shannon指数在FMT和FFTo处理之后有所增加（p < 0.05），但FFTr处理并未增加病毒的Shannon指数（图4B）。肠腔中的病毒Shannon指数也观察到相同的模式。但我们并未观察到粘膜病毒Shannon指数与小肠NEC严重程度之间的相关性（数据未显示）。各组间可识别的病毒大多数为原核病毒（噬菌体），主要属于有尾噬菌体目（Caudovirales，图4C），虽然我们也鉴定出一些真核病毒，但这些真核病毒的相对丰度都相对较低（小于1%）。值得注意的是，相对于CON而言，虽然FMT处理使得一些真核病毒科（如疱疹病毒科Herpesviridae）在粘膜和肠腔中富集，但FFT处理并非引起相同的现象。相对丰富差异的病毒OTUs的数量在FMT受体的肠腔中同样最高，但对于粘膜相关的病毒而言，口服FFT给药方式对病毒OTUs相对丰度的影响与FMT相当。值得注意的是，本身就能够捕获肠杆菌的噬菌体Microviridae科的一些成员，其相对丰度仅在口服FFT处理组的粘膜中有所增加。
图4 肠道粘膜和肠腔的病毒和噬菌体组成。A代表基于限制的Bray-Curtis度量进行的主成分分析，在相邻表格中给出了成对比较的FDR校正概率水平；B以Shannon指数作为α多样性的指标；C代表在科水平上概述了肠道粘膜和肠腔中病毒的平均相对丰度（纳入了组间相对丰度超过0.5%的分类群），同时纳入供体粪便的病毒组成作为参考。标有*的病毒分类群代表噬菌体。A和B中的*和**分别表示在0.05和0.01水平上具有显著差异。
6 宿主肠道粘膜转录组分析
为了深入了解宿主对不同处理之间的粘膜响应，我们对回肠粘膜样本进行了RNA测序。主成分分析显示，FMT处理组沿第二主成分与其余组别分离（图5A）。值得注意的是，对于两种不同的FFT给药方式处理组，我们发现这两个组别相对于CON组未表现出统计学上具有显著差异的差异表达基因，而相对于CON组，FMT处理增加了86个基因的表达，降低了41个基因的表达（图5B）。当采用倍数变化标准（log2> 1）时，相对于CON，FMT分别上调了29个已知基因并下调了16个已知基因。对差异表达基因的网络分析可以发现，脂多糖（LPS）响应基因（如TLR4、CD14、THEMIS2、TNIP3）是FMT富集网络中的关键基因，而FMT处理下调了包括IFIT1和OASL在内的几个干扰素诱导基因（图5C）。FMT组粘膜与CON组粘膜之间差异表达基因的功能注释显示，受影响最明显的通路与免疫激活和宿主防御机制有关。有趣的是，FMT上调的基因涉及细菌响应途径，而下调的基因涉及病毒响应途径。
图5 宿主肠道粘膜的转录组分析。A代表基于RNA测序的整体差异表达基因的主成分分析；B代表与CON组两两比较的火山图，其中突出强调的点代表差异表达基因；C代表基因互作网络图，其中蓝色代表FMT处理组上调的基因，红色代表FMT处理组下调的基因，圆圈大小代表相互作用数量的多少。
7 系统免疫细胞的特性
最后，我们测量了干预后不久和安乐死时血流中基本免疫细胞亚型的水平，以探究全身免疫的诱导。在实验第3天时，相对于CON组而言，我们发现所有干预组的中性粒细胞计数均略有增加（p值均小于0.05），而单核细胞和总淋巴细胞水平不受影响。而相对于FFTr处理组，FMT中辅助性T细胞（CD4+CD8-）的比例有所增加而初始T细胞比例（CD4- CD8-）有所降低（p值均小于0.05）。但在两天后，这些差异都消失了。
尽管人们对于坏死性小肠结肠炎（NEC）的认知已有几十年的时间，但其仍是当今的一个临床挑战。目前，疾病预防仅限于母乳喂养以及益生菌的使用，而目前益生菌的使用仍缺乏标准建议，有待进一步审查。疑似NEC的治疗包括停止肠内喂养、肠内或肠外抗生素治疗以及对症药物治疗。尽管如此，仍有10%左右的极早产儿会发生NEC，而这些患儿都存在较高的死亡或残疾风险。此外，在疑似感染的早产儿中广泛的使用抗生素与细菌抗生素耐药性的增加相关。以动物为实验模型的研究表明，对于新生儿而言，抗生素以一种微生物依赖的方式扰乱其免疫的发育，并增加继发感染的风险。总体而言，需要更有效且附带影响更小的治疗选择。本研究中，我们旨在探究FFT对于NEC的预防作用，并额外关注其临床前的安全性。基于使用剖腹产早产猪（NEC最具临床相关性的动物模型），我们发现：（1）FFT治疗的原理证明，与FFT直肠给药途径相比，FFT口服途径具有轻微优势；（2）FFT的安全性特征不明显，而同源FMT治疗与一系列不良反应相关。本研究首次提出了使用FFT作为预防NEC的手段，也是首次描述FFT的治疗潜力的研究。一份小型病例报告描述了FFT在复发性艰难梭菌（Clostridioides difficile）感染患者中的成功应用，这是FMT常规使用的唯一患者组。除确保临床缓解外，FFT还改变了每例患者的肠道细菌和病毒组成。最近，来自lean mice（一种实验用小鼠模型）供体的FFT被证明可以改变细菌和病毒肠道菌群，进而减少饮食诱导的肥胖小鼠体重的增加并改善葡萄糖耐受。这些研究均在近端肠道给予FFT，而本研究中我们对胃给药与直肠给药所产生的作用进行了额外的比较，尽管仅存在些许差异，但通过口腔胃肠道给药这种方式在降低病理严重程度方面的作用更优。在我们先前的FMT实验中，胃和直肠联合给药增加了败血症相关死亡率。我们随后发现，在直肠FMT前进行抗生素治疗能够增强NEC的敏感性。在本实验中，无论给药途径如何，在FFT给药期间和给药后均未观察到不良反应，而直肠FMT未能预防NEC，并不利于小肠的结构和功能。这些结果与我们之前FMT直肠给药的研究结果相反，但该研究中的临床数据表明该手术是安全的。但两项实验中使用了完全相同的供体材料，同时采用相同的包括病理学评估在内的研究设计方案。因此，基于现有的数据无法解释直肠FMT临床响应的不一致性。相对于肠腔，粘液层中的噬菌体密度增加，这促使我们研究不同处理对粘膜相关微生物群的影响。尽管所有处理组均含有肠杆菌科（Enterobacteriaceae）作为肠腔微生物菌群的一部分，但我们发现，相对于FFTo，CON和小部分的FMT
动物粘膜
中与NEC相关的细菌科的相对丰度有所增加。而且，粘膜相关细菌的多样性与NEC严重程度呈正相关。由于口服FFT增加了粘膜相关的病毒多样性，FFT的潜在作用机制可能是在粘液层中富集噬菌体，这反过来降低了某些细菌的相对丰度，例如靠近粘膜的肠杆菌科。有趣的是，我们发现口服FFT的动物粘膜中
Microviridae
的相对丰度有所增加。这与最近在成功接受FMT治疗并治愈艰难梭菌感染的人类患者中进行的一项研究结果相一致，在该研究中发现，在FMT治疗前后，变形菌门和Microviridae之间存在负相关关系。但我们不能排除粪便滤液中噬菌体以外的其他物质（如微生物代谢产物或分泌蛋白）同样可能导致目前所观察到的结果的可能性。同样，基于最近以相同方式产生的人粪便滤液的宏基因组评估，我们预期滤液中存在一小部分小细菌，但认为这些细菌的临床意义可忽略不计。一个特殊的发现涉及受体的链球菌和乳杆菌的定植，它们共同构成了供体微生物群的主要部分。虽然在对照动物的肠道中未检测到这些菌属，但链球菌在FFT动物中是第二丰富的菌属，但几乎检测不到乳杆菌的存在。相反，乳杆菌是FMT动物中第二丰富的菌属，而链球菌相对丰度降低，这证实了之前的观察结果。但这是否具有任何临床意义，仍有待观察。将能够感染人类细胞的真核病毒从老年供体个体转移到受损受体的风险是目前在早产儿中使用FFT的一个主要问题和潜在障碍。本研究中，噬菌体（特别是属于有尾噬菌体目的噬菌体）在不同组别和解剖生态位中占主导地位。而丰度第二的病毒无法鉴定，但由于其他5种最丰富的病毒（总计98%相对丰度）均为噬菌体，同时由于噬菌体数据库的覆盖率远低于真核病毒，因此这种无法鉴定的病毒很有可能是未表征的噬菌体。事实上，有尾噬菌体目也是婴儿中在目水平上的主要噬菌体。同样重要的是，相对较少的真核病毒寄居在新生儿以及1月龄婴儿肠道中，但这些真核病毒的相对丰度在4月龄时有所增加。无论如何，我们发现FMT而非FFT增加了许多临床相关哺乳动物病毒（如疱疹病毒科Herpesviridae）的相对丰度。过滤过程能够抑制很大一部分粒径较大的病毒颗粒进入FFT溶液，或FFT后的体内条件阻止这些病毒感染宿主细胞。在任何情况下，这一方面对FFT的临床可行性都具有十分重要的意义。为了增加对肠道微生物定向治疗是如何发挥作用来预防肠道病理的理解，我们对宿主肠道粘膜进行了全面的基因表达分析。该分析是基于在解剖标准化的组织标本中进行，这些标本大部分没有严重的病理学。正是由于病理状态造成的偏倚最小，因此这些结果应被解释为孤立的治疗效果。但值得我们注意的是，相对于CON来说，FFT并没有显著影响基因的表达水平，这表明给药病毒（或小分子）和宿主免疫细胞之间没有发生特殊的相互作用，这意味着FFT只对细菌发挥作用。在无菌条件下，已有的研究表明，噬菌体和宿主之间能够通过TLR9信号进行直接相互作用，但在生理条件下，这种效应的重要性可能可以忽略不计。另一方面，FMT治疗调节粘膜基因表达水平，增加对细菌的免疫响应，同时减少宿主对病毒的响应。具体来说，参与LPS信号通路的一系列基因上调，这表明产生LPS的肠杆菌科细菌参与了FMT相关的副作用。此外，FMT导致了给药后不久的循环辅助性T细胞的短暂诱导。从安全性角度来看，FFT的使用对宿主免疫无附带影响，这使得FFT的应用优于FMT。然而，在抗性更强的个体中，FMT诱导的粘膜免疫可能也具有益处。
综上所述，我们揭示了FFT作为减少早产新生猪NEC的安全有效手段的潜力。由于FFT概念仅在猪种属中得到证实，并且仅使用一批供体粪便材料，因此尚无法得出种属间和个体供体在安全性和有效性方面的普适性结论。无论如何，基于这些发现和独特的潜力，我们鼓励在早产儿中在严格的安全范式下进行FFT的安全性和可行性试验。供体和粪便应接受广泛的筛查，等同于现有的儿科FMT程序，并使用经过验证的技术来去除细菌。
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