导读
土壤微生物对农业生态系统的长期可持续性至关重要。然而，连续的葡萄再植会破坏土壤微生物群落的稳定性。通过高通量测序，我们研究了连续再植葡萄藤5、6、7年（Y5、Y6和Y7；短期）和20年（Y20；长期）的根际土壤中细菌和真菌的丰度、多样性和群落组成。结果表明，Y20中细菌和真菌群落多样性和丰度显著低于其他样品。再植时间和种植年份显著影响细菌和真菌群落组成。短期葡萄藤再植后，根际土壤中潜在有益菌和有害真菌的相对丰度高于长期种植。细菌和真菌群落与有效氮（AN）、有效磷、有效钾（AK）及pH显著相关。AK和AN是与细菌和真菌群落转移相关的主要土壤因子。再植时间显著影响细菌和真菌的共生模式，这表明休耕地的共生网络比其他组更复杂，其中Y20组的复杂性最低。然后，在葡萄藤根际土壤连续再植后分离出优势真菌，并通过盆栽试验证实了3个候选菌株的有害作用。结果表明，真菌孢子悬浮液处理土壤12天显著抑制了葡萄幼苗的生长，而茄病镰刀菌则抑制植物的生长。总的来说，本研究表明茄病镰刀菌可能是一种与葡萄再植病相关的潜在有害真菌。
原名：Responses of soil bacterial and fungal communities to the long-term monoculture of grapevine
译名：土壤细菌和真菌群落对葡萄长期单一栽培的响应
期刊：Applied Microbiology and Biotechnology
IF：4.813
发表时间：2021.9.3
通讯作者：李坤＆郭修武
通讯作者单位：沈阳农业大学园艺学院
不同再植体系下根际化学性质的变化如表1所示。短期连续再植（Y5、Y6和Y7）后，土壤pH波动较小，所有样品pH均呈中性。相比之下，长期连作（Y20）后，土壤pH显著降低（P < 0.05），呈弱酸性。此外，CK组土壤SOM含量最高；然而，Y20组土壤AN、AP和AK含量显著高于其他组（P < 0.05）。
表1. 休耕地和连续葡萄树再植/种植土壤样品的理化性质。
CK：休耕地的土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续再植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植
两次）。数据表示平均值 ± 标准误差（n=3）；不同字母表示5种处理间在P < 0.05水平上差异显著（one-way ANOVA，Tukey's HSD检验）。
为了研究葡萄藤根际微生物群落的多样性和结构，我们对16SrRNA进行了测序。共获得789 621个有效序列，平均长度为280bp。我们总共检测到4865个OTUs；Y20组的OTUs数量低于其他四组（图S1A）。测序覆盖了细菌多样性的很大一部分，因为稀疏曲线趋于平稳（图S2A）。细菌α多样性如表2所示。Y7和Y20组根际Shannon指数与对照组相比显著降低（P < 0.05），Y20组的Simpson指数显著高于其他四组。与其他组相比，Y6组的Chao1和Ace指数显著升高（P < 0.05），但Y20组根际土壤Chao1和Ace指数显著降低（P < 0.05）（表2）。基于Bray-Curtis距离的分层聚类分析表明，来自同一葡萄园（同时收集）的土壤样品中的细菌群落更相似，这是因为它们被划分为五个高度支持的集群。此外，Y5、Y6和Y7组中的细菌群落是聚集的，Y20组的土壤样品与其他组是分离的（图1A）。基于OTUs丰度的加权UniFrac NMDS分析（stress = 0.001）表明，来自Y5、Y6和Y7组的样品高度相似并聚集，与CK和Y20组的样品明显分离（图1B）。这一结果与层次聚类分析的结果相似。
表2. 休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤细菌和真菌群落的α多样性指数。
图1.休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤样品中细菌群落的β多样性。CK：休耕地的土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续再植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植两次）。基于Bray-Curtis距离度量的细菌群落分层聚类结果（A）和基于加权UniFrac距离度量的细菌群落NMDS排序（B）。
根据OTUs的分类关系，葡萄藤根际包括37个细菌门、97个纲、256个目、447个科和808个属。最丰富的细菌门是变形菌门（30.7-53.2%）、拟杆菌门（8.13-23.72%）、放线菌门（10.64-15.33%）、酸杆菌门（5.16-20.16%）、芽单胞菌门（1.36-10.37%）、绿弯菌门（1.2-5.56%）和浮霉菌门（1.03-4.62%），占所有组序列的90%以上。葡萄藤根际以变形菌门为主，占所有序列的30.7-53.2%，其在连续再植/种植土壤中的相对丰度显著高于对照土壤（P < 0.05）（图2）。拟杆菌门在Y5、Y7和Y20组的土壤样品中明显更丰富（P < 0.05）。相比之下，在连作土壤中，酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、浮霉菌门的相对丰度显著下降（P < 0.05）。在属水平鉴定的序列中，检测到76个细菌属，平均相对丰度高于0.3%。CK组中18个属（RB41、Ellin6067、Gemmatimonas、MND1、Haliangium、硝化螺菌属、Gaiella、Reyranella、Flavisolibacter、Candidateus_Solibacter、Phenylobacterium、Opitutus、Pirellula、Ohtakwangia、Polycyclovorans、Gemmatirosa、Lacunisphaera和Chthonomonas）的相对丰度显著高于Y5、Y6、Y7和Y20组（P < 0.05）。相反，在连续再植/种植葡萄园的根际土壤中，两个属（Pedobacter和Mycobacterium）的丰度显著高于CK组（P < 0.05）。Y20组中12个属（Chuaibacter、Rhodanobacter、Granulicella、Acidibacter、Acidipilla、Rhodovastum、Mycobacterium、Bradyrhizobium、Castellaniella、Arachidicoccus、Conexibacter和Actinospica）的相对丰度显著高于其他组（P < 0.05），而Y20组中6个属（Ramlibacter、Arenimonas、Noviherbaspirillum、Subgroup_10、Dongia和Phenylobacterium）的相对丰度显著低于其他组（P < 0.05）（表S1）。在前15个属中，RB41、Ellin6067、芽单胞菌属和MND1的相对丰度显著增加（P < 0.05），而对照组土壤中的Pedobacter的相对丰度显著低于其他组土壤。此外，Y20土壤中Chuaibacter、Rhodanobacter和Granulicella的相对丰度显著高于Y5、Y6和Y7土壤（P < 0.05），而Massia、Ramilibacter、Novosphingobium和Variovorax的相对丰度呈现相反的趋势（图3）。
图2. 不同细菌类群在门水平的相对丰度及其在休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤中的主要变化。占总读长不到1%的门被归为“其他”。CK：休耕地土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续种植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植两次）。
图3. 属水平前15个细菌类群的相对丰度以及休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤样品的主要变化。CK：休耕地的土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续种植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植两次）。误差线代表平均值 ± 标准误差（n=3）。不同字母表示5种处理间在P < 0.05水平上差异显著（one-way ANOVA，Tukey's HSD检验）。
经过质量过滤后，总共从15个土壤样品中获得了923 597个经过验证的真菌序列。我们检测到318个真菌OTUs，Y20组的OTUs数量低于其他四组，与细菌OTUs相似。总体而言，细菌OTUs（1502-3538）的数量是真菌OTUs（113-220；图S1B）的十倍。Venn图分析表明，在土壤OTUs（318）中，22.33%与休耕地土壤和连续再植/种植葡萄园的根际共享。此外，休耕地土壤的OTUs数量最多（46个OTUs），而Y20土壤仅包含7个OTUs（图S1B）。基于OTUs的所有样品稀疏曲线均达到其渐近线，表明本研究中产生的数据足以分析真菌多样性（图S2B）。α多样性分析表明，与对照土壤相比，四个时间序列葡萄园根际土壤的Shannon指数显著降低（P < 0.05）。此外，Y20土壤的Simpson指数显著高于其他土壤（P < 0.05），而Y20土壤中的Ace和Chao1指数显著低于CK和Y6土壤（表2）。基于加权UniFrac距离的分层聚类分析表明，Y5、Y6和Y7组土壤样品中的真菌群落更为相似且聚类，与Y20组中的真菌群落明显分离。此外，连续再植5、6、7和20年的葡萄藤根际真菌群落成簇，与对照土壤明显分离，但CK_1土壤除外，由于重现性差，在计算优势真菌门和属的相对丰度时将其删除（图4A）。基于OTUs丰度的加权UniFrac NMDS分析（stress = 0.062）表明，所有样品分为五类。来自Y5、Y6和Y7组的样品高度相似并聚集，与CK和Y20样品分离（图4B）。这一结果与层次聚类分析的结果相似，表明持续单一栽培显著影响葡萄藤根际真菌群落。
图4. 休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤样品中真菌群落的β多样性。CK：休耕地的土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续种植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植两次）。基于加权UniFrac距离度量的细菌群落分层聚类（A）和基于加权UniFrac距离度量的真菌群落NMDS排序（B）。
对于真菌群落，葡萄藤根际包含10个细菌门，30个纲，70个目，117个科，138个属。在所有样品中，子囊菌门最为丰富（相对丰度为52.33-91.95%），其次是担子菌门（5.95-39.17%）、毛霉菌门（0.93-16.63%）和壶菌门（0.14-2.99%）。Y20组根际子囊菌的相对丰度显著高于其他四组（P < 0.05）。相比之下，Y20组担子菌的相对丰度显著低于Y5、Y6和Y7组（P < 0.05）。此外，与CK组相比，Y5、Y6、Y7和Y20组的毛霉菌门和捕虫霉门的相对丰度显著降低（P < 0.05）（图5；表S2）。在属水平上，共检测到33个真菌属，平均相对丰度高于0.3%。随着连作时间的增加，九个属（Tausonia、Alternaria、Cladosporium、Filobasidium、Boeremia、Sclerotinia、Gelasinospora、Vishniacozyma和Cystofilobasidium）的相对丰度先增加后减少（表S2）。在前15个属中，CK组中毛壳菌属（Chaetomium）、镰刀菌属（Fusarium）和Plectosphaerella的相对丰度显著高于Y5、Y6、Y7和Y20组（P < 0.05）。此外，Cladosporium、Mrakia和Leucosporidium的相对丰度在Y6组中最高，而Alternaria、Filobasidium、Rhodotorula和Sclerotinia的相对丰度在Y5组中最高（图6）。
图5. 不同真菌类群在门水平上的相对丰度以及休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤样品的主要变化。占总读长不到1%的门被归为“其他”。CK：休耕地的土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续种植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植两次）。注意，由于重复性差，样品CK_1被移除。
图6. 属水平前15种真菌类群的相对丰度以及休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤样品的主要变化。CK：休耕地的土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续种植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植两次）。注意，由于重复性差，样品CK_1被移除。误差线代表平均值 ± 标准误差（n=3）。不同字母表示5种处理间在P < 0.05水平上差异显著（one-way ANOVA，Tukey's HSD检验）。
进行CCA以确定每个样品的土壤性质和细菌群落之间的关联。结果表明，土壤性质解释了细菌群落中56.4%的变异，并且 AN（r2= 0.9438，P = 0.002），AP（r2 = 0.7825，P = 0.001），AK（r2 = 0.9687，P = 0.001）和pH（r2 = 0.7761，P = 0.001）与细菌群落显著相关，其中AN和AK（r2 > 0.9）对细菌组成影响更大。Y20组土壤样品的性质与AN、AP和AK呈正相关，与pH呈负相关。相反，Y5、Y6和Y7组的土壤样品性质与AN呈负相关，与AP、AK和pH呈正相关（图S3A；表S3A）。Spearman相关热图显示，在门水平上，变形菌门丰度与AP、AN（P < 0.05）和AK显著正相关，而WS2、纤维杆菌门、Omnitrophicaeota、BRC1、芽单胞菌门、迷踪菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门和疣微菌门的丰度与AN、AP和AK显著负相关。此外，拟杆菌门和放线菌门的丰度与AN和AK呈正相关（P < 0.05），而Rokubacteri和Latescibacter丰度与AN和AK呈负相关（P < 0.01）（图7A）。在属水平上，MND1、Ellin6067和RB41的丰度与AN、AP和AK呈负相关（P < 0.01），而Rhodanobacter、Chuaibacter和Granulicella的丰度与AN、AP和AK呈正相关（P < 0.05）（图S4A）。RDA分析表明真菌群落组成受AN（r2 = 0.9649，P = 0.001），AP（r2 = 0.562，P = 0.003），AK（r2 = 0.8381，P = 0.001）和pH（r2 = 0.7401，P = 0.005）显著影响。RDA的前两个轴解释了真菌群落51.64%的变异。Y20组的土壤样品性质与AN、AP和AK呈正相关，与pH呈负相关，而Y5、Y6和Y7组的土壤样品特性与AN呈负相关，与AP、AK和pH呈正相关（图S3B；表S3B）。Spearman相关热图显示，在门水平上，毛霉门、捕虫霉门、芽枝霉门和壶菌门的丰度与AN和AK呈负相关（P < 0.05）；担子菌门丰度与pH呈正相关（P < 0.05），而子囊菌门丰度与pH呈负相关（P < 0.01）（图7B）。在属水平上，镰刀菌属、Plectosphaerella和Mrakia的丰度与AN和AK呈显著负相关（P < 0.01），而Phymatotrichopsis、Mrakia和Leucosporidium与pH呈正相关（P < 0.01）（图S4B）。
图7. 前50个细菌（A）和真菌门（B）与土壤性质的相关热图。R值用不同的颜色显示在图例右侧。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。
在本研究中，通过OTU水平上的共生网络分析了CK和连续葡萄藤再植/种植土壤中土壤细菌和真菌群落的差异和相互作用（图8）。通过计算网络的拓扑特性来描述由此产生的节点间关系的复杂模式，结果显示不同处理之间存在明显差异（表S4）。总的来说，CK组细菌和真菌群落的节点和边数均显著高于其他组。对于细菌群落而言，节点和边数在CK组的土壤中最高。此外，CK组土壤中的正相关与负相关比率为1。Y5、Y6和Y7组的正相关数量大于负相关数量。相比之下，Y20组的正相关与负相关比率小于1。CK和Y5组土壤中有5个分隔化的细菌模块，Y6和Y7组土壤中有7个分隔化的细菌模块。相反，Y20组的细菌网络只包含3个模块。对于真菌群落而言，网络结构明显比细菌群落简单。此外，CK组的土壤比其他组的土壤显示出更多的节点和边缘。CK组中正相关数量远高于负相关数量。随着连续再植/种植时间的增加，葡萄藤根际正相关与负相关的比例逐渐降低。这些发现表明，与其他组相比，CK组的真菌网络表现出更高的复杂性，Y20组表现出最低的复杂性。
图8. 休耕地和连续葡萄藤再植/种植土壤样品中土壤细菌（A）和真菌（B）的共生网络。CK：休耕地的土壤。Y5、Y6和Y7：分别连续种植葡萄藤5、6和7年的土壤。Y20：连续种植葡萄藤20年的土壤（20年内再植两次）。连接表示强（Spearman’s ρ > 0.6）和显著（P < 0.01）相关性。每个网络的节点根据门进行着色，并根据程度进行大小调整。连接节点的边用绿线表示共现，红线表示互斥。
根据16SrRNA测序数据，应用PICRUST预测不同代谢通路的丰度。较低的最相似序列分类指数值（0.11 ± 0.05）表明预测精度较高。总的来说，预测的通路中显示了两个KEGG直系同源组的46个水平。结果表明，以基本代谢通路为主，包括碳水化合物（13.14% ± 0.14%）、氨基酸（11.69% ± 0.14%）、能量（6.5% ± 0.21%）、辅助因子和维生素（6.05% ± 0.17%）、核苷酸（4.5% ± 0.17%）和脂质代谢（3.79% ± 0.11%）。在这些通路中，与对照组相比，Y5、Y6、Y7和Y20组的能量代谢通路显著降低。此外，预计高比例的基因家族参与膜转运通路（4.78% ± 0.77%）、复制和修复（3.43% ± 0.2%）、翻译（3.76% ± 0.37%）和信号转导（3.84% ± 0.21%）， Y5、Y6和Y7组与膜转运相关的基因丰度显著高于Y20和CK组。此外，Y20组中与复制、修复和翻译相关的基因丰度显著高于Y5和Y7组（图S5）。最后，我们选择了三株在连续再植/种植土壤中分离的真菌菌株，通过盆栽试验进行致病性试验。我们通过结合孢子形态观察和测序，在物种水平上鉴定了三种菌株，即极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）、Cladosporium perangustum和茄病镰刀菌（F. solani）（图S6）。然后，我们用土壤淋洗法测试了这三种真菌的有害影响。结果表明，感染3天后，植株叶片开始出现病斑；随着感染时间的延长，病斑的数量和面积增加。病斑呈棕色或黑色，最终病斑覆盖了大部分叶片。12天后，植株几乎所有叶片都被感染，发生植株死亡。此外，三种真菌菌株的侵染对植物生长有显著的抑制作用；特别是，在茄病镰刀菌感染3天后，幼苗的株高显著低于对照（图S7；表S5）。
土壤微生物群落对宿主营养、发育和免疫至关重要。然而，长期单作会破坏土壤微生态平衡。很少有研究评估连续再植对葡萄藤的影响；因此，探索连续再植对葡萄藤根际的影响可能会产生深刻的结果。在目前的研究中，我们使用16S和18S rRNA扩增子测序来表征不同连续再植/种植时间葡萄藤根际微生物群落的组成。分析表明，经过20年的连续再植/种植，根际土壤中细菌和真菌的丰度和多样性显著降低。平板分离和盆栽试验证实了关键真菌的致病性，并表明茄病镰刀菌能显著抑制葡萄幼苗的生长。
1 葡萄的长期连续再植/种植降低了细菌和真菌的多样性对于α多样性，我们发现长期连续种植葡萄藤会降低根际土壤中细菌和真菌的丰度和多样性。这些发现与其他对不同作物品种的研究一致。在连作系统中，植物根系不断向土壤中分泌相同类型的根系分泌物，这可以促进某些微生物物种在根际定殖；这可能是长期连作后土壤微生物多样性下降的原因之一。特别地，我们观察到，对于β多样性，Y20组中的群落与Y5、Y6和Y7组中的群落显著不同。Y5、Y6和Y7组的细菌和真菌群落聚类，表明连续再植时间影响微生物群落，并且连续再植时间相近的土壤微生物群落结构相关。这些发现与Liu等人的研究结果相似，他们指出，在大豆长期和短期连作体系中土壤细菌和真菌群落存在显著差异。在本研究中，单作显著影响细菌和真菌群落。对于细菌，在前15个属中，Y20组的假单胞杆菌属和黄杆菌属的丰度显著低于Y5、Y6和Y7组（图3）。假单胞菌属是一个被广泛研究的属，是促进植物生长的根际细菌（PGPR），并且已知其能显著抑制尖孢镰刀菌的生长，而尖孢镰刀菌是导致豌豆枯萎病的原因。Kwak等人从极其复杂的番茄根际宏基因组中组装了一种未培养黄杆菌的基因组，该黄杆菌在抗性植物根际中的含量远远高于易感植物。他们的结果表明，这种细菌可以抑制敏感植物中的青枯病的发展。此外，我们注意到，在非优势属中，芽孢杆菌属的相对丰度先有增加的趋势，然后随着再植时间的增加而减少。芽孢杆菌也是一种已被广泛研究的PGPR。Karthika等人从番茄根际土壤中分离到一株蜡样芽孢杆菌（KTMA4）。他们的结果表明，该菌株不仅对番茄病原菌尖孢镰刀菌和番茄早疫病菌具有有效的抑制作用，而且还产生吲哚-3-乙酸和其他促生长因子，以促进离体植物生长。在我们的研究中，在四种连续再植/种植土壤中，Y20组的假单胞菌、芽孢杆菌和黄杆菌丰度最低（表S1）。因此，在葡萄藤长期连续再植/种植后，根际有益细菌的减少可能导致再植疾病。对于真菌，所有处理中的优势属为Tausonia、Alternaria、Cladosporium、毛壳菌属、Filobasidium和镰刀菌属（表S2）。其中，毛壳菌是一种具有生物防治效果的有益真菌，连续种植葡萄藤后毛壳菌含量降低。相反，Alternaria、Cladosporium和镰刀菌是引起几种植物病害的重要植物病原菌。我们采用稀释平板法在再植葡萄园的根际分离并培养了三种优势真菌菌株（极细链格孢菌、C. perangustum和茄病镰刀菌）。极细链格孢菌和C. perangustum都能引起叶斑病，这在许多植物中已被广泛报道；这些真菌主要从叶片中分离出来，并导致叶片中形成深棕色病变。在目前的研究中，我们从土壤中分离出这些真菌，并用分生孢子悬浮液灌溉土壤，由于微生物从土壤通过根部转移到叶子上，导致葡萄藤幼苗叶片上发生病害。先前的报告表明，葡萄藤地上组织中发现的大多数微生物类群起源于土壤，这表明根是葡萄藤定植微生物的主要储库。镰刀菌是被广泛报道的病原真菌；例如，茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌是土壤传播的病原体，并已知会在西瓜、香蕉、花生和番茄植株中引起褐色根腐病和枯萎病。感染这些真菌的植株会变黄枯萎，连作可加重病害。在本研究中，从连续再植/种植葡萄园的根际土壤中分离到茄病镰刀菌，盆栽试验表明，经茄病镰刀菌孢子悬浮液处理后，葡萄叶脉变为灰棕色和黄色，植株高度显著降低。因此，本研究中测试的三种真菌菌株（即极细交链孢菌、C. perangustum和茄病镰刀菌）在葡萄幼苗中表现出致病性，其中茄病镰刀菌表现出最严重的影响。在我们的研究中，葡萄藤短期连续再植后根际潜在有益细菌（如Pseudomonas sp.、Flavobacterium sp.和Bacillus sp.）和病原真菌（Alternaria sp.、Cladosporium sp.和Fusarium sp.）的相对丰度高于长期连续再植后的相对丰度。据报道，草莓和甘薯连作后，根际植物病原菌镰刀菌、黄萎病菌和炭疽菌的相对丰度随着连作时间的增加先降低后升高，而在我们的研究中，一些潜在的植物病原菌（Alternaria、Cladosporium和Fusarium）的相对丰度并没有随着连作时间的延长而持续增加。这一发现可能与某些有益微生物丰度的变化有关。研究表明，植物可以通过募集保护性微生物来抑制植物病原体，从而保护其他植物免受侵染。例如，拟南芥可以通过改变植物渗出模式来招募有益的根际群落以响应病原体暴露，从而有益于植物后代。Liu等人发现，长期连续种植13年的大豆会增加潜在有益细菌慢生根瘤菌和芽单胞菌以及真菌被孢霉菌和拟青霉菌的相对丰度。然而，与短期连作3年或5年相比，病原真菌镰刀菌的相对丰度在长期连作后有所下降。此外，与我们的研究结果一致，由小麦全蚀病菌引起的一种严重的小麦根系疾病在小麦单作和严重爆发几年后自发减少，它与产生抗真菌化合物2,4-二乙酰间苯三酚（DAPG）的拮抗荧光假单胞菌的积累有关。我们推测，在短期连续再植条件下，植物可能通过调节机制募集有益细菌与病原微生物群竞争。植物生长状况和连作障碍取决于病原菌和有益微生物之间的竞争。此外，我们使用基于KEGG数据库的PICRUSt预测了细菌不同代谢通路的丰度。总的来说，连续再植/种植葡萄根际土壤中能量代谢相关基因的相对丰度低于对照土壤（图5S）。土壤微生物的能量代谢，特别是矿质养分代谢，对植物生长至关重要。此外，参与碳循环的通路基因对于参与碳循环的微生物的高能量需求是必需的。土壤中缺乏AN会限制植物生长。我们观察到，与短期连作相比，长期连作（Y20）后葡萄藤根际氮代谢相关基因的丰度降低。并且在单作葡萄藤根际，参与碳固定通路的基因丰度降低（图S8）。土壤化学性质与土壤微生物群落结构和植物生长密切相关；长期连作导致土壤化学性质恶化，土壤养分含量失衡，植物产量下降。我们的结果表明，葡萄的连续再植/种植显著影响土壤化学性质。例如，长期连续种植20年后，根际pH值显著降低。先前的研究表明，降低土壤pH值可以改变土壤养分的有效性，干扰根系对NO3-、NH4+、H2PO4-、SO42-等养分的吸收，进而影响植物的正常发育。SOM对土壤生态至关重要，可为植物和微生物提供养分。在本研究中，葡萄藤根际SOM含量在连续再植/种植后显著低于CK组。Chen等人的结果表明，连作25年后，烟草根际SOM含量显著低于烟草-玉米轮作土壤。然而，在本研究中，连续再植/种植葡萄的根际有效养分（AN、AP和AK）显著高于CK组，尤其是在长期连作后。这些发现与Liu等人的结果一致。他们发现，大豆长期连作13年后，土壤pH、有效氮、有效磷和有效钾（即AN、AP和AK）含量显著高于短期连作3或5年后。一般情况下，长期连续再植后，土壤养分没有明显减少，表明土壤养分可能不会直接导致再植病害。
总之，本研究发现连续再植时间和种植年份会影响微生物群落结构，长期和短期再植之间存在显著差异。长期种植葡萄后，根际土壤中细菌和真菌的多样性较低。此外，短期连续再植后，潜在的植物病原真菌和有益细菌表现出协同增加的趋势。相反，在长期连续种植后这两种微生物数量都有所减少，这表明这两种微生物之间存在权衡。此外，Y20中细菌和真菌共生网络的复杂性最低。随着种植时间的延长，微生物群落的相关性逐渐由正转负。基于上述结果，我们推测再植后植物的生长可能取决于致病微生物和有益微生物之间的竞争。然而，致病菌和有益菌是否以及如何相互作用还需要进一步的研究。
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