硫化氢通过Nrf2信号通路对新生鼠缺氧缺血性脑病的影响

1四川大学华西第二医院麻醉科，成都 610041；2出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，成都 610041；3天津医科大学总医院麻醉科 300052；4天津市麻醉研究所 300052

国家自然科学基金（81601667）

【论著】

本研究拟探讨H2S是否对新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）发挥保护作用，其机制是否与核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）信号通路有关，旨在为新生儿HIE的诊治提供新的思路。

36只7日龄C57BL野生型（WT）小鼠和36只7日龄Nrf2基因敲除（KO）小鼠分别按随机数字表法分为野生型对照组（WT‑Con组）、Nrf2基因敲除对照组（KO‑Con组）、野生型模型组（WT‑HI组）、Nrf2基因敲除模型组（KO‑HI组）、野生型模型+NaHS组（WT‑NaHS组）和Nrf2基因敲除模型+NaHS组（KO‑NaHS组），每组12只。

结扎一侧颈总动脉后缺氧环境中处理2 h复制小鼠HIE模型，腹腔注射3 mg/kg NaHS干预。缺氧缺血（HI）后24 h，收集小鼠全脑组织，应用H‑E染色检测神经元损伤情况，JC‑1法检测线粒体膜电位（MMP），酶标仪检测活性氧（ROS）释放，Clark氧电极检测呼吸率（R3/R4），生物发光法检测ATP含量，Western blot检测B淋巴细胞瘤‑2蛋白（Bcl‑2）、Bcl‑2相关X蛋白（Bax）、血红素氧合酶（HO）‑1、硫氧还蛋白（Trx）‑1、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）、Nrf2和组蛋白（Histone）3。分别在HI后4周和6周，应用Y迷宫检测小鼠学习记忆能力。

2.1　各组小鼠脑组织损伤情况比较

与WT‑Con组比较，WT‑HI组小鼠海马组织神经元排列紊乱，神经细胞稀疏，排列不清楚，神经元出现变性坏死，核仁溶解消失，甚至出现神经细胞消失后遗留的“空穴”，海马CA1区存活神经元减少（P<0.05）；与WT‑HI组比较，WT‑NaHS组存活神经元增加（P<0.05）。与KO‑Con组比较，KO‑HI组存活神经元减少（P<0.05）。与WT‑NaHS组比较，KO‑NaHS组存活神经元明显减少（57.9±9.3比35.9±8.9，P<0.05）。见图1。

2.2　各组小鼠凋亡和Nrf2信号通路蛋白检测比较

Western blot检测结果显示：与WT‑Con组比较，WT‑HI组小鼠Bax表达增加，Bcl‑2表达减少，Nrf2、HO‑1和Trx‑1表达增加（P<0.05）；与WT‑HI组比较，WT‑NaHS组小鼠Bax表达减少，Bcl‑2表达增加，Nrf2、HO‑1和Trx‑1表达进一步增加（P<0.05）；与KO‑Con组比较，KO‑HI组小鼠Bax表达增加（P<0.05），Bcl‑2、Nrf2、HO‑1和Trx‑1差异无统计学意义（P>0.05）;与WT‑NaHS组比较，KO‑NaHS组Bax表达增加，Bcl‑2、Nrf2、HO‑1和Trx表达明显减少（P<0.05）。见图2。

2.3　各组小鼠线粒体功能比较

与WT‑Con组比较，WT‑HI组小鼠MMP降低、ROS增加、R3/R4和ATP降低（P<0.05）；与WT‑HI组比较，WT‑NaHS组小鼠MMP、R3/R4和ATP升高，ROS减少（P<0.05）。与KO‑Con组比较，KO‑HI组小鼠MMP、R3/R4和ATP降低，ROS增加（P<0.05）。与WT‑NaHS组比较，KO‑NaHS组小鼠MMP、R3/R4和ATP降低，ROS增加（P<0.05）。见图3。

2.4　各组小鼠行为学比较

与WT‑Con组比较，WT‑HI组小鼠交替次数百分比和新异臂停留时间减少（P<0.05）；与WT‑HI组比较，WT‑NaHS组小鼠小鼠交替次数百分比和新异臂停留时间增加（P<0.05）。与WT‑NaHS组比较，KO‑NaHS组小鼠交替次数百分比和新异臂停留时间减少（P<0.05）。见图4。

最近的研究表明，硫化氢可通过调节磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/Nrf2途径来防止脑外伤引起的细胞损伤。本研究的结果与上述理论基本一致，NaHS可以减轻新生儿HI引起的脑组织损伤、学习记忆能力损伤和细胞凋亡，不仅如此，还可以通过减轻线粒体功能障碍发挥对脑损伤的保护作用。

本研究发现：NaHS可以调控Nrf2信号通路的激活，增加其下游分子HO‑1、Trx‑1的表达；当Nrf2缺失时，NaHS不能发挥对脑组织损伤、学习记忆能力损害和细胞凋亡的正向调控作用。这些结果提示Nrf2在神经细胞存活和功能方面发挥重要的调节作用，而且NaHS是通过Nrf2信号通路发挥对神经细胞存活和功能的保护作用。

缺血性损伤引起的线粒体功能障碍会导致原发性能量衰竭并引发一系列自我延续的病理事件，最终导致神经元变性和凋亡（部分原因是ROS的过度产生）。在这些有害的形态变化之后，线粒体功能恶化，其特征在于MMP下降和ATP合成缺陷。本研究也观察到上述变化，HI后线粒体功能障碍，MMP降低，呼吸率下降，ROS释放增加，ATP产生减少；NaHS处理后线粒体功能受损减轻，且在Nrf2存在的情况下，NaHS才能正常发挥对线粒体功能的调控作用。

综上所述，HI导致小鼠学习记忆功能损伤，神经元损伤、凋亡，线粒体功能障碍，Nrf2信号通路激活；NaHS通过Nrf2信号通路发挥对HI导致的学习记忆和神经元存活的调控作用。本研究为新生儿HIE治疗提供了理论基础。