编译：微科盟北岸，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
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导读
越来越多的研究表明，气候变暖也会影响动物的肠道微生物群（改变群落结构并减少其多样性），可能会进一步影响宿主的健康。因此，本研究基于两个时间点（驯化80天和330天），通过对实验室大鲵（Andrias davidianus）幼体在不同生活水温下（5、15和25℃）胃和肠道（整个肠道：从前肠到泄殖腔）微生物组的分析，探讨了大鲵在不同生活水温下的生理生化特征。在两个采样时间点，研究人员研究了温度对胃肠道微生物群落组成的潜在影响。研究人员发现取样时间、温度或类型（胃和肠道）对大鲵的胃肠道微生物群落的Shannon指数有显著的交互作用。在同一时间点，同一类型样品（胃或肠道）在各温度组的Shannon指数均有显著差异。总样本中有10%的微生物群落变异可以用温度来解释。与5℃组和15℃组相比，25℃组的胃和肠道微生物群在两个采样时间之间表现出最高的相似性。此外，与其他温度处理相比，25℃处理的大鲵显示出最高的食物摄入量和体重。第330天时间点，随着温度的升高，胃肠道微生物中厚壁菌门的丰度显著增加，这可能是由于宿主代谢和食物摄入量增加造成的。因此，研究人员推测高环境温度可能间接影响胃肠道微生物组多样性。
原名：Environmental Temperatures Affect the Gastrointestinal Microbes of the Chinese Giant Salamander
译名：环境温度对中国大鲵胃肠道微生物的影响
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：5.640
发表时间：2021.3.19
通讯作者：朱立峰＆江建平
通讯作者单位：南京师范大学生命科学学院；中科院成都生物研究所
在该研究中，我们获得了63个体的47个样本的测序数据（测序范围为：30 622-57 960）。第80天，每个温度处理组分别在胃和肠道中收集3个样本。在第330天，研究人员成功地从13个胃样本（5℃：1个样品，15℃：六个样品，25 ℃：六个样品）和16个肠道样本中（5℃：六个样品，15℃：四个样品，25 ℃：六个样品）获得了序列。总OTUs（可执行的分类操作单位）数量为1676。经过稀疏处理（每个样本28 202条序列），最终获得1 517个OTUs。
中国大鲵的胃微生物组主要包括变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。中国大鲵的肠道微生物群主要包括厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）和拟杆菌门（图1）。在第80天的胃样本中，Cyanobacteria的相对丰度在5℃组中显著富集，梭杆菌门的相对丰度在15℃组中显著富集，Armatimonadetes的相对丰度在25℃组中显著富集（图1）。在驯化后80天的肠道样本中（第80天），随着环境温度的升高，许多菌门的相对丰度降低。例如，Cyanobacteria、变形菌门、Planctomycetes、放线菌门（Actinobacteria）和Chloroflexi，这些菌门在
5℃
组中显著富集（图1）。在驯化后330天的胃样本中（第330天），25℃组中许多菌门（包括厚壁菌门、Cyanobacteria、Planctomycetes、放线菌门和Tenericutes）的相对丰度都有所增加（图1）。研究人员没有比较5℃组，因为这组只有一个样本。在第330天的肠道样本中，变形菌门、Cyanobacteria和梭杆菌门的相对丰度显著富集于5℃组，四个菌门（包括厚壁菌门、Verrucomicrobia、放线菌门和Tenericutes）的相对丰度显著富集于25℃组（图1）。此外，基于LEfSe分析各组间微生物组相对丰度的显著差异，研究人员估计了微生物组（属水平）随温度变化的四种趋势。首先，研究人员估计了某些菌属的相对丰度随气温升高而降低的趋势。在胃和肠道微生物群中发现了两种共有的菌属：Limnohabitans（胃：13.661% - 0.745%；肠：0.281% - 0.027%）和Methyloparacoccus（胃：1.125% -0.074%；肠：0.233% - 0.006%）。在第80天的肠道样本中，Eubacterium的相对丰度急剧下降。在第二次采样期间，在胃和肠道样本之间未发现共有的菌属。其次，随着气温的升高，某些菌属的相对丰度呈增加趋势。在胃和肠道微生物群中只发现了一个共有的菌属：Paraclostridium（胃：0.008% - 0.113%；肠：0.038% - 0.641%）。第80天胃样本中Aeromonas的相对丰度（0.015% - 37.690%）急剧增加。在第二次采样期间，在胃和肠道样本之间发现了10个常见菌属，即Akkermansia、Alistipes、 Clostridium sensu stricto 1、Dielma、Hydrogenoanaerobacterium、Intestinibacter、Intestinimonas、Oscillibacter、Peptococcus和Ruminococcaceae UCG-014。第三，我们观察到一些菌属的相对丰度随着温度的升高呈凸趋势。在胃和肠道样本中没有发现共有的菌属。Flavobacterium（5℃：1.550%，15℃：37.516%，
25℃
：1.471%）和Cetobacterium（5℃：29.057%，15℃：46.935%，
25℃
：0.024%）的相对丰度在15℃胃样本中最高。最后，随着温度的升高，部分属的相对丰度呈凹趋势。在第80天的胃标本中，Aquabacterium的相对丰度在15℃时最低（5℃：0.307%，15℃：0.124%，25℃：7.823%）。第80天，肠道中有1个菌属（Caproiciproducens）呈凹陷趋势。在第二次采样期间，在胃和肠道样本之间只发现一个共有的菌属（Parabacteroides）。
图1 不同温度下大鲵胃和肠道微生物在门分类水平的平均相对丰度。Sto，胃样本；Day 80，驯化80天；Day 300，驯化330天；Others，为其他相对丰度较低菌门的总和。
采用Shannon指数评价胃肠道微生物群落的α多样性（图2）。在大鲵的胃肠道微生物群中，研究人员发现采样时间和温度，或类型（胃和肠道）对Shannon指数有显著的交互作用（一般线性模型，p < 0.0001，表1）。单因素方差分析结果显示，除330天胃样品外，在每个采样时间，各温度组的同一样品类型的Shannon指数均有显著差异（图2）。因为在5℃组中只成功获得了一个样本的16S数据。因此，我们没有进行单因素方差分析，而是在第330天（胃样本）比较15℃和25℃组的平均值。在肠道微生物组中，5
℃
组在第80天的多样性最高，25℃组在第330天的多样性最高。从5
℃
到15℃组，胃样本微生物群落α多样性的趋势是相似的，但是两个采样时间点在15
℃
到25℃组之间相反（图2A）。在这里，必须要考虑到，5℃组只有一个样本。在肠道微生物组中，温度5℃组的多样性在第80天最高，但在温度5
℃
至15
℃
时下降，然后在温度25℃时基本保持稳定。相反，在第330天，25
℃
组的多样性最高，但呈不断增加的趋势。因此，在肠道中观察到的趋势从5
℃
到15℃组是相反的，但在两个生长阶段从15℃到25℃是相似的（图2B）。
图2 不同环境温度下胃肠道微生物群的alpha多样性。（A）胃样本中的Shannon指数。（B）肠样本中的Shannon指数。采用单因素方差分析检验同一样本类型内各温度组在每个采样时间的显著差异。如果有显著性差异，则进行post hoc检验（Bonferron校正：显著差异是0.05（*））用于同一样本类型内各温度组别之间的两两比较。由于在330天只有一个5℃组的胃样本成功获得了16S数据，所以研究人员没有将该样本纳入统计分析。
表1 采样时间（第80天和第330天）、类型（胃和肠道）、温度及其相互作用对胃肠道微生物群落Shannon指数的影响。
基于Adonis方法和未加权Unifrac距离的PCoA聚类显示，采样时间（第80天和第330天）、样本类型（类型：两组，胃和肠道，图3）和温度（三组：5℃、15℃和25℃，表2，permutation = 999，p = 0.001）对微生物群落有显著影响，以及它们之间的相互作用（表2，permutation = 999，p = 0.001）。例如，10%的变异（R2 = 0.101）可以单独用温度解释。在每种类型的微生物群落中，采样时间和温度对微生物群落均有显著影响（表2，permutation = 999，p = 0.001），温度解释的变异分别约为16%和20%。由温度解释的变异率分别为39%和33%。此外，在胃样本首次取样时间点，温度的影响解释了45.1%的变异。这些结果表明，除采样时间和采样类型外，温度对微生物群落还有潜在的影响。未加权Unifrac距离最大的组为5℃和25℃组（图3B），说明随着温度的升高，微生物群落的差异性越来越大。通过比较同一类型微生物组在相同温度下的第一次和第二次采样时间内的距离，研究人员发现距离随着温度的升高而减小，说明微生物组在高温下是相对稳定的。单因素方差分析显示同一样本类型的两两比较距离存在显著差异（表2；胃：F = 40.450，p < 0.0001；肠：F = 353.522，p < 0.0001）。例如，在25℃时，第一次和第二次采样时间的胃和肠道样本的差异性显著低于5℃或15℃（图3C）。
图3 组间Beta多样性的结果。（A）使用所有样本之间的Bray-Curtis距离（每个点代表一个样本）进行NMDS（非度量多维尺度）分析。图中的数字代表温度的度数。每个组由Convex Hull生成。（B）各组间各采样时间内不同温度下的胃和肠道微生物组两两比较。（C）同一温度下胃和肠道菌群中第一次和第二次取样时间的两两比较。采用单因素方差分析检验同一样本类型的两两比较距离是否存在显著性差异。如果有意义，则进行post hoc检验进行两两比较（Bonferron校正：显著差异是0.05（*）。
表2 使用Adonis分析组间未加权Unifrac距离。
Adonis：在不同的变异源之间划分一个距离矩阵，以描述一个分类或连续变量在决定距离变异时的强度和重要性。这里的变量包括采样时间、类型和温度。（1）所有样本：47个样本全部用于分析。（2）Stomach：只使用胃的样本进行分析。（3）Gut：只有肠道样本用于分析。热驯化显著影响大鲵幼体的体重和体长，温度越高的幼体生长速度越快（F2,191 = 41.142，p < 0.001，双因素方差分析）。进一步的简单效应分析表明，三组间体重和身长的显著差异仅在第330天出现，而在第19天和第80天没有出现（阈值p < 0.05）。在第330天，25℃和15℃组的体重分别是5℃组的3倍和2倍。体长差异较小，25℃和15℃幼体的体长分别是5℃个体的1.5倍和1.3倍。温度和体长对幼体体重有显著的交互作用（F2,191 = 62.79，p < 0.001，ANOCOVA与长度作为协变量）表明组间的体重-长度关系不同。25℃组的大鲵在体重-长度关系上倾向于比其他两组有更大的斜率（阈值p < 0.05，LSD post hoc测试），这表明25℃拥有更大的体型。与生长速率的结果一致，我们观察到摄食量（重复测量的混合效果模型，F2,53 = 39.242，p < 0.001）和摄取率（摄食量/饲粮总量；F2,53 = 13.441，p < 0.001）的显著差异。25℃组的大鲵的食物摄食量和摄取率最高（pairwise LSD 检测, p < 0.05）。
先前的研究发现，随着温度的升高，几种动物肠道微生物群落的α多样性降低（例如，陆生成年蝾螈、蜥蜴、母鸡和小鼠）。然而，一些研究并没有发现随着温度的升高α多样性有显著的差异（例如，蝌蚪肠道微生物组和奶牛瘤胃微生物组）。在该研究第80天，随着温度的升高，胃和肠道微生物群落的α多样性均呈下降趋势。在第330天，情况在某种程度上正好相反。此外，在两次采样时间之间，胃和肠道微生物群发生变化的可能性不仅是生长，还包括饮食的变化（从吃蠕虫到吃鱼）。饮食是影响肠道微生物群落的重要环境因素之一。因此，在这里，研究人员关注的是每个采样时间内微生物组的变化。
在两个采样时间内，环境温度影响了胃和肠道微生物群落。在每个采样时间，环境温度解释了组内胃和肠道微生物群的高百分比变异。在5
℃
组和25℃组之间的微生物群落中发现了大多数差异。有趣的是，与5℃组和15℃组相比，25℃组在两个采样时间内的微生物群落（胃和肠道）显示出最高的相似性。5℃组的微生物群落差异最大。这一发现表明高温压力可能导致微生物组在生长过程中相对稳定。但由于采集胃和肠道内容物的方法是有创的，所以这两次采样的个体并不相同。环境温度扰乱了动物的微生物群落。然而，从长期来看，随着宿主的发育，高环境温度可能成为维持微生物组相对稳定的主要选择压力。高环境温度可能通过胃肠道微生物组群长期影响动物的生长。关于几种动物肠道微生物群随温度升高的变化，有一些共识：厚壁菌门的相对丰度增加，变形菌门的相对丰度降低。在第330天，研究人员发现随着温度的升高，厚壁菌门的相对丰度显著增加，厚壁菌门与拟杆菌门也随着温度的升高而增加，尤其是在肠道微生物群中。在现阶段胃和肠道微生物群之间的这十个常见属中，大部分来自厚壁菌门，如Clostridium sensu stricto 1
、
Dielma、Hydrogenoanaerobacterium、Intestinibacter、Intestinimonas、Oscillibacter、Peptococcus和Ruminococcaceae UCG-014。在人类和小鼠肠道菌群中，作为能量来源，厚壁菌门比拟杆菌门更有效，从而促进热量的吸收和营养物质的运输，并导致体重增加。在这项温度研究中，最初每天，大鲵的幼体都被喂食过量商业活赤虫。驯化254天后，每2天喂一次新鲜鱼。研究人员比较了活赤虫和鱼类能量组成；后者含有丰富的蛋白质和脂质。因此，鉴于厚壁菌与蛋白质和脂肪的消化率高度相关，研究人员推测，在第330天，随着温度的升高，胃肠道微生物群中厚壁菌的相对丰度显著增加，可能与较高的食物摄入和摄入率有关，导致大鲵的体重和身长显著增加。在这里，研究人员不得不提到，高温导致宿主代谢和食物消耗增加，这可能会导致肠道菌群的营养水平升高以及肠道菌群的变化。因此，此研究表明可能是温度升高对肠道微生物群产生了间接影响，但它确实使微生物群的变化成为一种次级影响，而不是直接反应。需要指出的是，该研究使用的驯化温度梯度（5℃、15
℃
和25℃）是基于四川省洪雅县人工种群的孵化温度（15.18 ± 1.14℃）。这些幼体喜欢10-15℃的温度（未公布的数据）。事实上，圈养的大鲵幼虫的最佳温度可能会随着品种和繁殖条件的不同而不同。例如，以前的研究报告发现在20℃下繁殖的大鲵个体适合在20-24℃生长。本研究有一定的局限性：首先，研究人员在温度处理前没有样本，我们也不知道这些群体的微生物群落基线。其次，由于在这项研究中使用了侵入性遗传方法，研究人员无法跨时间跟踪个体。因此，个体之间的差异也会导致微生物组组成的差异。在这类研究中，最好的方法是使用非侵入性遗传方法来跟踪不同温度处理下每个个体的微生物组组成。该研究通过对实验室大鲵幼体胃肠道微生物群落的分析，揭示了环境温度可能对微生物群落有间接影响。随着温度的升高，胃肠道微生物中厚壁菌门相对丰度的显著增加可能与宿主代谢和食物消耗的显著增加有关。在宿主发育过程中，较高的环境温度可能作为一种选择压力来维持微生物组的相对稳定性，但研究人员没有发现环境温度如何直接影响肠道微生物群的证据。
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