时隔两年,刘如谦大大提高先导编辑效率,有望解决89%的遗传病

2021
10/07

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生物世界
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宇宙无垠,生命的可能无穷无尽。在神话故事中,无论是女娲造人,还是上帝创生,都是由一个高等的存在去创造出自然生命。

宇宙无垠,生命的可能无穷无尽。在神话故事中,无论是女娲造人,还是上帝创生,都是由一个高等的存在去创造出自然生命。有趣的是,随着人类对遗传进化的认知发展,如今科学家们也逐渐可以操控并更改一个生物的基因组,创造出特殊的“人造生物”。

无论是生命科学还是医学领域,对生命系统基因组进行有针对性的改变的能力无疑是至关重要的。因此,科学界一直致力于开发新型基因编辑工具,不断提高基因编辑的效率和精确度,使其功能愈渐完善。

2019年10月21日,麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所刘如谦(David R. Liu)教授在 Nature 发表论文【1】,开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑(Prime Editor,PE),无需依赖DNA模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换,而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除(最多插入44个碱基,或删除80个碱基)。该工具“原则上可以修复75000种已知致病性人类遗传变异的89%”。

Nature 杂志评论这一技术是“超精确的新型基因编辑工具”, Science 杂志评论它是“超越CRISPR”的重大突破,哈佛大学教授,CRISPR先驱乔治·丘奇(George Church)盛赞这一成果:“朝着正确方向迈出的一大步”。

此后的两年时间里,全世界各地数百个实验室纷纷证实了先导编辑的强大性,刘如谦也围绕该技术创建了新公司 Prime Medicine ,并于2021年7月13日完成3.15亿美元的融资。

两年后的2021年10月4日,刘如谦团队再度带来重要突破,大大提高了先导编辑的效率,为这一新型基因编辑技术的临床应用扫除障碍

该研究以:Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency 为题,发表在了 Nature Biotechnology 期刊上【2】。

该研究发现,先导编辑(Prime Editor,PE)系统的引导RNA——pegRNA的3'区域的降解会破坏PE系统的活性,从而阻碍基因编辑效率。研究团队对此区域进行了优化,开发出工程化的pegRNA,即epegRNA将PE系统的编辑效率提高了3-4倍,且没有增加脱靶编辑活性。

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DNA双链断裂(DSB)介导的DNA编辑策略,如ZFN、TALEN以及CRISPR技术,可以通过诱导靶位点的插入或删除而有效地破坏基因。但有时候,DNA双链断裂也会造成一些不良的后果,包括预料之外的编辑结果、DNA重排、染色体碎裂等等。

先导编辑(Prime Editor,PE)可以在不引入DNA双链断裂和供体DNA模板的前提下,有效实现所有12种单碱基的自由转换,而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除

先导编辑(Prime Editor,PE)系统由两部分组成:一个含有DNA切口酶(nickase)和工程逆转录酶(RT)的融合蛋白;另一个是PE引导RNA——pegRNA。pegRNA包含一个指定目标位点的间隔体(spacer),一个单引导RNA(sgRNA)支架和一个编码所需编辑的3'端扩展。

该3'端扩展包含一个引物结合位点(PBS),它是互补的一部分DNA原间隔和一个RT模板,编码所需的编辑和下游基因组序列。PE系统与靶位点结合后,将含有PAM序列的DNA链切出,切出的DNA链碱基对与pegRNA中的PBS结合,从而将反转录的编辑序列直接引到靶DNA位点。新合成的编辑DNA的3'端随后通过细胞DNA修复途径分解,最终在目标位置进行所需的编辑。

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PE系统工作示意图

PE系统的多功能性来自pegRNA的3'端扩展能力,以编码广泛的DNA序列。然而,尽管PE系统具有多功能性,但目前它的效率在不同的目标位点和细胞类型之间有很大的差异。

在这项研究中,研究团队对PE系统在不同细胞中的编辑效率差异进行了调查。基于pegRNA的3'端延伸暴露在细胞中(未被融合蛋白包裹),研究团队猜测pegRNA的3'端延伸的降解是导致编辑效率降低的罪魁祸首。

为了验证这一假设,研究小组观察了全长pegRNA和截短的pegRNA在细胞中的差异。pegRNA的3'端区域包含逆转录酶模板和引物结合位点,3'端截短的pegRNA能够竞争目标基因组点,阻止全长pegRNA的结合,从而阻碍PE系统的编辑效率。

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不同pegRNA的编辑效率

在确认降解的pegRNA是先导编辑的有效抑制剂之后,研究团队转向研究如何最小化pegRNA的降解。基于细胞中5'或3'端RNA结构可以增强mRNA的稳定性,研究人员对pegRNA的3'端区域进行了结构优化——在pegRNAs的3'端添加结构RNA基序生成epegRNA,大大地减少了pegRNA的降解。

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通过在pegRNA的3'端添加结构RNA基序,可以提高PE系统的编辑效率

为了确保这种工程化的pegRNA不会影响PE系统的运作,研究人员针对HEK293T细胞的7个不同基因组位点中编码了各种点突变或删除,结果表明epegRNA不但将PE系统的编辑效率提高了3-4倍,而且没有增加脱靶编辑活性。

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通过使用epegRNA,提高了PE系统介导的治疗相关基因组编辑效率

本研究的第一作者 James W. Nelson 博士表示:“我们建议所有做先导编辑的实验室都使用epegRNA。更重要的是,当使用该系统时,应当测试许多包括各种引物结合位点(PBS)和逆转录酶(RT)模板序列和长度的epegRNA,以提高基因编辑的效率。”

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关键词:
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