科研 | SBB：利用代谢组学量化土壤微生物功能变化对肥料氮供应和极端干旱的响应

2021-10-06 14:37

人们预测气候变化将增加世界许多地区干旱的频率和严重程度。

编译：微科盟pBE，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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导读

人们预测气候变化将增加世界许多地区干旱的频率和严重程度。这些极端事件可能会给土壤健康带来负面影响。因此，了解干旱对土壤功能和土壤相关生态系统服务提供的影响非常重要。本研究采用新的代谢分析方法（即复合脂质和非靶向初级代谢物）旨在评估极端水分胁迫条件下微生物群落的恢复力和生理状态的变化。此外，本文还利用磷脂脂肪酸（PLFA）图谱分析来确定微生物群落结构的变化。土壤样品是在自然极端干旱期间和干旱后在0或300 kg N ha⁻¹ yr⁻¹的条件下种植羊茅黑麦草Festulolium（cv. AberNiche）和黑麦草Lolium perenne L.（cv. AberEcho）的草地地块收集的。这些地块在干旱期开始时被分割，整个干旱期以50 mm/周的速率用水灌溉一半子地块以缓解水分胁迫。PLFA分析揭示了干旱和干旱后条件下主要是由氮负荷和水分亏缺驱动微生物群落的明显变化。复合脂质分析鉴定出239种化合物，初级代谢物的非靶向分析确定了155种化合物。土壤复合脂质和初级代谢物在干旱条件下发生显著变化。此外，灌溉“对照”地块在采样期间具有显著更高的累积温室气体（CO₂和N₂O）通量。干旱后微生物脂质组和代谢组迅速（在几天内）恢复到对照地块水平。本研究中显示，土壤初级代谢组和脂质组浓度的显著变化表明，虽然土壤代谢受到水分胁迫的强烈影响，但该系统（植物和土壤）对严重干旱具有很强的恢复能力。

论文ID

原名：Use of metabolomics to quantify changes in soil microbial function in response to fertiliser nitrogen supply and extreme drought

译名：利用代谢组学量化土壤微生物功能变化对肥料氮供应和极端干旱的响应

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：7.609

发表时间：2021.7.2

通讯作者：Robert W. Brown

通讯作者单位：英国班戈大学自然科学学院

实验设计

结果

1 干旱和氮肥对复合脂质的影响

复合脂质分析初步确定了共239种化合物。在检测到的这些化合物中，134种显示出处理之间的统计学显著差异（p < 0.03）。在复合脂质数据中有三个响应组（图2）：i）在干旱条件下，对照地块和干旱地块中相对浓度降低的化合物（响应A；n = 26），ii）干旱条件下仅在干旱地块中相对浓度增加的化合物（响应B；n = 9），iii）跨处理没有明确响应的其他化合物（响应C；n = 15）。总体上，PERMANOVA结果表明，水分胁迫（p < 0.001）和氮负荷（p < 0.001）对土壤脂质浓度有显著影响，而草种（p = 0.1）对土壤脂质模式总体上没有影响。

图1. 2018年仲春至仲夏实验站点的宏数据。A .日降水量（24 h内每小时降水量之和）。B.每日表层土壤温度（24小时内每小时土壤温度的平均值）。C.日二氧化碳通量，误差棒代表±SEM（n = 6）。D.土壤湿度。黑线代表从未灌溉的邻近田间试验到土壤取样开始的每日（Acclima）传感器数据（10 cm深），灰色虚线表示对照地块灌溉的开始和结束。

图2. 干旱、氮肥和草种对土壤脂质的影响。热图显示了土壤处理组（n = 8）的表达谱，基于由方差分析p值分类的50种最显著的初步鉴定的脂质（p < 0.03）。使用Euclidean距离和Ward连接对脂质进行聚类。使用对数变换和Pareto标度对数据进行标准化。样品的颜色范围从红色到蓝色，表示代谢物浓度z-score。

2 干旱和氮肥制度对初级代谢产物的影响

非靶向初级代谢组学分析初步确定了总共155种化合物。在检测到的这些化合物中，118种显示出处理之间的统计学显著差异（p < 0.04）。在非靶向代谢组数据中有两种不同的响应（图3）：i）干旱条件下仅在干旱地块中相对浓度增加的化合物（响应A；n = 4），ii）在干旱条件下相对浓度降低的化合物（响应B；n = 46）。补充信息中展示样品中检测到的所有代谢物的热图（图S4）。PERMANOVA结果表明，总体上，水分胁迫分组（p < 0.001）对土壤初级代谢物浓度有显著影响，但氮负荷（p = 0.2）和草种（p = 0.4）对土壤初级代谢物浓度的分散总体上没有影响。

图3. 干旱、氮肥和草种对土壤代谢的影响。热图显示了土壤处理组（n = 8）的表达谱，基于由方差分析p值分类的50种最显著的初步鉴定的代谢物（p < 0.04）。使用Euclidean距离和Ward连接对代谢物进行聚类。使用对数变换和Pareto标度对数据进行标准化。样品的颜色范围从红色到蓝色，表示代谢物浓度z-score。

3 土壤特性

评估了干旱条件和降雨后恢复条件下土壤特性的差异。土壤pH、EC、NO₃⁻、NH₄⁺、K、总PLFA微生物生物量和PLFA真菌/细菌比之间存在统计学差异（p < 0.001），所有这些在干旱和恢复采样期间均有所降低（表1）。如预期的那样，干旱地块降雨后土壤水分在恢复期显著增加（p < 0.006）。相比之下，两个测量期之间的对照（灌溉）地块没有差异（p = 0.37）。在干旱和恢复取样期间，所有处理的土壤有效磷浓度均增加（p < 0.001）。

表1. 干旱和施氮量对表层土壤（0-10 cm）质量的影响。

在干旱期间与随后的干旱后（恢复）期间对土壤进行取样。字母表示使用方差分析和Tukey Post-hoc检验的处理之间的显著差异（ p < 0.05）。

4 PLFA群落组成

主成分分析用于描述不同处理之间PLFA微生物群落结构的变化（图4）。由此可以推断，微生物群落在干旱和恢复条件之间发生了变化，水分有效性的影响大于草种与氮肥负荷引起的差异。革兰氏阳性和真菌生物标志物数量的变化是驱动干旱和恢复条件之间群落结构变化的主要媒介。然而，PERMANOVA结果表明，总体上，土壤水分胁迫分组（p < 0.001）和氮负荷（p < 0.03）对土壤微生物群落有显著影响，而草种（p = 0.9）对土壤微生物群落没有总体影响。

图4. 极端干旱期间和干旱之后（恢复）氮和草种对土壤微生物群落PLFA的影响。主成分1（PC1）解释总变异的58.2%，主成分2（PC2）解释总变异的21.1%。矢量箭头表示变量之间的关系。圆圈代表处理组95%的置信水平。

5 干旱和恢复对净生态系统CO₂和N₂O通量的影响

重复测量方差分析表明，土壤水分胁迫（p < 0.001）、处理（p < 0.001）和天数（p < 0.001）对CO₂通量的影响存在显著差异。Post-hoc分析表明，在7月23日（29天第一次大降雨后的两天）和7月20日前后（7月26日、27日和29日）之间，CO₂通量显著增加（p < 0.01）。除7月23日CO₂通量达到峰值之外，其他日期之间没有显著差异（图1C）。然而，在干旱和水（对照）处理之间，累积CO₂（p < 0.02）和N₂O（p < 0.005）排放之间存在显著差异（表2）。

表2. 在取样期间（2018年7月16日至8月16日）干旱对300 kg N ha⁻¹ yr⁻¹地块温室气体CO₂和N₂O累积通量的影响；n = 6）。

数值代表平均值±SEM，字母表示处理之间的显著差异（p < 0.05）。

讨论

1 干旱对土壤复合脂质的影响

本研究旨在评估不同施氮量下新型生物土壤质量指标对极端干旱的响应。目前的生物指标（如PLFAs）对环境条件的变化很敏感，可以显示土壤微生物群落的变化，但是它们无法将这种变化与土壤功能联系起来。代谢组学和脂质组学数据与土壤微生物群落的物理状态直接相关。在极端条件下（在这种情况下是渗透胁迫）占优势的特定代谢组学和脂质组学分子的鉴定可能开始阐明这种生物学功能的变化。

土壤复合脂质组成受干旱条件和土壤氮负荷的影响。响应A（图2）显示在干旱条件下脂质浓度显著降低；该组包括磷脂酰乙醇胺（PEs）、磷脂酰胆碱（PCs）、脂肪酸（FAs）和神经酰胺这几种类型脂质的混合物，它们都在细胞膜中以高浓度存在并且以前在土壤中有过报道。PEs是调节膜流动性的关键，而PCs和神经酰胺在细胞中用作渗透胁迫的调节剂。许多先前的研究表明，细菌会改变其膜脂组成和细胞大小以应对非生物胁迫。例如，在渗透胁迫下的大肠杆菌，随着PEs的减少，心磷脂（CL）的相对浓度增加。许多细菌通过改变脂肪酸链的长度或饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例来改变膜的生物物理性质。因此，长期干旱引起的长期渗透胁迫很可能会导致观察到的脂质组成变化。

响应B（图2）显示在干旱条件下三酰甘油（TAG）化合物显著增加。TAGs是中性脂质，作为储存脂质或形成脂滴（LDs）的一部分主要存在于真核生物中以及数量有限的细菌，主要是放线菌和蓝细菌。LDs是由磷脂单层包围的中性脂质核心形成的细胞器，是真核生物和原核生物在应激条件下存活的关键。例如Zhang等人先前报道了LDs具有与基因组DNA结合的潜力，增加了细菌在胁迫下的存活率。此外，细胞质LDs也是细胞代谢和体内平衡的关键。干旱条件下TAG浓度的这种变化很可能代表了土壤生物功能的变化。如果生物体将能量集中在储存上，这可能会对正常的细胞功能和新陈代谢产生影响。

因此，我们可以接受假设2，在干旱条件下，微生物储存脂质成分确实增加了，这可能是由于水和必需营养物质变得更难获得。很可能只有当营养有效性低于C有效性时，TAGs和其他储存脂质才会累积。在这方面，微生物储存与有效养分和有效碳的比率高度相关，例如土壤和微生物化学计量。然而，必须注意的是，储存脂质的增加（特别是TAG），也可能具有渗透保护作用。

2 干旱对土壤初级代谢产物的影响

干旱时显著减少的化合物包括一系列氨基酸（如亮氨酸和缬氨酸）。以前曾用它们的丰度代表细菌生长率。随着异养代谢产生的大量代谢物浓度降低，许多代谢物与微生物生长直接相关，细菌群落的功能和生长很可能在干旱期间受到损害。

在本研究中，在干旱条件下增加的化合物的功能（响应A，图3）通常都与渗透保护有关。例如，也有研究表明，水溶性碳水化合物（如蔗糖）在代谢活动受损期间的持续生长和发育中起着关键作用，并且已被证明它们的积累发生在渗透胁迫下，特别是在替代膜磷脂以防止膜胶凝方面。这也与干旱缓解后恢复期观察到的总磷脂浓度下降相一致（表1）。糖醇（这里是阿拉伯糖醇和赤藓糖醇）在渗透胁迫下与储存能量的碳水化合物代谢相关。虽然这些化合物可以从细胞中分泌到周围的土壤中，但这里使用的提取程序无法区分细胞内和细胞外溶质。此外，2,4-二氨基丁酸是细菌合成四氢甲基嘧啶羧酸的关键；一种与生物体在极端渗透胁迫下存活的潜力高度相关的渗透物。四氢甲基嘧啶羧酸很可能与2，4-二氨基丁酸一起上调，然而，由于所采用的分析方法的局限性，在本研究中并没有发现。

基于这些结果，我们可以接受假设1，在干旱条件下，与应对渗透胁迫相关的初级代谢物化合物增加了。代谢物对短时间尺度（天）的变化也有响应。干旱缓解后，土壤代谢恢复到与对照地块相似的水平。尽管干旱地块与对照地块的代谢物并不完全匹配，这很可能是由于在更有利的生长条件下代谢化合物的快速合成以及土壤的异质性。基于这项研究，我们可以暂时接受假设4，因为微生物群落确实在缓解干旱方面表现出一些代谢遗留效应。然而，需要做更多的工作来显示这种遗产的持久性，以及多次干旱和干湿循环对土壤代谢健康的影响。

通常与渗透调节相关的代谢物的例子是脯氨酸、甘露醇、甘氨酸甜菜碱、海藻糖和葡萄糖。在所有样品中都检测到脯氨酸，并且在干旱处理下脯氨酸的浓度明显更高。在所有样品中都检测到海藻糖，与对照样品相比，在低氮条件下干旱处理中海藻糖的浓度更高。葡萄糖存在于所有样品中，在干旱和干旱恢复条件下，仅在高氮负荷样品之间观察到显著结果。由于GC-MS方法的限制，本研究中未检测到甘氨酸甜菜碱。甘露醇虽然有可能被气GC-MS检测到，但没有被鉴定出来，可能是由于其低于检测限。复湿时，这些细胞渗透物化合物的微生物循环可导致土壤呼吸的快速增加（“Birch效应”）。

虽然GC-MS可以测量许多初级代谢物，但它通常受到许多含氮代谢物和高度不稳定代谢物（例如，许多糖化合物共存，并且具有与其他糖类型化合物相同的m/z）分辨能力差的限制。同样，样品仅在正离子模式下用质谱运行；其他化合物可能已经在阴性模式下被检测到。此外，其他化合物（例如甘氨酸甜菜碱）是检测不到的，因为它们不适合衍生化。因此，本研究中检测到的化合物不是详尽的。然而，这项研究的发现表明，专注于一系列靶向化合物可能会简化植物-土壤系统对干旱生化反应的复杂性，而非靶向分析方法可能有利于识别进一步的胁迫生物标志物。

3 干旱对土壤PLFA微生物群落的影响

PLFA微生物群落的主成分分析聚类显示了处理之间群落结构的变化，干旱和恢复群落之间有明显的分离（图4）。群落组成的变化主要是由细菌驱动的。相反，在两个采样点之间，对照组和干旱组之间几乎没有分离。因此，我们拒绝假设3，因为虽然土壤微生物群落确实在渗透胁迫条件下改变了它们的PLFA膜组成，但这与对照组没有显著差异。此外，与干旱期相比，PLFA微生物生物量在恢复期显著减少。这是意料之外的，因为干旱后土壤重新湿润时，大量不稳定碳和其他营养物质可能会变得可利用，这在短期内会促进微生物的生长。例如，已有研究表明，干旱的微生物群落可以在补水后的几秒钟内做出反应，并且微生物生长可以在重新润湿后的48小时内重新建立。

革兰氏阳性菌在恢复期浓度增加，这可能是由于其生理特性导致其对渗透胁迫有更强的抵抗力。快速生长的革兰氏阴性菌群没有增加，这也支持了我们的发现，即在重新润湿后，大量不稳定的碳不能用于支持微生物生长。然而，正如Naylor与Coleman-Derr所指出的，土壤微生物群落的丰度变化依赖于环境，并且响应往往不一致。尽管如此，革兰氏阳性菌对与再润湿相关的有效水分和营养物质的增加的反应比其他生物群落更快，这可能是细菌与真菌比例变化的原因。

使用PLFA分析来理解微生物群落对外部胁迫的反应的变化有许多局限性。首先，活跃的、不活跃的和死亡的群落一起被抽样。此外，FA膜的组成可能会随着主要的环境条件而变化，而不是由于群落结构的实际变化。同样已证明土壤微生物群落在胁迫条件下用甜菜碱脂质替代磷脂，这在靶向PLFA试验中可能无法解释。因此，仅从PLFA数据来看，不可能将真正的群落变化与当前适应新环境平衡的微生物群落分开。因此，有针对性的方法：测量活性微生物（即¹³C标记的PLFA分析）或与宏基因组学方法相结合，可能会对微生物群落的干旱响应，特别是再湿润后土壤微生物活性的变化提供额外的见解。

与恢复期相比，干旱期间代谢组学和脂质组学化合物有明显的变化。对于脂质组学和代谢组学化合物来说，恢复似乎不仅仅是胁迫反应的逆转，许多非干旱反应化合物在恢复期间也在增加。这表明，就初级代谢功能而言，微生物群落对极端干旱和渗透胁迫具有恢复力，快速减少与缓解渗透胁迫相关的代谢化合物。然而，群落结构的变化表明群落的生理和功能可能已经改变，并可能在更长的时间内受到影响。正如所讨论的，PLFA膜组成的变化可能是由于主要的环境条件而不是由于群落结构的实际变化。

4 土壤和植物呼吸的变化

所谓的“Birch效应”通常被理解为由土壤微生物为应对低渗透胁迫和避免细胞溶解而释放的细胞内渗透调节物质的矿化引起的，并且再润湿时细胞外有机碳和微生物坏死物质的可用性增加（以及随后的消耗）。这与土壤在重新湿润时突然且短暂的CO₂释放有关，表明功能发生了重大转变，内部微生物碳储存重新动员。渗透压水解和消耗（特别是海藻糖）被认为是微生物呼吸快速增加的细胞内机制。

在这项研究中， Birch 效应在大量降雨后（29天的第一天）立即出现，随后的9天CO₂水平持续升高。CO₂通量在第一次相当大的降雨后两天达到峰值（图1），通量的增加在对照和干旱的地块中都很明显。因此，我们可能会否定假设5，干旱后的再湿润确实导致了CO₂的大量排放（“Birch效应”）和N₂O的排放，但与对照处理相比没有增加。然而，我们注意到，根呼吸和微生物呼吸是不可能分开的，两者都可能在再湿润时增加。

总的来说，非干旱（对照）地块在取样期间的累积CO₂和N₂O通量明显较高（+60%和+61%，表2）。我们将其归因于严重水分亏缺下的新陈代谢降低、硝化速率降低和相关的N₂O产生，以及NO₃底物的缺乏和可用于反硝化的厌氧微生物的损失。当我们利用自然极端事件时，我们只在实验的后半部分测量了GHG排放量。因此，我们无法完成GHG的全部估计。

5 植物种类和施氮量的影响

这项研究假设所有检测到的脂类和代谢物都直接来自活跃的土壤微生物群落。虽然检测到的大多数化合物都是微生物来源的，但有可能有些化合物是直接从土壤中提取的，例如从中型动物、微生物和植物残体以及腐殖质部分中提取的。

尽管羊茅黑麦草（Festulolium）更耐旱，但令人惊讶的是，草种对土壤中PLFA、代谢组学与脂质组学浓度的分布没有重大影响。这是意料之外的，因为这里使用的两种草具有不同的糖代谢、初级生产力、根系结构和生根深度。然而，它确实支持先前在同一土壤中的工作，该工作表明土壤溶液中的一系列代谢物不受草类物种的影响。这也可能意味着，与微生物生物量相比，根系分泌物对代谢组学特征没有贡献。

与草种的影响不同，PERMANOVA表明，氮负荷显著影响土壤中脂类的浓度模式。虽然脂质通常与碳和能量储存的关系比氮更密切，但先前的研究表明，氮源可以影响原核和真核细胞中脂质的代谢和浓度，氮缺乏会导致TAG积累。此外，已证明干旱胁迫下的细菌和植物能产生营养丰富的溶质，尤其是当氮大量存在时产生更负的渗透势，并有助于维持与改善细胞水合作用。然而，在较高的氮水平下，植物生长和根沉积的差异也可能导致微生物代谢的变化。因此，需要进一步的工作来更好地理解干旱条件下细胞能量利用、代谢功能和储存对养分有效性的复杂相互作用。

结论

土壤功能对水分不足的响应在多个时间尺度上都发生了明显的变化。最敏感的是CO₂外流（可能由干旱相关渗透物矿化引起），其次是脂质和代谢物，最后是PLFAs。非靶向初级代谢组学和复合脂质分析都提供了关于生物群落状态的高分辨率和响应性数据。本研究发现了一些对草原土壤干旱胁迫有响应的化合物。然而，这种分析方法仍处于起步阶段，需要做进一步的工作：（1）阐明胁迫和微生物储存脂质的利用之间的关系，（2）进一步探索本研究中土壤微生物胁迫诱导的化合物是否适用于其他胁迫条件，（3）评估其他土壤微生物群落组成的代谢组和脂质组组成，并进一步将其与土壤质量联系起来，（4）用代谢组学分析和其他功能指标（例如测量氮循环速率）补充测序和酶促研究，（5）衡量微生物群落在几个湿润和干旱循环中的恢复能力。结果表明，代谢组学和脂质组学分析可以为土壤生物群落中胁迫和恢复提供良好的指标。此外，还表明这些方法可以直接应用于实地研究，然而，由于考虑的变量数量增加，这增加了解释的内在复杂性。