NGS实验室建设原则及经验分享！

现任中山大学孙逸仙纪念医院病理科副研究员，细胞分子诊断中心副主任

于中山医科大学取得医学本科和病理硕士学位，德国慕尼黑科技大学取得医学博士学位，在纽约医学院和纽约州立大学完成博士后训练

曾分别任广州医学院附一院病理医师、Texas A&M University毒理与肿瘤实验室Scientist和纽约州立大学肿瘤预防研究所副教授

主要研究方向为肿瘤病理曾获多项美国NIH研究基金

发表SCI论文50多篇以及Elsevier和Springer出版社Book Chapter多篇

目前高通量测序技术在临床检测上的应用越来越广泛，今天给大家简单介绍一下NGS实验室的建设和合理分区。

高通量测序技术又称NGS (Next Generation Sequencing) 技术，它是对传统Sanger测序技术（即一代测序技术）进行了革命性的升级，可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，使得转录组学和基因组学被广泛应用于临床疾病诊疗实践中，预示着疾病诊疗分子时代的到来。

高通量测序检测实验室也叫NGS实验室，是以高通量测序技术为检测手段，来完成临床疾病筛查、诊断或辅助诊断、肿瘤基因突变检测等项目。高通量测序实验包括湿桌实验过程和干桌实验过程，其中湿桌实验是指实验标本预处理、核酸提取及其片段化、建库、扩增、靶序列富集、混样、测序前准备及测序，干桌实验是指测序后的数据分析、对比、注释和结果报告等生物信息学分析流程。

由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致检测结果不准确；且NGS实验要求高、影响因素多，实验过程处理不当也会导致检测结果异常。因此一个严格有序、规范的NGS实验室是非常必要的。

实验室各个区域无论是在物理空间上还是实际使用过程中，都应当处于完全分隔状态，并且各区域之间不能有空气的直接流通。

NGS检测通常涉及PCR扩增及核酸纯化富集等过程，任何样本源性污染、分析标签源性污染、扩增产物污染或气溶胶污染均可能导致假阳性或假阴性结果出现，因此各实验区域与缓冲间应有一定的通风压力差，保证合理的空气流向，防止污染。

新建实验室除合理规范外，也要易于管理；若原有实验室通过合理的规划改造也能满足质量管理要求，亦可不必特地新建实验室。

实验室区域选择及空间设计还应最大限度考虑是否方便日常监测工作，包括方便人员流动效率、大型仪器设备进出落地等。

 NGS实验室分区示意图

（引自李金明. 高通量测序技术）

本区域为洁净区域，用于试剂的配制、分装及少量储藏等，需存放于此区域的试剂不可逆行由后续处理样本的区域进入。另外，试剂盒中的阳性质控品和对照品不应贮存于此区域。

仪器设备：冰箱、生物安全柜、纯水仪、涡旋振荡器、移液器和离心机。

本区域为半污染区，用于核酸的提取及浓度测定。在提取不同类型的样本（新鲜组织、FFPE、血液等）核酸时应避免样本之间的交叉污染，建议在区域内设置不同样本的独立的超净工作台。布局时应注意高速离心机运行时产生的振动是否干扰其它设备等细节。

仪器设备：冰箱、生物安全柜、核酸自动提取仪、高速离心机、水浴锅、恒温金属浴、核酸定量仪、冰箱、移液器、涡旋振荡器和磁力架。

本区域为半污染区，用于文库的构建。NGS检测时常见的文库制备方法有杂交捕获法和扩增子法，两种方法均包含通过PCR放大文库产量的步骤，因此在文库制备区构建文库时，建议文库扩增产物传递至下一阶段区域（杂交捕获区）进行纯化及后续操作。另外，组织样本进行捕获法建库时需要先对样本做片段化处理，因此操作台面规划时应区分片段化区域和建库区域。

仪器设备：冰箱、生物安全柜、普通PCR仪、核酸定量仪、磁力架、超声打断仪、移液器、涡旋振荡器和离心机。

本区域为半污染区，用于文库扩增后的纯化，以及后续的二次扩增或捕获富集等步骤。严防此区域扩增产物及气溶胶等对其它区域的污染，尽量减少人员在该区域与其它区域之间反复频繁流动，同时该区域的实验物品、实验服等尽量避免外带。

仪器设备：普通PCR仪、核酸定量仪、磁力架、金属浴、真空浓缩仪、移液器、涡旋振荡器和微型离心机。

本区域为半污染区，对杂交捕获产物进行PCR扩增富集，同时对上机测序前的文库进行质控，并且完成文库上机前文库最终的稀释和混样。

仪器设备：冰箱、普通PCR仪、核酸定量仪、磁力架、移液器、涡旋振荡器和微型离心机。

本区域为半污染区，用于文库的上机测序。此区域应配备稳定的供电设施及备用电源，并配备独立的制冷设施保证测序仪在相对恒定的温湿度环境下工作；还需开设适宜面积的机房用于放置服务器等，所配备的网关设备应兼具稳定性和安全性，确保数据有效、安全传输。

仪器设备：测序仪、服务器、稳定电源。

本区域为半污染区，用于核酸样本质量和文库片段的分析。

仪器设备：冰箱、凝胶电泳、生物片段分析仪、移液器、涡旋振荡器和微型离心机。

总之，一个规范的NGS检测实验室是获得准确检测结果的重要保障，在实验室运行过程中要始终坚持“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时”的基本准则。