肠道菌群通过肠-肝轴加重三氯生诱导的肝损伤

编译：微科盟艾奥里亚，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》。

导读   

三氯生（TCS）是一种被广泛应用于消费品的抗菌成分。TCS可通过扰乱脂质代谢引起肝损害，常伴有肠道菌群失调。然而，肠道菌群对TCS诱导的肝损伤的影响仍不清楚。因此，我们以5周龄雄性C57BL/6小鼠为实验对象构建了小鼠模型，以探讨膳食TCS暴露（40 ppm）对肝损伤的影响。我们发现TCS处理4周能够显著干扰肠道菌群稳态，导致脂多糖（LPS）的过度产生以及包括脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）在内的次级胆汁酸的缺乏。此外，TCS通过减少粘液的分泌和紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin4）的表达显著增加肠道通透性，从而促进LPS的易位。血液中LPS的积累通过TLR4途径引发炎症反应导致肝损伤。综上，该研究为肠道菌群通过肠-肝轴诱导的TCS相关肝损伤的潜在机制提供了新的见解，并有助于更好地理解环境污染物TCS对健康的影响。    

原名：Gut microbiota exaggerates triclosan-induced liver injury via gut-liver axis

译名：肠道菌群通过肠-肝轴加重三氯生诱导的肝损伤

期刊：Journal of Hazardous Materials

IF：10.588

发表时间：2021.7.21

通讯作者：罗义＆毛大庆

通讯作者单位：南开大学环境科学与工程学院；南开大学医学院

实验设计

结果

1 三氯生（TCS）暴露会干扰肠道微生物群，并增加肠道源的脂多糖 肠道菌群作为一种新认识的功能器官，可被许多外源性物质改变；与此同时，肠道菌群在调节外源性物质介导的对宿主系统的毒性中起关键作用。基于三氯生（TCS）对肠道菌群的影响的研究（图1），我们发现TCS处理（40 ppm）四周后明显扰乱了小鼠肠道菌群。结果显示，TCS暴露降低了肠道菌群的α-多样性（ACE和Shannon指数）以及覆盖率（图2a，p <0.01）；基于主坐标分析，我们发现TCS处理还调节了肠道菌群的β-多样性（图2b）。具体而言，TCS处理明显改变了门和科水平的细菌丰度，导致变形菌门（Proteobacteria）丰度显著增加约6.9倍，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丰度显著增加约15.4倍（图2c-e，p< 0.01）。TCS 还增加了厚壁菌门 /拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes）的比例，降低了厚壁菌门（如Ruminococcaceae和Eubacteriaceae）和拟杆菌门（如Muribaculaceae）的丰度（图2e-g，p < 0.01）；已有研究证明，这些细菌参与了短链脂肪酸（SCFAs）的产生并维持了肠道免疫稳态。此外，TCS处理显著降低了Bacteroides、Blautia、Eubacterium、Clostridium和 Roseburia 的丰度（图2g，h；p < 0.01），这些菌属参与了肠道菌群胆汁酸生物转化过程。PICRUSt预测的KEGG分析显示，TCS处理后的肠道菌群增强了细菌碳水化合物转运和代谢、氨基酸转运和代谢、无机离子转运和代谢以及能量产生和转化等功能。变形菌门是肠道来源的内毒素脂多糖（LPS）的主要来源，已有的研究表示，其丰度与肠道LPS含量有关。在本研究中，TCS处理后肠杆菌科（变形菌门中的主要科）的比例增加了15.4倍，这可能与粪便LPS浓度和肠道菌群致病潜力的增加有关（图2i，j；p < 0.01）。综上，这些结果揭示了TCS暴露引起肠道菌群的剧烈变化和粪便LPS的显著增加。  

图1 通过肠道-肝轴加剧TCS诱导的肝损伤的肠道微生物群的实验时间流程图。

图2 TCS改变肠道微生物群组成，增加粪便LPS含量。（a-b）分别代表TCS处理显著改变了小鼠肠道菌群的α多样性（a）和β多样性（b）；（c-d）分别代表门水平（c）和科水平（d）上肠道细菌的相对丰度；（e）以树状图的形式展示了对照和TCS暴露动物的粪便样本存在差异富集情况；（f）厚壁菌门与拟杆菌门丰度的比值；（g）与SCFAs代谢相关的肠道菌群的相对丰度；（h）与胆汁酸代谢相关的肠道菌群的相对丰度；（i）粪便LPS浓度；（j）基于Bugbase构建的潜在致病菌的相对丰度。*和**分别代表在0.05和0.01水平上具有显著差异。误差线代表标准差。

  2 TCS暴露可诱导小鼠肠道炎症，损害肠道屏障

肠道菌群的不良扰动与肠道炎症的发生息息相关，已有的研究表明，肠杆菌科细菌的增殖参与了肠道炎症和肠道疾病的发病机制。本研究中，我们观察到TCS暴露诱导了肠杆菌科细菌的过度生长。为了验证TCS处理小鼠肠道的炎症响应，我们进一步探究了几种促炎细胞因子的表达水平。与对照组小鼠相比，TCS处理组小鼠结肠组织中NF-κB（p65）和TNF–α的蛋白表达水平显著上调（图3a，p < 0.01）。RNA测序结果显示，TCS处理显著改变了肠组织中基因表达的总体情况（图3b），导致肠道中673个基因显著下调和139个基因上调。包括Igkv8-28、Igkv4-50、Igkv6-32、Ighv1-84、Igkv8-18、Igkv11-125在内的差异表达基因（DEGs）与肠道免疫和炎症有关。基于DEGs的KEGG分析显示，与细胞因子和细胞因子受体通路（mmu04061）和NF-kappa B信号通路（mmu04064）相互作用的病毒蛋白表达上调，而胆碱能突触（mmu04725），钙信号通路（mmu04020），cGMP–PKG信号通路（mmu04022）和cAMP信号通路（mmu04024）表达下调（图3c）。此外，我们还发现包括白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-17、IL-23和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在内的促炎标记基因mRNA表达上调，而肠组织中抗炎性细胞因子基因IL–10的表达下调（图3d，p < 0.01）。此外，小鼠巨噬细胞（F4/80+）的免疫荧光分析表明，TCS处理显著促进了结肠组织的巨噬细胞浸润，这表明TCS暴露显著触发了肠道炎症响应。

图3 TCS干扰小鼠肠道的转录，诱导肠道炎症。（a）采用免疫印迹法检测结肠中NF-κb（p65）和TNF-α蛋白的表达情况（n=10）；（b）与对照组小鼠相比，TCS暴露小鼠肠道组织中差异基因的可视化分析；（c）差异基因的KEGG富集分析；（d）通过RT-qPCR检测结肠中促炎基因IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α以及抗炎基因IL-10的相对表达情况（n=3）；（e）小鼠结肠注重F4/80荧光免疫染色（左）及量化分析（右）。*和**分别代表在0.05和0.01水平上具有显著差异。误差线代表标准差。

肠组织的严重炎症响应通常与肠屏障功能障碍有关。在本研究中，TCS处理显著损伤了小鼠的结肠组织，并缩短了结肠长度（图4a、b）。此外，与对照小鼠相比，TCS暴露显著降低了结肠中屏障形成紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin4的表达水平（图4c，p < 0.01）。ZO-1和occludin的mRNA表达结果同样证实了TCS处理使小鼠的肠屏障受损（图4d）。紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin4）的完整性在维持肠屏障中起关键作用，受损的肠紧密连接显著增加了肠的细胞旁路通透性。在本研究中，TCS处理显著增加了粪便白蛋白的含量（图4e，p < 0.01），其被认为是肠道渗漏的生物标志物，这表明TCS暴露显著增加了肠道通透性。

除紧密连接外，肠道黏液同样起到了维持肠屏障的作用。sIgA和凝集素在粘膜防御肠道致病菌中起着举足轻重的作用。在本研究中，TCS暴露显著下调了上皮粘蛋白编码基因Muc2的表达（图4d，p <0.01）；基于AB–PAS染色，我们同样发现TCS处理减少了结肠组织中的粘液分泌（图4f，p < 0.01），这些结果表明TCS显著损伤了肠粘液层。此外，TCS暴露显著降低了C型凝集素编码基因Reg3b和Reg3g的表达并使得肠道sIgA分泌受损（图4g，p < 0.01）。分泌型C型凝集素和sIgA的缺乏可能导致肠道致病菌的过度生长并引起肠道免疫系统疾病。肠道屏障受损和肠道菌群紊乱导致微生物从肠腔移位至固有层（图4h），这可能增加了肠道细菌进入循环的可能性，并对健康构成极大风险。

图4 TCS破坏小鼠肠道屏障，促进小鼠微生物易位。（a）H&E染色显示了小鼠的结肠组织（左）以及结肠损伤（右）的组织学评定；（b）小鼠的平均结肠长度（n=10）；（c）免疫印迹法检测了结肠中ZO-1、occludin以及claudin4蛋白的表达情况（n=3）；（d）采用RT–qPCR技术检测结肠组织中ZO-1，occludin以及Muc2基因的表达情况（n=3）；（e）小鼠粪便白蛋白含量（n=10）；（f）采用AB-PAS染色，显示了结肠组织中杯状细胞的分布（左）及量化情况（右）；（g）小鼠粪便中标志性内容物含量（n=10）；（h）结肠横截面中细菌易位的可视化分析（左）及量化情况（右）。*和**分别代表在0.05和0.01水平上具有显著差异。误差线代表标准差。

  3 TCS暴露可诱导小鼠肝损伤 本研究中，TCS处理显著降低了小鼠的体重，但并未对摄食量造成影响。基于H&E染色，我们发现TCS暴露导致了肝细胞损伤，以及明显的肝肿大和肝脏重量增加。此外，TCS给药小鼠的血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平显著升高（图5a，p < 0.01），表明小鼠的肝功能出现障碍。再者，编码肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）和脂肪酸转运蛋白CD36的基因表达水平在TCS处理的小鼠中明显增加，表明其甘油三酯合成和脂肪酸摄取出现障碍。血清中甘油三酯水平的显著升高，总胆固醇（TCh）和高密度脂蛋白（HDL）水平的显著降低，证实了小鼠体内甘油三酯代谢紊乱（图5b-d，p < 0.01）。值得注意的是，TCS给药小鼠还显示肝脏甘油三酯水平显著升高和肝脏中脂滴明显蓄积（图5e-g，p < 0.01），进一步证实了肝功能障碍的存在。天狼星红染色表明TCS处理的小鼠肝脏中胶原蛋白的积累显著升高（图5h-i；p < 0.01），同时纤维化基因collagen 1a1和α-Sma的表达增加，这可能导致肝纤维化的产生。而且，TCS暴露急剧增加了肝脏中的丙二醛（MDA）水平（图5j，p < 0.01），刺激了氧化应激反应基因 Nqo-1 和GST（Gsta1）的表达，导致肝脏氧化-还原微生态失调。  

图5 TCS诱导小鼠肝功能障碍。a-d分别代表小鼠血清中ALT（a）、甘油三酸酯（b）、TCH（c）和HDL（d）的含量（n=10）；（e）肝组织中的甘油三酯的水平（n=10）；（f-g）分别代表采用油红O染色肝切片的代表性图片（f）以及油红阳性面积的定量分析（g）；（h-i）分别代表用天狼星红染色的肝切片（h）及定量分析（i）以评估肝纤维化程度；（j）小鼠肝组织中的MDA含量。*和**分别代表在0.05和0.01水平上具有显著差异；ns代表无显著差异。误差线代表标准差。

  4 肠道微生物群通过小鼠肠道-肝轴加剧了TCS诱导的肝损伤

一般而言，肝脏炎症是肠道菌群相关肝损伤的病理生理学基础。许多研究表明，外源性物质的暴露可能干扰肠道菌群组成，微生物群的改变可能影响肝脏病变的发生。本研究中，我们采用抗生素鸡尾酒疗法预处理肠道菌群随后进行TCS处理来确定肠道菌群在TCS诱导的肝损伤中的作用。与TCS组相比，抗生素和TCS协同处理显著减轻了TCS诱导的肝损伤，降低了血清ALT和甘油三酯水平，降低了肝脏甘油三酯和MDA水平，提高了血清TCh和HDL水平（图5a-e，j；p < 0.01）；这些发现表明肠道菌群可能在TCS相关的肝损伤中起关键作用。如图5（图5a-e，j；p < 0.01），单独抗生素处理（无TCS处理）对小鼠血清ALT、TCh、HDL和甘油三酯水平以及肝脏甘油三酯和MDA含量无显著影响，排除了抗生素对小鼠肝损伤的影响。

我们进一步探究了肝损伤中TCS相关肠道菌群微生态失调的潜在机制。由于肝与胃肠道之间存在直接解剖学连接，肝脏持续暴露在微生物产物（如LPS和次级胆汁酸）环境中，这些微生物产物通过肠-肝轴与肝脏炎症密切相关。具体而言，由于肠道通透性增加，TCS暴露明显升高了血清LPS浓度（图6a，p < 0.01）。LPS可结合并激活跨膜受体蛋白TLR4，促进促炎性细胞因子（TNF-α和IL-6）的表达，这与肝损伤密切相关。在本研究中，TCS处理小鼠的肝脏中蛋白TLR4表达明显增加（图6b，p < 0.01）。此外，TCS暴露显著上调LPS/TLR4通路主要元件的基因表达（图6c，p < 0.01），如MyD88、IRAK4和TRAF6。MyD88作为LPS/TLR4通路的必需接头蛋白，其能够通过IRAK4和TRAF6参与活化NF-κB过程。为了进一步研究TCS是否可以引起炎症反应，我们进一步量化了与肝脏炎症相关的主要促炎细胞因子（NF-κB、TNF-α和IL-1β）；通过分析发现，TCS处理显著上调了肝组织中这些促炎细胞因子的表达（图6b，d；p < 0.01）。综上，这些结果表明TCS通过受损的肠屏障明显增加血清LPS水平，并通过激活LPS/TLR4通路促进肝脏炎症。

TCS处理还导致循环系统中TBA的明显蓄积以及次级胆汁酸的缺乏（图6e）。血液总胆汁酸（TBA）含量通常被认为是肝胆损害的指标，也是调控肠道-肝脏串扰的多效性信号分子。为了探究TBA是否参与了TCS诱导的肝损伤，我们进一步定量了胆汁酸相关受体（如TLR9和TGR5）的表达。一般过量的胆汁酸损伤肝细胞，引起线粒体DNA的释放，从而激活TLR9，刺激炎性细胞因子表达。在本研究中，TCS处理显著降低了肝组织中TGR5的表达并促进了TLR9的表达（图6f，p < 0.01），这表明TCS诱导的胆汁酸紊乱可能参与了TCS诱导的肝损伤。我们进一步检测了参与肝脏炎症反应的中性粒细胞募集趋化因子，结果显示，与未接受TCS处理的小鼠相比，TCS处理小鼠CXCL2和CXCR2的mRNA表达明显上调（图6f，p < 0.01），表明由于TCS诱导的炎症反应，肝脏中的单核细胞和巨噬细胞被激活。此外，血清中促炎性细胞因子（IL-6和TNF-α）的显著增加预示着小鼠全身的低度炎症状态（图6g-h；p < 0.01）。

如图6所示，在未经TCS处理的小鼠中，单独抗生素处理对血清LPS无显著影响；相反，抗生素预处理大大减少了TCS处理小鼠中血液LPS的积累。此外，在TCS处理的小鼠中，抗生素预处理显著减弱了LPS/TLR4激活的炎症反应，其表现为TLR4、NF-κB（p65）和TNF-α蛋白的表达下降，以及肝组织中趋化因子基因MCP-1和CXCL2表达的减少。所有这些数据共同表明，TCS诱导的肠道菌群微生态失调通过肠道-肝脏轴加剧了TCS诱导的肝损伤。

图6 肠道微生物群参与了TCS诱导的小鼠肝脏炎症。（a）血清LPS水平（n = 10）；（b）基于western blot检测肝脏TLR4、NF-κb（p65）和TNF–α的蛋白表达情况（n = 3）；（c）采用RT-qPCR技术对TLR4通路中相关基因（MyD88、IRAK4以及TRAF6）相对表达量进行评估（n = 3）；（d）采用RT–qPCR技术检测肝脏中促炎基因TNF-α、NF-κB（p65）和IL-1β以及趋化因子基因MCP-1的相对表达量（n = 3）；（e）小鼠的血清TBA水平（n = 10）；（f）采用RT-qPCR技术检测肝脏中TGR5、TLR9、CXCL2和CXCR2基因的表达情况（n = 3）；（g）小鼠血清IL-6含量（n = 10）；（h）小鼠血清TNF-α含量（n = 10）。*和**分别代表在0.05和0.01水平上具有显著差异；ns代表无显著差异。误差线代表标准差。

讨论

TCS毒性机制由于其广泛排放到环境中，且人类在日常生活中频繁暴露，因此具有重要的生态意义和健康意义。有研究发现，TCS相关肠损伤由肠道菌群调节和TLR4信号转导所触发，TCS相关肝毒性由破坏脂质代谢和促进肝脏氧化应激和纤维化诱导。但对TCS毒性机制的认识仍不全面，肠道菌群及其代谢产物对TCS经肠道-肝脏轴诱导的肝损伤发病机制的影响常常被忽略。本研究中，我们首次证明了肠道菌群在通过肠道-肝脏轴加剧了TCS诱导的肝损伤中的重要作用。

最初的研究曾在水生生物中观察到TCS暴露引起的肠道菌群改变，后来的动物实验表明，TCS暴露使厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度急剧下降，肠道菌群中的变形菌门比例增加。在本研究中，我们发现TCS暴露显著提高了与内毒素LPS相关的肠杆菌科细菌的比例，并降低了与次级胆汁酸产生相关的肠道细菌的丰度，如Bacteroides、Blautia、Eubacterium、Clostridium和Roseburia。这些共生细菌的缺乏导致次级胆汁酸[脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）]含量的降低。因此，我们的研究表明，TCS相关的肠道菌群微生态失调导致LPS的过度产生和DCA和LCA的缺乏。

TCS诱导的肠道炎症已被证明与肠道微生物群的调节和TLR4信号通路的激活相关。本研究所发现的：TCS处理的小鼠粘液分泌的减少和紧密连接蛋白（ZO-1，occludin和claudin4）的下调，为肠道通透性的增加提供了进一步的证据。肠道通透性的增加允许微生物产物（如LPS）易位到门静脉和机体循环系统中，其表现为LPS的血清浓度显著增加。作为肠-肝轴的典型分子，血液中积累的LPS在体内保持低水平的炎症状态，并通过激活TLR4信号通路触发促炎细胞因子的排泄来启动肝脏炎症响应。本研究中，我们特别证明了肠道来源的LPS在血液中的积累可能通过触发肝脏的炎症反应导致肝损伤，次级胆汁酸（DCA/LCA）的缺乏可能参与了肝脏炎症的发展。值得注意的是，正如HE染色组织的组织学评价所示，肝损伤主要位于门静脉周围隔室而不是整个肝小叶的均质区，这可能是由于TCS暴露期和低度炎症所致。此外，肝脏的炎症响应和脂质代谢的失调可能会阻止小鼠的体重增加；事实上，肠道损伤引起的吸收能力降低也可能与TCS处理小鼠的体重降低有关。尽管观察到TCS相关的肠道菌群微生态失调有利于肝脏炎症，但有关于次级胆汁酸（DCA或LCA）减少的影响有待于实验进一步证实。

此外，越来越多的研究强调了肠-肝轴在外源性物质（包括无机砷、二恶烷、毒死蜱和其他几种污染物）诱导的肝损伤中的关键作用。很显然，由这些外源性物质诱导的肠道菌群微生态失调促进了肠道菌群相关疾病的发生和进展，如肠道炎症和免疫功能障碍、肥胖和心血管疾病，甚至结直肠癌和肝癌。肠道菌群失调常引起肠道屏障损害，导致LPS易位进入循环系统，LPS引发的炎症对机体器官尤其是肝脏造成很大威胁。

在本研究中，基于消费品产品的人体暴露浓度，我们设计了TCS的给药方案。据报告，TCS的人体暴露水平约为0.073 mg/kg/天，相当于小鼠中约0.88 mg/kg/天。如果消费者摄入含TCS的漱口水或牙膏，TCS暴露水平可能增加至约1 mg/kg/天（小鼠中约10 mg/kg/天）。该剂量范围与我们动物实验中使用的TCS水平（约10-15 mg/kg/天）相当。此外，据报告，与本研究中使用的剂量相当的TCS暴露（饲料中80 ppm）在循环系统中引起2422 ± 345 nM水平的TCS蓄积。这些浓度略高于人体研究中报告的水平（90-1000 nM）。

结论

综上，我们的结果揭示了肠道菌群的生态失调可能通过肠道-肝脏轴加剧了TCS诱导的肝损伤。这些结果通过LPS建立了肠道菌群与TCS诱导的肝损伤之间的密切联系，从而为TCS诱导肝损伤的潜在机制提供了新的见解。需要进一步的人类受试者实验来更好地阐述TCS毒性对肝脏健康的影响，以便进一步调节该化合物。

打赏