编译：微科盟北岸，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
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导读
食草昆虫对有毒植物防御化合物的适应性与肠道微生物的组成有关。为了克服植物抗性，昆虫的肠道微生物群对来自食性生态位的各种化感物质作出反应。然而，对于同属食草昆虫物种而言，肠道微生物群是否有助于宿主竞争食性生态位，尚不清楚。该研究基于16S rDNA高通量测序，对两种具有相同食性生态位的粒肩天牛属物种的肠道菌群进行了研究，以确定肠道菌群是否有助于昆虫在食性生态位竞争中成功。研究人员的发现表明，肠道菌群在两种粒肩天牛属宿主生态位竞争中发挥了一定的作用。锈色粒肩天牛（Apriona swainsoni）有许多丰富的通路可以帮助降解植物有毒次生化合物，包括外源性生物降解和代谢，萜类和聚酮代谢，以及次生代谢产物的生物合成。同时，锈色粒肩天牛比桑天牛（A. germari）拥有更多的微生物多样性和功能菌。结论是肠道菌群可能影响食草动物和宿主植物的共同进化。肠道细菌不仅可以促进营养关系，还可能在昆虫食性生态位竞争中发挥重要作用。 原名：Two Apriona Species Sharing a Host Niche Have Different Gut
Microbiome Diversity
译名：两种共享宿主生态位的粒肩天牛属物种具有不同的肠道菌群多样性
期刊：Microbial Ecology
IF：4.552
发表时间：2021.7.24
通讯作者：周旭东 & 黄俊浩
通讯作者单位：浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室；浙江农林大学林业与生物技术学院
在幼虫期，锈色粒肩天牛（Apriona swainsoni）在云实上数量要多于
桑天牛（
A. germari）（
t= 6.3
，df = 28，p < 0.0001，图1a）。在连续三年的研究中，桑天牛幼虫占据的云实生态位的11.11 ~48.28%，大约相当于天牛总数的三分之一。
图1 天牛种群数量及生境。a本研究中包括的两种天牛的成虫，以及从云实分枝收集的天牛幼虫数量的统计分析。b野生环境中云实的花和枝。c云实树枝上天牛的幼虫。t检验主要用于确定两种幼虫数量的差异（t = 6.3，df = 28，p < 0.0001）。
经过一系列的数据质控处理，共鉴定出508,142个
tags
属于真细菌域。平均每个样本有63,517个tags。桑天牛肠道菌群平均有1666
个
OTUs，
锈色粒肩天牛肠道菌群平均有
5378个OTUs。细菌稀疏曲线用于评估每个样本的测序深度。8个样本的16S rDNA测序的稀疏曲线趋于饱和，表明这些样本的测序深度可用于后续分析。肠道微生物群落结构分析表明，两种天牛的优势菌群存在显著差异。变形菌门（Proteobacteria）是两种天牛肠道菌群的优势菌门，锈色粒肩天牛和桑天牛分别为75.01%和84.89%（
图
2a和c）。此外，拟杆菌门（Bacteroidetes，8.27%）和放线菌门（Actinobacteria，2.93%）是桑天牛的优势菌门，而厚壁菌门在锈色粒肩天牛（10.25%）肠道菌群的中丰度显著高于桑天牛（7.56%）（图2a和c）。在属分类水平上，肠道微生物组的差异更为明显（Welch’s t，p < 0.05）。Serratia（13.28%）和 Acinetobacter（8.29%）是桑天牛
种群肠道菌群的优势菌属，而
Acinetobacter（31.48%）和 Staphylococcus（5.87%）是锈色粒肩天牛种群肠道菌群的优势菌属（图2b）。为了明确两种甲虫群落组成的差异，研究人员使用随机森林分类比较了肠道菌群。Pseudomonas、Stenotrophomonas、Serratia、Olivibacter、Moheibacter和Luteimonas只在桑天牛的肠道菌群中发现。Manhattan图显示54个
OTU
s，代表5个门（放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、Oxyphotobacteria和变形菌门）在
锈色粒肩天牛肠道菌群中显著高于桑天牛（图
2e；
丰度显著富集的OTUs
是填充的三角形，丰度显著较低的OTUs是空的三角形）。在七个α多样性指数中，有三个（Sobs、Chao1、Ace）在两种天牛组间差异显著（Wilcoxon test，p < 0.05）。基于Bray-Curtis距离，两个物种菌群β多样性也存在显著差异（Wilcoxon检验，p < 0.05）。基于Bray-Curtis距离的PCoA显示，桑天牛的肠道菌群组成不同于
锈色粒肩天牛的肠道菌群组成（
p < 0.001）。基于Bray-Curtis距离的相似度分析也表明桑天牛与锈色粒肩天牛的微生物组间差异显著，组内相似性较高。
图2 比较两种天牛肠道菌群组成。a在门分类水平上，肠道菌群组成。每个柱状图代表四个样品。b在属分类水平上，肠道菌群组成。每个柱状图代表四个样品。c-d在门分类水平上，两个物种的菌群差异（Welch’s t-test，p < 0.05）。e Manhattan图显示了相对于桑天牛肠道菌群，锈色粒肩天牛肠道菌群富集的OTUs。丰度显著富集的OTUs是填充三角形，丰度显著较低的OTUs是空三角形。虚线对应于错误发现率校正p值显著性阈值（p < 0.001）。点颜色对应每个OTUs在门分类水平的分类，点的大小对应于相关样本中OTUs的相对丰度。CPM，每百万计数。两种预测功能方法得到的注释结果差异较大（p < 0.05，图3）。Tax4Fun指出11条KEGG通路富集于桑天牛
肠道菌群中
20个最丰富的菌群，9条KEGG通路富集于
锈色粒肩天牛肠道菌群中
9个最丰富的菌群（图3a）。相比之下，PICRUSt2只在桑天牛肠道菌群20个最丰富的类群中发现了一个显著富集的KEGG通路，而且只有两个KEGG通路在
锈色粒肩天牛肠道菌群中显著富集；其他两组的富集被抑制（图
3b）。因为Tax4Fun在两个微生物组之间发现了更富差异的KEGG通路，所以我们使用Welch’s t-test来比较两组之间丰度的平均差异（图3）。研究人员发现23条KEGG通路显著差异富集（Welch’s t,p < 0.05）（图4）。
锈色粒肩天牛肠道菌群显著富集的通路包括氨基酸代谢、信号转导、脂类代谢、外生生物降解和代谢、萜类和多酮类代谢、其他次级化合物的生物合成、内分泌系统、运输和分解代谢、神经系统、免疫疾病、物质依赖、排泄系统和循环系统（图
4）。桑天牛菌群中显著富集的通路包括辅助因子和维生素代谢、能量代谢；传染性疾病、聚糖生物合成和代谢、其他氨基酸代谢、折叠、分类和降解；转录，内分泌和代谢疾病（图4）。
图3 差异丰度KEGG通路的热图和层次聚类。a基于PICRUSt2分析的热图；基于整合的微生物基因组数据预测功能（IMG）。b基于Tax4Fun分析的热图；研究人员利用全基因组构建了一个“物种SILVA注释基因”网络。
图4 Tax4fun确定了两种动物肠道微生物组的功能差异，并使用Welch’s t-test进行检验。a不同的功能沿着纵坐标显示，而平均丰度沿着横坐标显示。b功能在横坐标上的丰度差异，点颜色表示对应功能更丰富的天牛物种。
云实产生的次级代谢化合产物分析表明不同营养积累阶段，被测化合物的含量不同。有机酸、黄酮类化合物、总羟基苯和二萜生物碱的含量分别为5.25 ± 0.67mg/g、4.01 ± 0.55 μg/g、8.69 ± 1.86mg/g和0.65 ± 0.02 mg/g。此外，Student's t-test结果显示，这些化合物（有机酸、类黄酮化合物、总羟基苯和二萜生物碱）的含量在两种天牛中没有显著差异。采用典型对应分析（CCA）和冗余分析（RDA）植物次生化合物与细菌群落组成的关系（
图
5a，b）。CCA 和RDA表明肠道菌群结构与植物次生化合物的含量显著相关
（图
5a，b）。在CCA中，有机酸含量与细菌群落结构相关。而在RDA中，总酚含量与微生物组组成相关。很明显，
锈色粒肩天牛的肠道微生物群不太可能受到有毒化合物的影响（图
5a，b）。植物次生化合物与菌群丰度相互作用的网络分析表明Sphingobacterium
、
Stenotrophomonas、Acinetobacter、Thermus、Achromobacter、Gibbsiella和Pseudomonas的丰度与二萜生物碱呈
显著正相关（图
5c）。相反，Pseudomonas、Gibbsiella和Acinetobacter的丰度与黄酮类化合物呈显著正相关。Sphingobacterium、Stenotrophomonas和Acinetobacter的丰度与有机酸呈显著正相关
（图
5c）。网络分析显示，没有菌群物种的丰度与总羟基苯呈正相关关系，但对Staphylococcus、Corynebacterium和Lactobacillus有抑制作用（图5c）。为了进一步阐明天牛肠道菌群对相同浓度植物次生化合物的响应，研究人员还测定了各菌属相对丰度与各化合物浓度之间的相关性（图5d，e）。植物次生化合物差异矩阵与两种天牛肠道菌群在属水平距离Mantel检验表明，总酚和
二萜生物碱与天牛肠道菌群属水平距离呈显著负相关（
p < 0.05）。桑天牛肠道菌群9种细菌丰度与4种化合物显著相关。只有一个菌属与二萜生物碱含量呈正相关。只有一种菌属与总酚含量呈显著负相关（p < 0.05，
图
5d）。然而，在锈色粒肩天牛肠道菌群中，Acinetobacter与有机酸显著正相关（p < 0.05），Bifidobacterium与总酚含量呈显著正相关（p < 0.05，图5e）。
图5 植物次生化合物与肠道菌群相关性研究。ZF，总酚；YJS，有机酸；ET，二萜生物碱；HT，黄酮类化合物。a-b CCA和RDA图显示细菌群落结构与ZF、YJS、ET和HT浓度显著相关。c网络分析显示细菌丰度与有毒化合物浓度之间的相关性。d桑天牛肠道菌属丰度与有毒化合物的相关性。e锈色粒肩天牛肠道菌属丰度与有毒化合物的相关性。*p< 0.05；**p< 0.01
研究人员在以植物汁作为单一碳源的培养中观察到23个分离菌株。其中15个分离菌株源自
锈色粒肩天牛，分别属于
Bifidobacterium（7）、Serratia（3）和Acinetobacter（5）。7个分离菌株源自桑天牛，分别属于Bifidobacterium（2）、Serratia（3）和Acinetobacter（2）（图6a）。细菌数量少的原因可能是浓度低，或者很多菌株不能用常规方法体外培养。在以四种化合物作为唯一碳源的培养基上，两组菌株的数量也存在一些差异。结果表明，以黄酮类化合物为单一碳源的培养基上菌株数量无显著差异（p > 0.05）。在其他处理中，从锈色粒肩天牛分离的菌株数量均显著高于从桑天牛中分离的菌株数量（图6b，c）。
图6 植物次生化合物对两种天牛肠道可培养细菌的影响。a从植物汁液培养基中分离得到单株分离株，利用其16S rDNA V3-V4基因和NCBI获得的相似序列构建最大似然树（ML）。b四种化合物固体介质
的Newcombe实验结
果。c对四种化合物的Newcombe实验进行了数据统计。在这项研究中，肠道微生物群对以云实分枝为食的锈色粒肩天牛的种群优势至关重要。这些天牛竞争的生态位是一个低质量的宿主，缺乏营养，并产生有毒化合物。从云实的分枝中鉴定出许多次生化合物，其中许多因素阻碍植食性昆虫生命周期的顺利完成。植物为植食性昆虫提供营养和生态位，但它们也有防御机制，包括化学抗虫性。为了应对化学防御，昆虫利用肠道微生物来解毒化学物质，并成功地获得必要的营养物质来完成它们的生命周期。植食性昆虫肠道内的共生细菌可能负责纤维素消化和必需维生素的合成等过程，而宿主消耗的毒素会破坏正常的肠道微生态。植物毒素可能会使昆虫失去生命力，导致昆虫无法完成其生命周期，并在植物生态位的竞争中失去优势。只有那些成功和有效占据特定生态位，容忍或中和植物抗性的昆虫物种，才能成为生态位上的优势物种。植食性昆虫利用功能性微生物作为武器对抗植物毒素和来自其他昆虫的竞争。它们主要是通过比其他昆虫更有效地利用宿主植物提供的营养来获得生态位优势的，在植物毒素的驱动下，肠道微生物群落的菌群多样性可能是昆虫在满足合适的生态条件后走向特殊化的下一步。经过3年多的野外研究发现，
锈色粒肩天牛占据了云实生态位（图
1）。肠道微生物可以增加其昆虫宿主的适应性，与功能未知的微生物或机会性定居在各种生态位栖息地中的物种共存。Cheng等认为Novosphingobium菌属的系统类型与柚苷配基降解活性高度相关，具有参与降解途径的基因。红脂大小蠹（Dendroctonus valens）获得了对柚皮素的保护，并由于与特定微生物的关联而表现出良好的适应性。肠道微生物群中的菌属Enterobacter、Serratia、Acinetobacter和Micrococcus有助于
山茶象（
Curculio chinensis）适应植物寄主，调节茶皂素代谢。这些菌属帮助茶山茶象避免有毒的植物化合物。研究人员发现Acinetobacter、Staphylococcus、Enterococcus和Corynebacterium在锈色粒肩天牛中的丰度显著高于桑天牛（图1）。除了茶皂素，Acinetobacter可以代谢有毒的糖苷，影响植食昆虫的生长发育，而Serratia可以与皂苷一起代谢萜烯。使用Tax4Fun鉴定物种之间的差异KEGG通路，并通过Welch’s t-test来比较两个天牛物种之间丰度的平均差异。结果表明，
锈色粒肩天牛肠道菌群中富集了外源生物降解和代谢途径、萜类和多酮类代谢途径以及其他次生化合物的生物合成途径。研究人员还发现两种天牛可培养的肠道细菌存在显著差异。这说明大量的分离株可能参与了锈色粒肩天牛肠道菌群中一些次级毒性化合物的代谢。最近的研究报告发现当宿主生态位发生变化时，植食性昆虫定制有益细菌，迅速建立新的肠道微生物群落生态系统。尽管寄主植物提供了不同水平的防御化学物质，但这些引起的微生物组组成的变化可能赋予了昆虫一种适应可塑性，增加了昆虫的适应能力。鉴定出的4种有毒化合物与某些功能性细菌的富集有关。这些细菌可能会在生态位竞争中给锈色粒肩天牛带来优势。CCA和RDA结果表明，这两种天牛的肠道菌群是由检测的四种化合物决定（图5a
，
b）。它们对两种天牛肠道微生物群落的丰富度和多样性都有一定的影响（图6b，c）。锈色粒肩天牛肠道菌群的物种多样性和功能菌群数量显著高于桑天牛肠道菌群（图6）。总的来说，物种丰富度较高的肠道菌群更有可能忍受外来物质的干扰，维持系统原有的功能，维持宿主的健康。拥有咀嚼口器的昆虫，如天牛，其肠道微生物很可能直接暴露在外部环境中，参与昆虫-植物的共同进化。肠道共生细菌更经常直接接触植物毒性物质，这可能是肠道微生物能够帮助宿主在新的食物生态位中适应的主要原因。此外，昆虫肠道不同部位的微生物在消化植物组织的过程中处于不同浓度的植物毒性物质中。由此产生的多样性解毒机制为植食性昆虫适应植物产生的毒素和随后占据各种生态位奠定了基础。肠道菌群在两种天牛之间的生态位竞争中起着重要作用。肠道菌群可能有助于两种天牛适应植物有毒的次生化合物。另一方面，植物产生的抗虫机制可能促进昆虫对其植物宿主的适应。因此，肠道菌群可能是昆虫竞争生态位中不可或缺的组成部分，肠道菌群的作用应得到重视。
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