独家专访：陈功教授解读胶质细胞向神经元转分化的研究争议

撰文 | 王聪 编辑 | 王多鱼 排版 | 水成文 对于阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等神经退行性疾病，以及脑中风，都会导致大量神经元丢失。如果能体内再生神经元，无疑对这些重大疾病的治疗带来实质性突破。 近年来， 陈功 教授团队等证实通过AAV病毒载体过表达NeuroD1基因能够将大脑中的星形胶质细胞转分化为神经元； 付向东 团队和 杨辉 团队则分别证实了敲低Ptbp1基因同样可以实现星形胶质细胞向神经元的转分化。 这些研究为神经退行性疾病和脑中风等疾病的治疗带来了新的希望。 然而， 2021年9月27日，美国得克萨斯大学西南医学中心的 张春立 团队在 Cell 上发表论文 【1】 ，该论文认为， 过表达NeuroD1或敲低Ptbp1并不能把体内星形胶质细胞转分化为神经元。那些所谓的“新生神经元” 只不过是大脑本身的原位神经元。 如果这篇 Cell 论文的结论正确的话，就意味着通过 NeuroD1 和 Ptbp1 来实现胶质细胞向神经元的转分化是不可行的，可以说是彻底否定了整个研究领域。 这项“颠覆性研究”成果究竟如何？胶质细胞能否向神经元转分化？ 带着这些疑问，《生物世界》独家专访了大脑内源性胶质细胞向神经元转分化研究的权威专家 陈功 教授，以下为专访内容： 问题1：这篇 Cell 论文指出大量NeuroD1诱导的mCherry阳性神经元与GFP事先标记的内源性神经元重合，出现这种现象的原因是什么？ 陈功 ：这主要是因为他们用了高滴度1-2×10E13GC/mL，1μl 体积的AAV病毒，对大脑组织产生了损伤，引起了神经元泄漏。我们团队也已经用这样的高滴度AAV，证实了注射高滴度AAV产生的毒性。事实上，早在11年前，宾夕法尼亚大学的 Douglas Coulter 等人就曾在 Nature Neuroscience 上发表论文，报道了高滴度AAV有毒性 【2】 。 在基因治疗领域，大家也都很重视AAV的剂量效应。遗憾的是，张春立团队直接使用了有毒性的高剂量AAV做实验，但没有先做剂量效应曲线。他们的这项研究去年在预印本发表时我们就注意到了，我也在当时给他指出过这个问题了。 问题2：这篇 Cell 论文指出NeruoD1突变体（也就是没有功能的NeuroD1）在体外不能诱导胶质瘤向神经元转分化，但是在体内却可以看到“转分化现象”，出现这种现象的原因是什么？ 陈功 ：这个不清楚，我们的NeuroD1在体内和体外都可以很好的诱导胶质细胞向神经元的转分化。 问题3：这篇 Cell 论文同时否定了调控NeuroD1 和Ptbp1对胶质细胞转分化为神经元的作用，但你们以及付向东、杨辉的研究确实在小鼠和猴子模型中观察到了治疗效果，这应当作何解释？ 陈功 ：因为我们的NeuroD1确实把损伤引起的应激性胶质细胞转化为神经元了，所以才会有治疗效果。事实上，在张春立团队的这篇 Cell 论文里 （图1I、图1L、图3H） 【1】 ，都完美地展示了在皮层损伤模型上，NeuroD1组比对照组有非常好的神经组织修复。很奇怪他们居然视而不见，我去年也已经指出来了。 来自张春立团队的 Cell 论文【1】 他们的NeuroD1修复效果和我们去年发表的将胶质疤痕逆转为神经组织的工作是一致的（图2A、图2C）【3】。所以，好工作总是能被重复的。

来自陈功团队的 Front. Cell. Neurosci 论文【3】

问题4 ：你前面说这篇 Cell 论文在实验中使用的AAV滴度过高，有大量泄露，这具体导致哪些结果或者后果呢？ 陈功 ：AAV滴度过高不仅会损伤神经元，而且会损伤胶质细胞。神经元损伤后，会退回到不成熟状态，许多基因会被上调，包括有些胶质基因，从而导致AAV携带的报告蛋白在神经元里表达，造成泄漏现象，从而误导实验结论。 问题5 ：这篇 Cell 论文是在转基因小鼠4-17天期间进行的神经元转分化观察，这一时间长度是否足够？ 陈功 ：这一时间长度显然是不够的。事实上，这篇 Cell 论文的图3L非常清楚地显示出NeuroD1组的绿色谱系示踪的胶质细胞正在发生转分化，并且已经有了许多神经元样的长长的突起，这些细胞形态和对照组的星云状胶质细胞迥然不同，很好地证明了NeuroD1在推动这些胶质细胞转分化，只要再观察1-2个月，神经转化就更清楚了，但不知道为什么作者居然停下来不再继续观察。我们团队如果看到如此明显的转分化，是一定会追踪下去的。 问题6 ：我看到你们有做基于双光子活体成像技术观察胶质细胞转分化为神经元的动态过程的研究，可以具体说一下吗？ 陈功 ：是的，我们正在做双光子活体成像追踪胶质细胞是如何原位转分化为神经元的。我们已经观察到胶质细胞在表达NeuroD1后，逐渐收缩其精细分枝，然后长出长长的神经元样的突起，一步步转变为神经元。但对照组依然保持胶质细胞形态不变。这个工作正在整理之中，准备发表。 问题7 ：你参与创立的 NeuExcell Therapeutics 近期刚完成了Pre-A轮融资，这次的争议会影响到公司目前的发展计划吗？ 陈功 ：目前没有。我们去年就知道了张春立团队的这项工作，并且也知道他们错用了有毒性的高滴度病毒，所以造成了假象。我也善意地给作者指出了问题所在。投资人大部分都知道基因治疗领域非常重视剂量效应，如果用有毒性的高剂量病毒，这种结果肯定不可靠。我们的大脑毕竟容不下太多的外源性病毒，所以，在研发过程中，我是非常强调用合适剂量的病毒来实现转分化的，因为我们必须要对病人负责。 问题8 ：对于目前的争议，您从学术角度有哪些事情要做呢？ 陈功 ：我们已经在做AAV的剂量效应，而且观察到高滴度病毒所产生的毒性，这个工作在几个月内会完成初步实验，将整理发表。在谱系示踪小鼠模型上，我们已经转化出神经元，接下来会进一步探讨为什么这篇 Cell 论文中转化不出来，是不是他们用的病毒转化效率不够高，如何改进？我们也在加速双光子活体成像实验，希望尽快发表，让大家了解胶质细胞是如何在原位一步步转化为神经元的。 最后，陈功教授表示，一篇论文是否有价值主要还是看数据是否可靠，这篇 Cell 论文用了很多转基因报告小鼠做了大量试验，大部人看不到破绽，但其实有两大硬伤： 1、整个文章的基础是建立在向脑组织注射了有毒副作用的大剂量病毒，产生了神经损伤和由此而来的假象，这在基因治疗领域是不可接受的。大剂量病毒注射产生的数据不可靠，其他设计再完美，没有安全剂量这个前提，所有的解释都是徒然。 2、这篇 Cell 论文预设转基因报告小鼠才是转分化的金标准。实际上，我们在去年发表的论文里就成功实现了转分化，但是我们惊讶地发现，经过Tamoxifen诱导Cre-LoxP 重组的tdTomato标记的胶质细胞比野生型小鼠里的没有经过转基因处理的胶质细胞要难转分化，需要表达更强的NeuroD1才能克服转分化的阻力。但是这篇 Cell 论文在遇到这些困难时没有想办法去克服，而是轻率地下结论。 因此，在发育生物学和干细胞领域，转基因报告小鼠是谱系示踪的金标准，但是对于要把胶质细胞转分化为神经元来说就不一定是金标准。科学研究一定不能被条条框框束缚了思想。 

注：《生物世界》将持续关注该领域的后续发展，也欢迎相关研究人员与我们交流沟通。

  论文链接： 1、https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.005 2、https://www.nature.com/articles/nn.2535 3、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.