热点知识 | microRNA靶基因研究方法汇总

    miRNA仅22个左右核苷酸，但是通过调控大量的靶基因在基因表达中扮演了非常重要的角色。大量研究发现，每个哺乳动物miRNA可能调控了约300个靶基因。到目前为止，仍有许多miRNA的功能并不明确。其原因在于：已经通过实验确定的miRNA靶基因数量很少，靶基因的预测和鉴定的难度又很大。

    所以科学家们结合miRNA的作用机理，利用生物信息学方法开发了不同的靶基因预测数据库供科研工作者们参考。

    以下是常用的几种基因预测生物数据库：

                                                                         01

                                                               常用miRNA靶基因

                                                                     1.Targetscan

                                      -检索步骤-

                                 1]在microrRNA name搜索框里输入具体名称即可显示结果。 

                                                2]检索结果 

                                      3]如需查询具体功能基因的上游miRNA，可在gene symbol里面输入基因名称

                                                        4]检索结果

                                                                            2.TarBase

                                                 1]如图显示:hsa-miR-107的靶基因列表 

                                                 2]如图显示:KLF4的上游miRNA列表。

                                                                                  3.miRWalk

网址：http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/

介绍：综合性的miRNA靶基因数据库，界面比较清晰，简单。收录了Human、Mouse、Rat、Dog、cow等多个物种的miRNA靶基因信息。

                                               1]可通过microRNA、功能基因进行搜索 

                                                    4]检索结果

其它网站

除了上述比较常见的三种之外，还有其他miRNA靶标预测网站可供参考：

DIANA-microTv4.0DIANA-microT-CDS

miRanda-rel2010mirBridge

miRDB4.0miRmap

miRNAMapdoRiNA

PicTar2PITA RNA22v2

RNAhybrid2.1……

                                                                                     02

                                                         鉴别靶基因类型

沃吉基因：

      可供参考的microRNA生物信息数据库很多，搜索到具体的靶基因同样很多。  那在实验体系下如何去证明影响了哪一种呢？

      接下来给大家介绍一些常见的方法。

1  荧光素酶报告系统

方法：通过将miRNA靶基因的结合位点构建到荧光素酶报告载体系统里，同时和miRNA寡核苷酸转染，观察荧光的强度变化，来判断miRNA是否作用了靶基因。

Chen, Xiaohua & Cai, Sina & Li, Baoxia & Zhang, Xiaona & Li, Wenhui & Liang, Henglun & Cao, Xiaolong & Wang, Liping & Wu, Ziqing. (2018). MicroRNA‑21 regulates the biological behavior of esophageal squamous cell carcinoma by targeting RASA1. Oncology Reports. 41. 10.3892/or.2018.6944.

特点：该方法操作繁琐、耗费时间、价格较贵，适合单个靶基因验证。不适用于靶基因大规模筛选的研究。

2   通过WB验证                                                             

方法:  WB是检测蛋白水平的金标准。miRNA调控靶基因最主要的就是影响蛋白水平，导致蛋白水平下降。因此有很多研究通过WB来验证miRNA是否会调控靶基因。

Murakami Y, Yasuda T, Saigo K, et al. Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues[J]. Oncogene, 2006, 25(17): 2537-2545.

特点：此方法抗体单价较贵、流程较复杂、周期长。因此适合少量基因的验证，不适用于大规模验证靶基因。

3   RNA结合蛋白免疫沉淀技术

方法：(RNAbindingproteinimmunoprecipitation，RIP) ，运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化对结合在复合物上的RNA进行分析。

Diana Tichy, Julia Maria Anna Pickl, Axel Benner, Holger Sültmann, Experimental design and data analysis of Ago-RIP-Seq experiments for the identification of microRNA targets, Briefings in Bioinformatics, Volume 19, Issue 5, September 2018, Pages 918–929, https://doi.org/10.1093/bib/bbx032.

特点：该方法操作流程复杂、价格昂贵、生物信息分析能力要求高。但也适用于大规模靶基因筛选的方法。

                                                                  以上三种实验方式在验证过程中

                                                            还是存在操作繁琐、耗时耗钱的问题。

4   利用靶基因的PCR Array

方法：定量PCR技术是检测基因的表达水平的金标准，很多科研文章研究发现miRNA也能影响靶基因的mRNA水平含量，利用靶基因的PCR Array就能够同时检测很多靶基因的表达水平。

以下这篇文章通过LncRNA PCR阵列筛选miR-21的靶基因，找到GAS5是miR-21的靶点。

Zhang Z, Zhu Z, Watabe K, et al. Negative regulation of lncRNA GAS5 by miR-21[J]. Cell Death & Differentiation, 2013, 20(11): 1558-1568.

特点：省时省力、经济快捷。

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