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Nature突破：可爱龙实验室揭示CRISPR-Cas系统Prespacer方向性整合机制

2021

09/30

生物世界

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这项研究为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作，尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释。

来源 | 小柯生命

2021年9月29日，美国康奈尔大学 可爱龙 团队在国际顶尖学术期刊 Nature 发表了题为： Mechanism for Cas4-assisted directional spacer acquisition in CRISPR-Cas 的研究论文。

该研究报道了 Cas4蛋白识别PAM的分子机制 ，以及其协助Cas1-Cas2对spacer前体Prespacer （ProtoSpacer） 进行方向性整合的分子机制。

这项研究为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作，尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释。

CRISPR-Cas系统 是来自于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统。类似于高等动物的细胞免疫过程。首先是CRISPR系统中的Cas1-Cas2复合物捕捉外源入侵DNA序列（如图中的噬菌体），将其整合到CRISPR Array当中去，该步骤被称为Adaptation，好比是搜集入侵者信息。然后CRISPR Array会被转录为RNA序列（pre-RNA），经过Cas蛋白加工成为较短的、成熟的指导RNA （guide RNA），再与效应器（Cas9、Cas12、Cascade等）结合成为具有靶向功能的复合物，该过程可以形象理解成是给导弹制导。最后当该序列的外源性DNA再次入侵时，效应器会迅速靶向，从而对入侵物进行精准打击，达到定点消除的目的。

在整个CRISPR-Cas领域中，靶向功能复合物的组装（导弹的制导）和定点切割外源核酸（精准打击）这两步已经研究比较多，利用这两点，基于CRISPR-Cas的基因编辑工具已经风靡全世界。然后第一步，如何搜集外源DNA信息，还有诸多疑点未解析清楚。

虽然以前有很多顶级期刊已经报道了一些有关Cas1-Cas2是如何整合外源DNA的，比如中国科学院生物物理所王艳丽研究员于2015年发表于 Cell，报道了Cas1-Cas2如何识别PAM序列【1】；美国加州大学伯克利分校 Jenifer Doudna 实验室也通过 Nature 长文也表达了类似观点。以及2017年几乎同期发表的 Nature 和 Science 的文章，分别报道了来自可爱龙研究组和 Jennifer Doudna 研究组关于Cas1-Cas2如何整合Prespacer进入CRISPR Array的分子机制。然Cas1-Cas2整合Prespacer进入CRISPR Array是具有方向性的，在Type I CRISPR-Cas系统之中，PAM链是滞后整合进入Repeat-Spacer端【2】（如下图所示），然而到目前为止其分子机制还不清楚。

2018年以来陆续有众多研究工作开始报道，Cas4对Prespacer的选择、加工以及方向性整合非常关键。同时Cas4在绝大部分的CRISPR-Cas系统中都能找到，这暗示了Cas4具有非常重要和保守的功能。然而因为Cas4是一种Fe-S cluster （铁硫簇）家族核酸酶，Fe-S对氧气异常敏感,因而很难拿到性质稳定具有活性的样品，因此Cas4相关的分子机制研究一直是一项难点。

美国康奈尔大学可爱龙教授和其实验室胡纯一博士等人，以及 Stan J J Brouns 团队，使用GsCas4-Cas1融合系统，在尝试众多纯化策略之后，最终在厌氧条件下获得了性质稳定均一，具有活力的Cas4-Cas1蛋白。再通过筛选底物，获得了均一的复合物，再结合冷冻电镜，解析了其3.1埃分辨率的复合物结构。该结构首次揭示了在Cas4共存的系统之中是由Cas4识别PAM序列，而不是由之前被认为的由Cas1负责识别PAM。

之后团队继续解析了Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer_PAM/Non PAM复合物结构。发现在这种不对称的结构中，Cas4会释放Non-PAM端，保护住PAM端。从而Non-PAM端被暴露给内源核酸酶进行迅速切割。而PAM端被Cas4保护从而无法被切割，这揭示了PAM端滞后整合的分子基础（如下图）。

以上工作解释Cas4识别PAM协助Cas1-Cas2捕捉外源DNA的分子机制，以及Non-PAM端先行切割的机制。然而还是无法完全解释Prespacer方向性整合问题。可爱龙团队通过高分辨率结构得知完整的复合物中Cas4虽然结合底物以及金属离子，然后其并未切割PAM而只是识别结合。在此基础之上，团队继续解析了一系列Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer-Target DNA半整合以及全整合结构，通过结构和生化分析，揭示了在Non-PAM端被ExoI快速加工后会迅速被整合进入CRISPR Array的Leader-Repeat端，从而形成半整合状态。在此半整合状态下，一段突出的DNA序列会结合Cas4-Cas1蛋白一块正电荷富集区，然后推动Cas4高效切割PAM，切割完成后Cas4会将末端传递给Cas1整合酶活性中心完成全整合过程（如下图所示）。

总之，该项研究首次报道了CRISPR-Cas系统中，Cas4通过识别PAM序列协助整合酶Cas1-Cas2捕捉Prespacer的分子机制，此外通过一系列结构生物学和生化方法揭示了Cas4调控的Prespacer方向性整合的一整套分子机制。

这项工作，为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作，尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释，最后附上整个Cas4系统运行机制的模式图。

可爱龙教授本科毕业于中国科技大学，后于美国攻读博士学位。之后在 Jenifer Doudna 实验室做博士后研究工作。此后十余年都是主攻RNA相关领域的分子机制，包括核酶（Ribozyme）和CRISPR-Cas。在这两个领域都取得了十分喜人的成绩。近6年，发表众多佳作，其中包括以通讯作者已经于 Nature 发表论文3篇，Cell 发表论文2篇（一篇perspective），Science 发表论文1篇，Molecular Cell 发表论文3篇（一篇comments），NSMB发表论文2篇，Nature Communications 发表论文1篇等等，是一位不可多得的高产又高质量的顶级学者。

可爱龙实验室目前有博士后职位提供，有意者请联系：ailong.ke@cornell.edu

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03951-z

参考文献：

1. Wang, J. et al. Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems. Cell 163, 840-853, doi:10.1016/j.cell.2015.10.008 (2015).

2. Jackson, S. A. et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science 356, doi:10.1126/science.aal5056 (2017).