Nature突破:可爱龙实验室揭示CRISPR-Cas系统Prespacer方向性整合机制

2021
09/30

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这项研究为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作,尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释。

来源 | 小柯生命

2021年9月29日,美国康奈尔大学 可爱龙 团队在国际顶尖学术期刊 Nature 发表了题为: Mechanism for Cas4-assisted directional spacer acquisition in CRISPR-Cas 的研究论文。

该研究报道了 Cas4蛋白识别PAM的分子机制 以及其协助Cas1-Cas2对spacer前体Prespacer (ProtoSpacer) 进行方向性整合的分子机制。

这项研究为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作,尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释。


CRISPR-Cas系统 是来自于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统。类似于高等动物的细胞免疫过程。首先是CRISPR系统中的Cas1-Cas2复合物捕捉外源入侵DNA序列 (如图中的噬菌体) ,将其整合到CRISPR Array当中去,该步骤被称为Adaptation,好比是搜集入侵者信息。然后CRISPR Array会被转录为RNA序列 (pre-RNA) ,经过Cas蛋白加工成为较短的、成熟的指导RNA (guide RNA) ,再与效应器 (Cas9、Cas12、Cascade等) 结合成为具有靶向功能的复合物,该过程可以形象理解成是给导弹制导。最后当该序列的外源性DNA再次入侵时,效应器会迅速靶向,从而对入侵物进行精准打击,达到定点消除的目的。

 
在整个CRISPR-Cas领域中,靶向功能复合物的组装 (导弹的制导) 和定点切割外源核酸(精准打击)这两步已经研究比较多,利用这两点,基于CRISPR-Cas的基因编辑工具已经风靡全世界。然后第一步,如何搜集外源DNA信息,还有诸多疑点未解析清楚。

虽然以前有很多顶级期刊已经报道了一些有关Cas1-Cas2是如何整合外源DNA的,比如中国科学院生物物理所王艳丽研究员于2015年发表于 Cell,报道了Cas1-Cas2如何识别PAM序列 【1】 ;美国加州大学伯克利分校 Jenifer Doudna 实验室也通过 Nature 长文也表达了类似观点。以及2017年几乎同期发表的 Natur和 Scienc的文章,分别报道了来自可爱龙研究组和 Jennifer Doudna 研究组关于Cas1-Cas2如何整合Prespacer进入CRISPR Array的分子机制。然Cas1-Cas2整合Prespacer进入CRISPR Array是具有方向性的,在Type I CRISPR-Cas系统之中,PAM链是滞后整合进入Repeat-Spacer端 【2】 (如下图所示) ,然而到目前为止其分子机制还不清楚。
 
2018年以来陆续有众多研究工作开始报道,Cas4对Prespacer的选择、加工以及方向性整合非常关键。同时Cas4在绝大部分的CRISPR-Cas系统中都能找到,这暗示了Cas4具有非常重要和保守的功能。然而因为Cas4是一种Fe-S cluster 铁硫簇 家族核酸酶,Fe-S对氧气异常敏感,因而很难拿到性质稳定具有活性的样品,因此Cas4相关的分子机制研究一直是一项难点。
 
美国康奈尔大学可爱龙教授和其实验室胡纯一博士等人,以及 Stan J J Brouns 团队,使用GsCas4-Cas1融合系统,在尝试众多纯化策略之后,最终在厌氧条件下获得了性质稳定均一,具有活力的Cas4-Cas1蛋白。再通过筛选底物,获得了均一的复合物,再结合冷冻电镜,解析了其3.1埃分辨率的复合物结构。该结构首次揭示了在Cas4共存的系统之中是由Cas4识别PAM序列,而不是由之前被认为的由Cas1负责识别PAM。

 
之后团队继续解析了Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer_PAM/Non PAM复合物结构。发现在这种不对称的结构中,Cas4会释放Non-PAM端,保护住PAM端。从而Non-PAM端被暴露给内源核酸酶进行迅速切割。而PAM端被Cas4保护从而无法被切割,这揭示了PAM端滞后整合的分子基础 (如下图)

 
以上工作解释Cas4识别PAM协助Cas1-Cas2捕捉外源DNA的分子机制,以及Non-PAM端先行切割的机制。然而还是无法完全解释Prespacer方向性整合问题。可爱龙团队通过高分辨率结构得知完整的复合物中Cas4虽然结合底物以及金属离子,然后其并未切割PAM而只是识别结合。在此基础之上,团队继续解析了一系列Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer-Target DNA半整合以及全整合结构,通过结构和生化分析,揭示了在Non-PAM端被ExoI快速加工后会迅速被整合进入CRISPR Array的Leader-Repeat端,从而形成半整合状态。在此半整合状态下,一段突出的DNA序列会结合Cas4-Cas1蛋白一块正电荷富集区,然后推动Cas4高效切割PAM,切割完成后Cas4会将末端传递给Cas1整合酶活性中心完成全整合过程 (如下图所示)


总之,该项研究首次报道了CRISPR-Cas系统中,Cas4通过识别PAM序列协助整合酶Cas1-Cas2捕捉Prespacer的分子机制,此外通过一系列结构生物学和生化方法揭示了Cas4调控的Prespacer方向性整合的一整套分子机制。

这项工作,为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作,尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释,最后附上整个Cas4系统运行机制的模式图。

 
可爱龙教授本科毕业于中国科技大学,后于美国攻读博士学位。之后在 Jenifer Doudna 实验室做博士后研究工作。此后十余年都是主攻RNA相关领域的分子机制,包括核酶(Ribozyme)和CRISPR-Cas。在这两个领域都取得了十分喜人的成绩。近6年,发表众多佳作,其中包括以通讯作者已经于 Nature 发表论文3篇,Cell 发表论文2篇(一篇perspective),Science 发表论文1篇,Molecular Cell 发表论文3篇(一篇comments),NSMB发表论文2篇,Nature Communications 发表论文1篇等等,是一位不可多得的高产又高质量的顶级学者。

可爱龙实验室目前有博士后职位提供,有意者请联系:ailong.ke@cornell.edu
 
论文链接:
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03951-z
参考文献:
1. Wang, J. et al. Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems. Cell 163, 840-853, doi:10.1016/j.cell.2015.10.008 (2015).
2. Jackson, S. A. et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science 356, doi:10.1126/science.aal5056 (2017).



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关键词:
方向性,PAM,复合物,机制,序列,分子

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