病理性心脏肥大相关研究!

2021
09/30

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上海启因生物
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该研究在病理性心肌肥厚的发病机制方面提出了新的认识,而且为寻找心肌肥厚/心衰的防治药物开辟了新方向。

该研究的主要创新点:从临床心肌样本、啮齿动物、原代心肌细胞等多水平发现NEU1在肥厚心肌组织中表达显著升高;通过心肌细胞特异性敲除/过表达,发现NEU1直接启动心肌肥厚/心衰;机制上,NEU1在心肌肥厚刺激下发生核转位,选择性结合GATA4,促进下游胚胎基因Nppa、Nppb转录激活;以NEU1为干预靶标,筛选发现化合物C-09可通过靶向人源NEU1改善病理性心肌肥厚,证实了抗病毒药物奥司他韦和扎那米韦改善心肌肥厚的新用途。

该研究不但在病理性心肌肥厚的发病机制方面提出了新的认识,而且为寻找心肌肥厚/心衰的防治药物开辟了新方向。

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                                                                            结果展示:

 啮齿动物和人类肥大心脏心肌细胞中神经氨酸酶 1 升高

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Figure 1:NEU1 在心脏肥大心脏组织中升高。(A) 横向主动脉收缩 4 周小鼠心脏中 NEU1、NEU2、NEU3 和 NEU4 水平的代表性蛋白质印迹和定量结果。n = 每组 3 只小鼠。(B) 接受横向主动脉收缩或异丙肾上腺素 (ISO, 2.5 mg/kg/d, s.c.) 治疗 4 周的大鼠心脏中的 NEU1 水平。n = 每组 3 只大鼠。(C) 在来自指定大鼠心脏的切片中使用抗 NEU1 抗体进行免疫组化染色。n = 每组 3 颗大鼠心脏;比例尺,20 lm。(D) 通过酶联免疫吸附试验测定小鼠肥大心脏的神经氨酸酶活性。n = 每组 6 颗心。(E)健康供体(N1-N7)和肥厚型心肌病(H1-H7)的人类心脏样本中NEU1水平的代表性WB结果(左)和定量结果(右)。n = 每组 7 个样本。(F) 来自人类心脏的 NEU1 的免疫组织化学。比例尺,50 lm。(G) 接受 TAC 4 周的小鼠心脏中 NEU1 的免疫荧光图像。心肌肌钙蛋白 T 用作心肌细胞标志物。n = 每组 3 只小鼠;(H) 来自经受横向主动脉收缩 4 周的成年小鼠的心肌细胞和非心肌细胞中的 NEU1 水平。β-actin作为内部对照,心肌肌钙蛋白T作为心肌细胞标志物。n = 每组 3 只小鼠。

神经氨酸酶1在细胞水平上促进心肌细胞肥大

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Figure 2:NEU1 的敲低保护新生大鼠原代心肌细胞免受血管紧张素 II 诱导的心肌细胞肥大。(A) 用心肌肌钙蛋白 T 染色的新生大鼠原代心肌细胞的代表性免疫荧光图像。(B 和 C) 新生大鼠原代心肌细胞中用或不用血管紧张素 II (1lM) 刺激 48 小时,NEU1 的WB和定量结果。n = 每组 3 个样本。(D 和 E) NEU1 在新生大鼠原代心肌细胞中的代表性WB和定量结果。n = 每组 3 个样本。用慢病毒编码的乱序 (shNEU1-NC) 或 NEU1 shRNA 转导新生大鼠原代心肌细胞 48 小时。shNEU1-A、shNEU1-B、shNEU1-C 和 shNEU1-D 是四种不同的 shRNA 序列。(F) 新生大鼠原代心肌细胞中 Neu1 的相对 mRNA 水平。n = 每组 3 个样本。(G) 通过酶联免疫吸附法测定的新生大鼠原代心肌细胞的神经氨酸酶活性。新生大鼠原代心肌细胞用或不用 NEU1 shRNA 转导 24 小时,然后用血管紧张素 II (11M) 刺激细胞 48 小时。n = 每组 6 个样本。(H) 新生大鼠原代心肌细胞中的唾液酸 (SA) 浓度由试剂盒测定。n = 每组 4 个样本。(I) F-肌动蛋白染色的新生大鼠原代心肌细胞形态(绿色)。细胞核用 DAPI(蓝色)染色。n = 每组 3 个样本;HPF,高功率场。(J) 新生大鼠原代心肌细胞中指定基因的 mRNA 水平。全部标准化为 18s rRNA,每组 n = 6 个样本。

Neu1CKO 减轻小鼠心脏肥大和重塑

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Figure 4:小鼠心脏中的 NEU1 过表达导致生理条件下的心脏肥大和重塑。(A) 感染AAV9-NEU1 13 周后小鼠的整个心脏的代表性总外观,用苏木精-伊红染色的心脏横截面,用罗丹明-小麦胚芽凝集素染色和 M 型超声心动图(底行)。(B 和 C) 心脏重量与胫骨长度 (HW/TL, B) 和心脏重量与体重 (HW/BW, C) 的比率。 (D)细胞横截面积的统计结果。n = 10。(E-G) 舒张期的室间隔直径 (IVSd, E)、舒张期的左心室后壁厚度 (LVPWd, F) 和超声心动图的射血分数 (EF, G)。(H)马松三色染色和小鼠心肌间质胶原的统计结果。(I和J) 通过 RT-qPCR 确定的指定组中的肥大标志物和纤维化基因。

神经氨酸酶 1 与细胞核中的 GATA4 相互作用

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Figure 5:NEU1 易位到细胞核中并与 GATA4 相互作用。(A) 新生大鼠原代心肌细胞和 H9C2 细胞核中的 NEU1 表达,以响应血管紧张素 II (1 lM) 48 小时。(B) 新生大鼠原代心肌细胞核中 NEU1 定位的共聚焦图像。新生大鼠原代心肌细胞对血管紧张素 II (1 lM) 的反应分别为 0、12、24 和 48 小时。n = 3 每组;(C) 接受横向主动脉收缩 4 周的小鼠心脏中 NEU1 和心肌肌钙蛋白 T 的免疫荧光图像。每组 n = 3。(D) 可以与 NEU1 相互作用的 12 种转录因子的相对丰度。(E) NEU1 和 GATA4 在新生大鼠原代心肌细胞中的免疫共沉淀。(F) 通过表面等离子体共振测试的 NEU1-GATA4 相互作用。(G 和 H) 在 Nppa (G) 和 Nppb (H) 启动子处的 GATA4 占有率在通过 ChIP 转染 NEU1 shRNA 质粒的新生大鼠原代心肌细胞中。每组 n = 3。(I) 测定了 HEK293T 细胞提取物的荧光素酶活性。用 GATA4 质粒、Nppa 启动子荧光素酶报告质粒和 NEU1 shRNA(左)或 NEU1 全长质粒(Lenti-NEU1,右)转染细胞。每组 n = 9。(J) NEU1 介导的心脏肥大的机制。

C-09 被筛选为新型人神经氨酸酶 1 抑制剂,抗病毒药物扎那米韦和奥司他韦保护心肌细胞免于肥大

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1826163297253044530641632972554372Figure :6:C-09 和 C-12 可防止小鼠横向主动脉收缩引起的心脏肥大和重塑。(A) 示意图显示筛选人类 NEU1 抑制剂的策略。在主导结构图像中,红色构象状态占65%的频率;绿色,22% 频率;蓝色,4% 频率;和黄色,3% 的频率。(B) AutoDock 预测的 C-09 和 C-12 与人类 NEU1 的结合模式。(C) 治疗方案。(D) 全心的代表性总体外观(比例尺,1 毫米)、用苏木精-伊红染色的心脏垂直切片、用异硫氰酸荧光素-小麦胚芽凝集素划定的细胞边界、马松染色和来自小鼠的 M 型超声心动图。(E) 心脏重量与胫骨长度 (HW/TL,向上) 和心脏重量与体重 (HW/BW,向下) 的比率。n = 9, 9, 10, 10, 9, 9 只小鼠,从左到右。(F) 细胞横截面积的统计结果。n = 8。(G) 心肌间质胶原的统计结果。n = 每组 3 个样本。(H 和 I) 心脏样本中指定基因的 mRNA 水平。

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关键词:
血管紧张素,NEU1,病理性,研究,心脏

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