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导读
牛奶是全球人类饮食中营养丰富的乳制品。瘤胃保护蛋氨酸（RPM）被广泛用于提高奶牛泌乳性能，但是关于RPM对乳营养成分的影响目前仍然知之甚少。在本研究中，作者选择20头泌乳中期奶牛，连续8周添加20 g m/d的RPM，用于调查乳营养成分对RPM的反应。采用代谢组学方法分析牛奶代谢物，16S rRNA基因组测序用于分析奶牛瘤胃微生物组成。结果显示，添加RPM后，乳脂含量和产量显著增加。共鉴定出15类443种代谢物，其中15种代谢产物发生了显著变化。添加RPM后，牛奶中的功能性营养物质α-酮戊二酸显著增加，此外，作者在瘤胃中发现了48个差异显著的细菌属。多组学综合分析表明，Acetobacter、Saccharofermentan和unclassified_f_Lachnospiraceae的丰度较高，这有助于乳脂的改善。此外，Thermoactinomyces、Asteroleplasma和Saccharofermentan的丰度与牛奶中较高的α-酮戊二酸呈正相关。研究结果揭示了奶牛在添加RPM后牛奶中的代谢途径和关键功能代谢物，以及与之相关的关键瘤胃细菌。这些发现为开发富含功能性营养素α-酮戊二酸或高乳脂的功能性乳制品提供了新的思路。
原名：Multi-omics Revealed the Effects of Rumen-protected Methionine on The Nutrient Profile of Milk in Dairy Cows
译名：多组学研究揭示了瘤胃保护蛋氨酸对奶牛乳汁营养成分的影响
期刊：Food Research International
IF：6.475
发表时间：2021.9.1
通讯作者：孙会增
通讯作者单位：浙江大学动物科学学院
添加RPM后泌乳性能的变化如表1所示。第0周和第8周之间的牛奶产量（P=0.55）和蛋白质产量（P=0.55）没有显著差异，而乳脂产量（1.44 vs. 1.61kg/d；P=0.02），ECM（41.3 vs. 42.6kg/d；P=0.05）和FCM（39.7 vs. 42.4 kg/d；P=0.03）与第0周的数据相比在第8周显著增加。蛋白质浓度在第8周趋于降低（P=0.06）；然而，脂肪浓度增加了10%（3.88 vs. 4.27；P=0.01），总固体也随着RPM的增加而增加（P=0.01）。第0周和第8周的乳糖（P=0.97）、MUN（P=0.74）和SCC（P=0.21）无差异。
1ECM:能量校正产奶量，ECM=0.3246×产奶量+13.86×乳脂量+7.04×乳蛋白量；FCM:脂肪校正奶，FCM=产奶量×0.432+乳脂量×16.216；MUN=乳尿素氮；SCC=体细胞计数。
经过质量控制，牛奶中的443种代谢物被鉴定和定量（表S2）。根据3D-PCA图（图1a）和PLS-DA图（图1b）观察第0周和第8周之间的区别趋势。这些代谢物被分为15个代谢物组，前4组占总代谢物的60%（图1c）。氨基酸和代谢组学最丰富，占总代谢物的20%，含有89种代谢产物。有机酸及其衍生物占16%，含有72种代谢产物。甘油磷脂占14%，含有62种代谢产物。脂肪酰基占10%，含有44种代谢产物。热图显示了第0周和第8周基于前100种代谢物的明显差异（图1d）。此外，在第0周和第8周之间，根据预测的VIP>1（变量投影重要性）和P<0.01，识别出15个SDM（显著差异牛奶代谢物）（表S3；图2a和2b）。四种代谢物，包括烟酰胺-氮氧化物（VIP=5.58，P=0.0004，fold change=2.51）、胞苷（VIP=1.87，P=0.002，fold change=2.36），α-酮戊二酸（AKG；VIP=1.70，P=0.002，fold change=2.23），以及Phe-Val小肽（VIP=2.74，P=0.03，fold change=2.08），在第8周比第0周更高（图2b）。第8周上调的代谢产物主要参与了D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（P=0.02）、精氨酸生物合成（P=0.04）、丁酸代谢（P=0.04）和柠檬酸循环（P=0.05）代谢途径（图2c）。此外，有11种代谢物在第0周表达量更高（图2b），并且这些代谢物仅在丙酸酯代谢通路中显著富集（P=0.007，图2c）。
图1 添加瘤胃保护蛋氨酸（RPM）的奶牛乳中代谢组学特征。（a）第0周至8周牛奶代谢组的主成分分析（PCA）；（b）第0-8周牛奶代谢组的PLS-DA分析；（c）饼图表示添加RPM的奶牛乳汁中所鉴定的代谢物种类的数量和百分比；（d）热图显示第0周和第8周前100种代谢物的差异。
图2 基于变量投影重要
性（VIP）>1，
P
<0.05的显著差异代谢物。
（a）十五种明显不同的代谢物及其名称的散点图；
（b）第0周和第8周之间每个明显不同的代谢物峰面积（转化后的Log
10
）的箱线图，黄点代表每个代谢物的平均值；
（c）第8周（左）和第0周（右）较高的显著不同代谢物富集的KEGG通路。
。瘤胃发酵参数的结果如表2所示。与第0周相比，第8周总VFA浓度趋于更高（第0周115 vs. 第8周124 mmol/L；P=0.07）；乙酸盐（71.1vs. 76.6 mmol/L；P=0.04）和丙酸盐（26.4 vs. 30.0 mmol/L；P=0.02）的含量更高，戊酸盐（1.63 vs. 1.42 mmol/L；P=0.02）较低。与第0周相比，第8周的Chao1指数更高（P=0.09），Shannon指数在第0周和第8周之间没有差异（图3a）。PCoA在属水平上没有显示第0周和第8周之间瘤胃菌群的明显差异（图3b）。第0周和第8周的细菌群落组成在科和属水平上没有明显差异（图3c）。LDA结果显示，在第0周和第8周之间，有83个科水平细菌类群和48个细菌属有显著差异（图3d；表S4）。在属水平上，19个SDB（显著差异瘤胃细菌）的相对丰度在第8周较高，包括Acetobacter（P=0.03）、unclassified_f_Lachnospiraceae（P=0.01和Saccharofermentan（P<0.01），29个SDB种在第0周较高（图3d）。表2 第0周和第8周添加瘤胃保护蛋氨酸的奶牛瘤胃发酵参数。
图3 添加瘤胃保护性蛋氨酸后奶牛瘤胃细菌的变化。
（a）属水平α多样性的变化；
（b）属水平β多样性的变化；
（c）科和属水平的群落组成分析；
（d）在门到属水平上存在显著差异的细菌分类群，LEfSe检验显著性差异，LDA>2，
P
<0.05。此外，通过Spearman相关分析，在第8周和第0周观察到瘤胃中的高丰度SDB和牛奶中SDM之间的相关性（表S5），该相关性的P值在表S6中给出。Thermoactinomyces（r=0.44，P=0.006）、Asteroleplasma（r=0.45，P=0.004）和Saccharofermentan（r=0.44，P=0.006）与α-酮戊二酸呈显著正相关，unclassified_Absconditabacteriales（r=-0.54，P=0.0004）与α-酮戊二酸呈显著负相关（图4）。
图4 添加RPM后奶牛乳中差异显著细菌和差异显著代谢产物之间的Spearman相关性，*表示P<0.01。
瘤胃保护蛋氨酸是奶牛场使用最广泛的添加剂。尽管研究者已经进行了大量关于RPM对奶牛影响的实验，但是对牛奶营养成分的影响很少有研究，这对牛奶加工和人类健康很重要。牛奶营养成分很容易受到遗传的影响，因此动物之间高度个体差异可能会影响研究者发现奶牛对RPM添加的真实反应。因此，本研究选择了相同的奶牛，并进行质量控制研究，以避免个体差异的影响。饲料组学已逐渐被用于研究奶牛产奶量和产奶质量等课题，本研究应用牛奶代谢组学方法，对添加RPM的奶牛乳中代谢物组进行研究。此外，作者检测了瘤胃微生物群的16S rRNA基因用于观察RPM添加后瘤胃微生物的群落组成。泌乳中期奶牛的产奶量呈平稳缓慢下降趋势，该阶段奶牛具有相对稳定的生理状态和乳成分。此外，有研究分析了大批奶牛（n=334）的瘤胃细菌组成，没有观察到泌乳效应（泌乳天数）对细菌组成的影响。因此，本研究观察到的奶牛泌乳性能改善和微生物群落显著改善应归因于RPM的添加。
AAs是合成乳蛋白的基本底物。许多研究发现，添加RPM会提高牛奶蛋白的产量。然而，目前的研究表明添加RPM后牛奶蛋白的变化有限。这与泌乳阶段和试验奶牛的状况有关。Patton等通过对129项蛋氨酸添加试验的meta分析发现，奶牛的反应因试验长度和泌乳阶段的差异而不同。以往的研究多在奶牛泌乳早期或围产期添加Met，这一时期奶牛产奶量较高，易发生代谢紊乱，因此，养分供应往往不足。在这些时期，蛋白质对添加RPM的反应十分重要。本研究的奶牛处于泌乳中期，营养供给和生理状态较为稳定。此外，本研究奶牛的乳蛋白含量已经很高，因此，改进的空间有限。乳脂是牛奶品质评价的另一个指标，含有大于400种不同的脂肪酸。因此，乳脂是多种脂肪酸的良好来源，它由66%的饱和脂肪酸、30%的单不饱和脂肪酸和4%的多不饱和脂肪酸组成，在人体营养和健康中发挥着重要作用。在本研究中，添加RPM可使乳脂浓度增加10%，这可能是乙酸浓度增加所致。乙酸作为乳脂合成的前体之一，可直接参与乳腺中乳脂的合成，因此乙酸浓度的增加可能有助于乳脂的合成。此外，乳脂含量较高的原因可能是由于Met是重要的甲基供体，能够参与极低密度脂蛋白和胆碱的合成；极低密度脂蛋白可以直接参与乳脂的合成，胆碱被认为是乳脂合成的限制性营养物质。综合来看，可以通过在泌乳中期添加RPM来生产高脂牛奶。牛奶代谢组学研究发现添加RPM后AKG显著增加。AKG是三羧酸循环中的关键中间代谢产物，三羧酸循环是为油脂和脂肪酸合成提供底物的重要代谢过程，这一结果与乳脂的增加相一致。此外，AKG作为谷氨酸和谷氨酰胺的前体物质，也是一种抗氧化物质，在清除生物体内活性氧方面具有重要作用。许多研究表明，AKG能提高抗氧化能力，缓解氧化应激。代谢途径的富集分析也支持了本研究结果。D-谷氨酰胺、D-谷氨酸和精氨酸可以通过提高抗氧化酶的合成来缓解氧化应激，如谷胱甘肽。牛乳腺由于大量挤奶容易发生代谢应激反应，因此，AKG越高表明添加RPM有利于降低牛乳腺的氧化应激过程；与此一致，第8周的腺嘌呤和β-双酰胺单核苷酸水平较低，都表明细胞DNA损伤减少。AKG作为一种饲料添加剂和有益产品，已广泛应用于增加人类的营养和健康。例如，AKG对年龄相关性疾病、创伤、术后恢复等营养性疾病均有积极作用。AKG被证明能有效改善医学上的健康、生长性能、氮利用和氧化系统。综上所述，结果表明奶牛添加RPM后，可能随着乳脂和AKG的增加而改善牛奶的功能。这些发现为开发功能性乳制品提供了新的见解和潜在的研究策略。牛奶中的营养成分与瘤胃发酵产物密切相关，主要来源于瘤胃内细菌对饲料的降解。作为脂肪酸合成的底物，本研究中瘤胃乙酸在第8周显著升高，与较高的乳脂含量相一致。16S rRNA基因测序结果表明，瘤胃细菌Acetobacter、unclassified_f_Lachnospiraceae和Saccharofermentan在第8周对乙酸的贡献率较高。Acetobacter是通过氧化糖类产生乙酸的主要细菌，本研究中Acetobacter相对丰度的增加与瘤胃液中较高的醋酸含量相一致。另外两个增加的细菌属（unclassified_f_Lachnospiraceae和Saccharofermentan）的主要发酵产物也是乙酸酯。此外，Thermoactinomyces、Asteroleplasma和Saccharofermentan与AKG呈正相关，而unclassified_Absconditabacteria与AKG呈负相关。Thermoactinomyces最早从腐烂的秸秆和粪便中分离得到，被誉为能够消化秸秆中纤维等广泛难降解的代谢物。奶牛日粮中含有丰富的纤维，会在瘤胃中降解为乙酸盐。Saccharofermentan已被报道是一种能将葡萄糖转化为乙酸的厌氧革兰氏阴性菌。AKG是脂类合成的重要中间代谢产物，因此，AKG与Thermoactinomyces和Saccharofermentan之间的正相关可能是因为它们能够产生更多的乙酸盐用于乳脂合成，从而节省更多的AKG用于牛乳的分泌。综合来看，这些微生物在瘤胃中的生物学效应可能有助于牛奶中AKG的升高。然而，这些细菌影响AKG的机制仍有待进一步研究。本研究首次利用牛奶代谢组学和瘤胃微生物16S rRNA基因测序等多组学方法，研究RPM添加对牛奶营养成分的影响，并探讨了与之相关的瘤胃微生物中的关键细菌。结果显示，在泌乳中期奶牛饲料中添加RPM显著改变了牛奶成分，特别是改善了牛奶脂肪含量和AKG。瘤胃微生物中
Acetobacter
、
unclassified_f_Lachnospiraceae、Saccharofermentan和Thermoactinomyces可能通过在瘤胃中产生乙酸促进乳脂和AKG的增加。研究结果表明，添加RPM作为生产富含乳脂和AKG牛奶的方法，可能为开发功能性乳制品提供了潜在的新方法。然而，添加RPM对后续乳制品加工的影响，以及鉴定出的关键细菌如何影响牛奶的营养成分仍需在今后的研究中进行探讨。
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