编译：微科盟艾奥里亚，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
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导读
最新的研究表明，肠道微生物组与包括痛风在内的关节炎疾病之间存在关联。然而，哪些肠道细菌能够影响以及如何影响宿主痛风期间尿酸降解和炎症的发生仍不清楚。本研究中，我们对102例痛风患者和86例健康对照者的307份粪便样本进行了宏基因组分析。痛风患者的宏基因组与健康对照组的宏基因组之间存在显著差异。痛风患者中的普雷沃菌属（Prevotella）、梭杆菌属（Fusobacterium）和拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度增加，而肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌和产丁酸盐菌种的相对丰度降低。在功能上，痛风患者果糖、甘露糖代谢和脂质A生物合成相关基因丰度较大，而尿酸降解和短链脂肪酸产生相关基因丰度较低。宏基因组物种、功能和临床参数之间三管齐下的关联揭示了肠杆菌科物种的丰度降低与氨基酸代谢降低以及环境感知减少有关，这共同促成了痛风患者血清中尿酸和C反应蛋白水平的升高。基于三个肠道微生物基因的随机森林分类，发现队列和验证队列中均表现出对痛风的高预测性（准确度为0.91和0.80），在其他慢性疾病的背景下具有高特异性。纵向分析显示，降尿酸和抗炎药治疗24周后可恢复部分肠道菌群。与肥胖、2型糖尿病、强直性脊柱炎和类风湿性关节炎的比较分析表明，痛风患者的宏基因组与自身免疫性疾病更相似，而非代谢性疾病。本文结果表明，肠道微生态的失调与宿主尿酸降解失调和全身炎症有关，这可能作为痛风的非侵入性诊断标志物。
原名：Metagenomic analysis revealed the potential role of gut microbiome in gout
译名：宏基因组分析揭示了肠道微生物群在痛风中的潜在作用
期刊：npj Biofilms and Microbiomes
IF：7.290
发表时间：2021.8.9
通讯作者：黄清春＆黄闰月＆王璋
通讯作者单位：广州中医药大学附属第二医院；华南师范大学生命科学学院生态科学研究所
我们对188例个体的307份粪便样本进行了宏基因组测序。在基线期，我们在2016-2017年收集了140例发现队列样本，这其中包括77例痛风患者和63例健康对照。2018年验证队列共采集48例，包括25例痛风患者和23例健康对照。此外，在3个随访时间点（基线期后第2、4和24周）从发现队列的痛风患者中纵向采集70、40和9份粪便样本，以评估治疗干预对痛风患者肠道微生物菌群的影响。与对照组相比，痛风患者的炎症水平和肾指数升高，这包括
C
反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）、血清尿酸（SUA）和血肌酐（SCr）（表1）。痛风患者的体重指数（BMI）较高，这与痛风与肥胖之间相关的观点相一致。此外，治疗后痛风患者的CRP、ESR、SUA和其他痛风相关指数下降（包括视觉模拟量表（VAS）、关节痛、关节肿胀评分和关节压痛评分）。与之前的研究结果一致，在发现列队中，痛风患者微生物的基因丰富度和多样性均低于健康对照组人群（图1a-b）。β-多样性分析显示，痛风组和对照组样本之间微生物群落的差异比各组内微生物群落的差异表现出小幅度但显著的增加现象（发现队列：P = 0.0069，平均值：0.796 vs 0.803，中位数：0.805 vs 0.810，图1d；验证队列：P = 1.618e-11，平均值：0.541 vs 0.565，中位数：
0.536 vs 0.560
）。考虑到报告的肠型与疾病相关，我们进一步探究了发现队列中所有样本的肠型。肠型是解释样本肠道微生物组成变异性的主要因素（P < 1e-04，R2 = 0.046），PC1与肠型显著相关（P = 2.16e-20）。然而，在痛风患者和对照组人群之间未观察到肠型分布的显著差异（P = 0.8541）。当样本由PC2和PC3排序时，我们在发现队列（P < 0.001，
R2
=0.035；图1e）和验证队列（P < 0.001，R2 = 0.063；）中发现，肠道微生物组成和痛风之间存在显著相关性。在发现队列中，PC3与痛风之间显著相关（P = 2.01e-07）。这些研究结果提示我们，当解释肠型时，疾病状态成为与肠道菌群相关的主要因素之一。在可能影响肠道微生物组的所有人口统计学因素中（年龄、BMI、饮酒、使用益生菌、素食），只有BMI在痛风患者和健康对照患者之间表现出显著差异，因此将其作为混杂因素纳入统计分析。基于
PERMANOVA
，总体肠道微生物组与BMI无显著相关性（P = 0.2006，R2 = 0.008）。利用所有人口学因素进行MaAsLin分析表明，Geodermatophilus与BMI相关，Paraburkholderia和
Histophilus
与饮酒相关，
Varibaculum
、
Dakarella
和
Sutterella
与益生菌的使用相关（P < 0.25）。其中只有Sutterella在痛风患者和对照组人群之间差异显著（P < 0.05），这暗示了其与痛风的相关性可能归因于益生菌的使用。
图1 痛风患者肠道微生物的改变。a基于Chao2估计的健康对照人群（n = 63）和痛风患者（n = 77）基因计数的稀疏曲线；b健康对照组人群和痛风患者基因计数的箱线图；c-d分别表示在基因水平上的α多样性（Shannon指数）和β多样性（Bray-Curtis距离）的箱线图；e基于基因相对丰度谱的主成分分析（PCA），图中的椭圆代表95%的置信区间；f拟杆菌门/厚壁菌门比值；g-i分表代表痛风患者组和健康对照组之间，在门水平上（g，前3），属水平上（h，前30）和种水平上（i，前30）差异微生物的相对丰度，属或种水平上的微生物类群其颜色按门水平上的归属进行着色。
进一步，我们确定了与痛风相关的肠道微生物分类群。在发现队列（n = 140）中，我们共鉴定出18个细菌门、415个细菌属和861个细菌种。在门水平，拟杆菌门（Bacteroidetes，P = 0.022）和梭杆菌门（Fusobacteria，P = 0.0183）相对丰度在痛风患者中增加，而变形菌门（Proteobacteria，P = 0.0183）相对丰度减少（图1g）。痛风患者中拟杆菌门与厚壁菌门（Firmicutes）的比例较高（P = 0.0098；图1f）。痛风患者和对照组人群之间110个属和223个种的丰度存在显著差异（P < 0.05；图1h-i）。拟杆菌属（Bacteroides，3个菌种）、普雷沃菌属（Prevotella，13个菌种）和梭杆菌属（Fusobacterium，4个菌种）中的差异性菌种在痛风患者中富集。据报道，拟杆菌在痛风患者的肠道菌群中富集；P. copri，（P = 0.0169）在类风湿性关节炎患者（RA）中增加，在结肠炎小鼠模型中具有促炎性。具核梭杆菌（F. nucleatum，P = 0.0035）同样具有促炎性，有利于结直肠癌的发生。相比之下，几种产丁酸盐的菌种，如Roseburia spp.（3个菌种）、Coprococcus spp.（3个菌种）、
Eubacterium
spp.（3个菌种）、F. prausnitzii和产丁酸盐细菌SS3/4在健康对照组人群中富集；据报道，这其中的许多菌种都具有潜在的抗炎作用。此外，据报道降解尿酸的肠杆菌科成员，如埃希菌属（Escherichia spp.，2个菌种）、克雷伯菌属（Klebsiella spp.，7个菌种）、肠杆菌属（
Enterobacter
spp.，9个菌种）和Citrobacter spp.（7个菌种），在健康对照人群中富集（P < 0.05），这些细菌可能有助于减少健康个体尿酸的蓄积。我们选取了223个显著不同种属中的128个在验证队列中进行了验证。作为基于基因的分类学分析的补充，我们使用MetaPhlAn3进行了基于读长的分类学分析，确定了12个门、194个属和485个种。这其中有8个细菌门，29个细菌属，43个细菌种与痛风相关（P < 0.25），这其中包括上述所提及的粪杆菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、普雷沃菌属、梭杆菌属和埃希菌属等关键分类群
。主成分分析（PCA）显示，与对照组人群相比，痛风患者的肠道微生物功能特征显著改变（P < 0.001，R2 = 0.036；PC1，P =0.0008；PC2，P = 0.0043）。总体而言，7289个
KEGG
同源物（KOs）中共有2666个在痛风患者和对照组之间表现出差异丰富（对照组人群和痛风患者中分别有2260和406个KOs被富集；P < 0.05）。这对应于发现队列中基于报告基因评分（|报告基因评分| > 1.65）显示显著差异的40个KEGG通路和129个KEGG模块，其中9条通路在验证队列中具有显著性。总体而言，痛风患者的碳水化合物代谢（4条通路）、能量代谢（3条通路）、萜类和聚酮代谢（3条通路）以及其他次级代谢物的生物合成（3条通路）的丰度更高，而健康对照富集了细胞运动通路（2条通路）和外源性物质生物降解和代谢通路（2条通路）。先前的研究曾发现，肠道菌群参与了痛风患者尿酸降解的失调。我们观察到健康对照人群尿酸降解基因的丰度更高（P < 0.05；图2a-b），其主要微生物贡献者是肠杆菌科（P < 0.05，图2c），其中克雷伯菌与尿酸盐降解KOs的相关性最高（平均Spearman秩相关= 0.53）。此外，SUA与肠杆菌科（r = -0.24，P = 0.0043）和克雷伯菌（r = -0.23，P = 0.0057，图2d）呈负相关，这支持了肠杆菌科成员可能导致尿酸降解。尽管趋势相同，但这些相关性在痛风患者或健康人群内并未表现出统计学差异。先前的研究表明，肠杆菌科的许多物种都具有降解尿酸使其作为氮和碳源的能力。相应地，我们在KEGG中分析了1135个完整细菌基因组中尿酸降解途径中KOs的分布。变形菌门（706种）是主要贡献者，其中尿酸降解KOs最大的科是肠杆菌科（119种）。这些结果表明肠杆菌科细菌可能参与肠道内尿酸的降解，维持人体尿酸的稳定性。膳食纤维可被肠道菌群发酵生成短链脂肪酸（SCFAs）。除SCFAs被广泛研究的慢性炎症性疾病（如炎症性肠病、哮喘和过敏）外，SCFAs也可能对痛风的炎症产生影响。据报道，丁酸盐能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶和降低MSU诱导的IL1β、IL-6和IL-829的分泌来抑制急性痛风关节炎。在痛风小鼠模型中，乙酸盐还显示可促进MSU诱导的炎症反应的消退。本研究队列中，SCFAs产生菌种在健康对照中富集，我们分析了SCFAs产生中编码关键酶的基因丰度，发现健康对照人群中负责丙酸盐和丁酸盐生物合成的基因相对丰度较高，而乙酸盐生物合成的基因未显示显著差异。
据报道，脂多糖（LPS）在免疫稳态中起着至关重要的作用，并可能参与到痛风相关炎症中。我们在痛风患者中观察到LPS生物合成和脂质A生物合成中的基因被富集。脂质A生物合成的主要贡献者是拟杆菌属和普雷沃菌属，两者均在痛风患者中被富集。相反，来自变形菌门（P = 0.017）的脂质A生物合成基因在健康对照中升高，包括大肠杆菌（E. coli，P = 0.005）和肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae，P = 0.014）。据报道，由肠杆菌科细菌产生的类脂A有6条酰基链，可能是一种有益的先天性免疫激活剂，这与由拟杆菌和普雷沃菌产生的类脂A在结构上存在差异（这两种细菌存在4或5条酰基链），而后者所产生的类脂A可能抑制先天性免疫激活和内毒素耐受。因此，我们推测，这两种不同亚型之间存在脂质A生物合成的转换，最终导致痛风炎症的发生。据报道，大肠杆菌通过LPS抑制关节炎；克雷伯菌属在自身免疫性疾病中（包括类风湿性关节炎（RA）和类风湿性脊椎炎（AS））被耗尽，这同样支持了我们的猜测。
图2 与痛风相关的和尿酸降解有关的微生物基因功能。a尿酸降解的KEGG模块；b尿酸盐降解中涉及的KOs的相对丰度，其中绿色代表在健康对照人群中富集，无色方框或黑色KOs则表示无差异，灰色方框表示在样本中未检出；c痛风相关细菌属和尿酸降解相关KOs之间的相关性（红色和紫色分别为正相关和负相关），“+”，“*”，“#”分别表示在0.05，0.01和0.001水平上具有显著性差异；d SUA与肠杆菌科或克雷伯菌之间的相关性。
进一步了解哪些肠道微生物分类群和功能与痛风患者的临床参数相关。基于微生物基因水平谱的PERMANOVA分析发现，疾病状态（痛风与健康）是最强的因素（无论是在PERMANOVA中的P值还是在R2方面），其次是SCr、SUA和CRP（P < 0.05）。对微生物种类、功能和临床参数进行了三管齐下的相关性分析（图3）。与PERMANOVA一致，SUA和CRP与微生物种类和功能通路表现出最强的相关性。SUA与25种痛风患者中富集的菌种呈正相关关系，而与22种对照人群中富集的菌种呈负相关，这其中有20种属于变形菌门。CRP与40个痛风患者中富集的菌种呈显著正相关关系，与38个对照人群中富集的菌种呈负相关关系。尤其是来自肠杆菌科的变形菌属，与氨基酸代谢、苯甲酸降解和细胞运动（如鞭毛组装和趋化）途径呈正相关关系，而与SUA和CRP均呈负相关关系。相反，来自厚壁菌门和拟杆菌门的在痛风患者中富集的菌种与痛风富集功能途径之间表现出中度的相关性，这些通路包括碳水化合物代谢、能量代谢和脂质A生物合成等。这些结果表明，肠杆菌科细菌丰度的降低可能导致氨基酸代谢和环境感知功能潜力的降低，共同导致痛风患者尿酸的增加和全身炎症的发生。鞭毛组装和细菌趋化中微生物基因的耗竭与之前在AS和2型糖尿病（T2D）中的发现一致。当控制BMI时，本研究所发现的相关性模式大部分都持续存在。SCr和估计的肾小球滤过率（eGFR）两项肾功能指标分别与9个和8个菌种相关。很少有种属与ESR、尿素和年龄相关。
图3 细菌种类、KEGG通路和临床参数的三管齐下关联热图。其中左侧表示细菌种类和临床指数之间的显著Spearman相关性分析（P <0.05），分别以红色、蓝色和灰色代表正相关关系、负相关关系或非显著相关关系；上方表示KEGG通路与临床指数之间的显著相关性分析（P <0.05）；下图表示痛风患者和对照组人群中KEGG通路富集的功能类别和方向性，其中绿色、红色和灰色分别代表在健康对照人群中富集的菌种、痛风患者中富集的菌种以及无显著差异的菌种；右图表示痛风和对照人群中富集的科水平上的类别和方向性，其中绿色、红色和灰色分别代表在健康对照人群中富集的菌种、痛风患者中富集的菌种以及无显著差异的菌种；居中的热图表示每个物种和给定KEGG通路内所有KOs之间的中位Spearman相关系数，通过减去物种和通路外所有其他KOs之间的中位Spearman相关系数（红色：正相关；紫色：负相关）调整背景分布。
痛风患者和健康对照组人群之间截然不同的微生物差异促使我们研究肠道微生物组是否有可能区分痛风患者和健康对照组人群。在发现队列中采用随机森林模型，基于微生物基因水平谱构建疾病分类器。前100个在丰度上具有差异的基因被纳入疾病分类器。基于10倍交叉验证的特征选择后，最终我们保留了3个性能最佳的基因（基因ID：15049[exo-α-sialidase]、415936[N-6 DNA methylase]和1697136[relaxase/mobilization nucleasedomain-containing protein]），据此建立了分类模型（图4a）。在发现队列中，这三个基因在痛风患者中均显著富集（图4b，P < 3.76e-7），其中两个基因（15049和415936）在验证队列中表现出增加趋势。发现队列和验证队列的受试者工作曲线下面积（AUC）分别达到0.91和0.80（图4c-d）。为了评估这些标记物的痛风特异性，我们检索了AS（n = 211）、RA（n = 169）、T2D（n = 268）和肥胖（OB，n = 200）的公共病例对照组宏基因组测序数据，使用相同的流水线处理这些数据集，并评估了三种基因在患者和对照组之间的区分潜力。这些队列的AUC范围为0.50-0.54，表明这三个基因标记物具有痛风特异性（图4e）。这3个基因分别被注释为F. mortiferum（种水平）、拟杆菌属（属水平）和拟杆菌属（属水平）。F. mortiferum在痛风患者中显著升高（P = 5.53e-4），同时所有差异拟杆菌属也在痛风患者中富集，这支持了基因标记物在痛风生物学中潜在的重要性。
图4 痛风的肠道宏基因组分类器。a在发现队列中基于微生物基因的相对丰度构建的训练模型，其中所有微生物基因根据其可变的重要性进行排序，然后依次加入模型中，图中灰线代表分别进行的5次训练，黑色曲线表示5次训练的平均交叉验证误差，红线代表标记优化模型中的基因数量；b发现和验证队列中三种微生物基因标记物的相对丰度*，**，***分别代表在0.05，0.01和0.001水平上具有显著差异；c-d分别表示发现样本和验证样本受试者的工作曲线（ROC）；e表示使用三种痛风相关基因标记的痛风ROCs和强直性脊柱炎（AS）、肥胖（OB）、风湿性关节炎（RA）和2型糖尿病（T2D）的4个公共病例对照宏基因组数据集，每种疾病的AUC在括号中显示。
先前的研究已经证明了治疗药物对肠道微生物群的影响。我们评估了在基线后2周（2W，n = 61）、4周（4W，n = 38）和24周（24W，n = 7）三个时间点接受治疗干预的痛风患者的肠道微生物组动力学。其中大多数患者接受降尿酸和抗炎药。由于部分患者非常规药物使用，我们分别从2W、4W和24W三组中排除了9、2和2份粪便样本。痛风患者在药物干预期间微生物基因数量和Shannon指数无明显改变。然而，PCoA分析显示24W患者的粪便样本与其余患者样本分离，更接近于健康对照人群（图5a）。同样，24W时的样本与基线样本的Bray-Curtis相异度显著高于2W或4W与基线样本的Bray-Curtis相异度（0W-2W vs 0W-24W，P = 0.0023；0W-4W vs 0W-24W，P = 0.0017；图5c），这表明干预对24W患者肠道微生物组的影响更大。考虑到不同时间点的不匹配样本量可能会使结果产生偏倚，我们在所有患者中选择了5例痛风患者，这些患者在所有4个时间点均采集了粪便样本，结果与使用所有样本的结果一致（图5b）。与基线相比，24W时22种细菌（包括9种痛风富集菌种）的丰度降低，而8种菌种（包括2种对照富集菌种）增加（图5d）。在功能上，基线时与对照组相比，在痛风患者中显著改变的10个KEGG通路在24W时显示出显著的逆转趋势（图5e）。这些结果表明，降尿酸和抗炎药物可能在治疗24周时部分恢复肠道微生物。通过单药抑制实验，已证明治疗痛风的药物（包括苯溴马隆、别嘌呤醇、秋水仙碱、塞来昔布和依托考昔）在体外可影响肠道细菌生长。考虑到本研究中大多数同时接受降尿酸和抗炎药物的痛风患者的药物相互作用，这些药物与肠道菌群之间可能存在更复杂的体内关系。由于我们研究的观察性质，特定药物对肠道微生物组的影响需要在更大队列的干预性临床试验中进一步研究。
图5 通过对痛风的治疗干预来改变肠道微生物群。a治疗前后健康对照人群和痛风患者在基因水平上基于Bray-Curtis距离进行的PCoA分析（0W，n = 77；2W，n = 61；4W，n = 38；24W，n = 7），其中图中椭圆代表所有亚组数据95%的置信区间；b对健康对照人群和5个时间点配对的痛风患者在基因水平上基于Bray-Curtis距离进行的PCoA分析，其中图中椭圆代表所有亚组数据95%的置信区间；c代表治疗前后痛风患者β多样性的箱线图；d治疗24周后调节的细菌种类的相对丰度（n = 7），图中绿色和红色细菌种类分别代表发现队列中健康对照人群中富集的菌种和痛风患者中富集得到菌种；e治疗后微生物基因功能发生改变，其中紫色代表在健康对照人群或接受治疗的患者中富集的基因功能，红色代表治疗前在患者中富集的基因功能。
7 痛风与其他自身免疫和代谢疾病肠道宏基因组的比较为了更好地理解在更广泛的慢性疾病背景下肠道微生物在痛风中的作用，我们利用公共病例对照宏基因组数据集比较了痛风与AS、RA、T2D和OB患者的肠道微生物特征，其中前两者是自身免疫性疾病，后两者是代谢性疾病。不同数据集中病例对照比较中所有基因的P值分布表明，与其他四种疾病相比，痛风患者的总体肠道微生物生态失调程度居中（图6a）。当控制研究样本量时也观察到类似的结果。进一步评估每种类型疾病的微生物分类和功能特征我们发现，由于痛风患者和AS患者共享了40个差异物种，这两种疾病就分类学特征方面更为相似（图6b），而RA与代谢性疾病OB和T2D聚集在一起。在微生物功能方面，痛风与RA和AS聚集在一起（图6c）。具体而言，氧化磷酸化、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、原核生物碳固定途径和碳青霉烯类生物合成中的基因常在痛风、AS和RA患者中富集，而细菌趋化和鞭毛组装中的基因在所有三种疾病中均被耗尽。这些结果表明，与代谢性疾病相比，痛风患者的微生态失调特征与自身免疫性疾病更相似，这意味着肠道菌群可能对自身免疫性疾病的发生发挥共同的影响。然而，在自身免疫性疾病中肠道菌群如何与宿主相互作用仍不清楚，这值得进一步对其机制进行深入研究。
图6 痛风与其他自身免疫性和代谢性疾病肠道微生物组的比较。a在AS（n = 211）、痛风（n = 140）、OB（n = 200）、RA（n = 169）以及T2D（n = 268）数据集中，通过Wilcoxon秩和检验进行病例对照比较，确定所有微生物基因的P值分布；b在AS、痛风、OB、RA和T2D中不同种属的比较，其中紫色代表在健康对照人群中富集，红色代表在患者中富集；星号表示在0.05水平上具有显著性差异；c代表AS、痛风、OB、RA和T2D中微生物基因功能的比较，其中紫色代表在健康对照人群中富集，红色代表在患者中富集。
综上所述，我们确定了与痛风相关的肠道微生物组中的分类学和功能特征，并根据我们的结果提出了肠道微生物如何影响痛风发生的假设模型。在痛风患者中，拟杆菌和普雷沃菌属中的菌种富集超过肠杆菌科的菌种，这可能导致六酰基链脂质A的生物合成改变为具有四或五个酰基链脂质A，并且可能在宿主免疫刺激和内毒素耐受中均产生负面影响。同时，肠杆菌科细菌的耗竭可能导致尿酸降解功能障碍，从而导致全身尿酸蓄积增加和痛风炎症的发生。其他微生物功能，如SCFAs的产生和鞭毛组装可能有助于维持健康的肠道微环境，这些功能在痛风中的耗竭可能通过修饰其各自宿主受体导致局部或全身炎症增加。我们的结果显示痛风患者肠道微生物组的微生态失调与SUA和全身炎症增加相关，随着时间的推移，通过降低尿酸和抗炎药物干预可能会部分恢复。为了更好地理解痛风肠道菌群的潜在机制，未来需要进行更大规模的纵向队列研究和动物模型实验来验证我们的发现。
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