科研 | Cell Host & Microbe:肠道微生物通过三甲胺-N-氧化物途径影响中风严重程度

2021
09/29

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微生态
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编译:微科盟蓝胖儿,编辑:微科盟汤貝、江舜尧。


导读  
临床研究表明,肠道微生物群衍生代谢产物三甲胺-N-氧化物(TMAO)的循环水平和中风风险之间存在关联。然而,肠道微生物在中风中的因果关系尚未得到证实。本研究表明肠道微生物通过饮食添加胆碱产生TMAO,直接影响脑梗死面积和中风后的不良后果。将产生低TMAO和高TMAO的人类受试者的粪便微生物移植到无菌小鼠体内,表明TMAO产生和中风严重程度都是可传送的特征。此外,采用多种小鼠中风模型,并将经过基因工程的人类共体确定的微生物群落移植到无菌小鼠体内,本研究证明微生物cutC基因(胆碱转化为TMA的酶源)足以促进TMA/TMAO的产生,增加脑梗死面积,并导致功能障碍。因此,本研究揭示了肠道微生物群,特别是代谢体TMAO途径,直接影响中风的严重程度。  

 

论文ID


 

名:Gut microbes impact stroke severity via the trimethylamine N-oxide pathway

肠道微生物通过三甲胺-N-氧化物途径影响中风严重程度

期刊Cell Host & Microbe

IF:21.023

发表时间:2021.7.14

通讯作者:Weifei Zhu & Stanley L. Hazen

通讯作者单位:美国克利夫兰医学中心心血管与代谢组学科学系


实验设计



结果


TMAO的产生和中风的严重程度是人类粪便微生物移植的可传送特征
我们之前报道过TMAO与血栓事件风险增加有关(心肌梗塞或中风)。与血浆TMAO水平较低(<2.43 μM )的受试者相比,TMAO水平在(6.18-312 μM)范围内的四分之一的受试者在随后的3年内发生血栓事件的风险增加了1.64倍。在另一项研究中,胆碱激发后高循环TMAO水平与低循环TMAO水平供体的肠道共生体的微生物移植,显示了对动脉损伤后受体小鼠血小板反应性和血栓形成潜能有不同的影响。由于血小板反应性参与脑血管疾病(包括中风),我们最初试图使用类似的人类粪便移植模型来测试肠道微生物群是否会影响中风的严重程度。从最近报道的人类干预研究中的人类粪便材料中选择稳定的多微生物群落供体。选择了两名献血者,在连续血浆TMAO测试后,一名献血者的TMAO水平持续较高(范围为34.2-44.3 μM),另一名献血者的TMAO水平持续较低(2.1-3.5 μM)。小鼠经口灌胃定植,维持胆碱补充饮食(1% w/w)。在粪便移植后5天,利用小鼠血栓缺血性中风模型实施中风损伤,以造成脑血管损伤,因为据报道,该模型可启动血小板激活以产生局部缺血,并适用于BSL-2控制条件。图1A-1C显示了研究的总体设计、活体染料染色的冠状横截面图像,以及中风损伤后24小时在受体小鼠中观察到的梗死体积和血浆TMAO水平的量化。值得注意的是,通过“高”与“低”TMAO供体粪便微生物免疫接种的无菌小鼠表现出明显的循环血浆TMAO水平(~15倍;p<0.0001)的差异(图1C)。此外,所有受试者的全身 TMAO 水平与中风严重程度之间的关系测定显示出显著的正相关(r=0.44p=0.03),与低TMAO组相比,高TMAO组梗死体积更大( p =0.008;图1B1C)。
接下来,我们通过16S rRNA基因测序分析检测了人类供体粪便样本和所有无菌小鼠受体盲肠内容物中的微生物群落扩增序列变异(ASVs)结构,然后进行差异丰度分析。非度量多维标度分析(NMDS)显示低TMAO(蓝色,n=12)和高TMAO(红色,n=13)受体具有显著的聚集性(Permanova<0.05R2=0.55)(图1D)。分层聚类分析证实了两组之间的分离(图1E)。两两比较确定了在低TMAO和高TMAO群落之间存在差异的ASVs(图1F)。此外,我们还发现了盲肠菌群(即ASVs),其丰度与受体血浆TMAO水平或病变大小相关。总之,我们观察到19ASVs的比例与血浆TMAO水平显著相关(错误发现率[FDR]调整p<0.01)。其中,12ASVs与血浆TMAO和病变大小显著相关(p<0.005)。值得注意的是,在每种情况下,与较高血浆TMAO水平正相关的微生物类群也与病变大小相关。有趣的是,大多数已鉴定的细菌ASVs的丰度的特征是高TMAO受体(图1F也与更严重的中风表型呈正相关,即更大的梗死体积)(图1GS1b;有关检测到的所有ASVs的完整列表,请参见表S1)。
 

1 中风严重程度是一种可传送的特征。A)粪便微生物移植研究设计方案。B)各组小鼠经TTC染色的2 mm连续脑切片的代表性图像,以及小鼠血浆TMAO水平和梗死体积。C)中风后24小时定量测定梗死体积和血浆TMAO水平。图中显示的是小鼠数量的平均值(±SEM);通过Mann-Whitney U检验显著性。D)基于Bray-Curtis距离的受体和供体群体之间的NMDS图。使用PERMANOVA进行统计分析。E)采用非加权对组法对人类供体和受体小鼠的算术平均值进行分层聚类。分支长度表示基于未加权UniFrac距离矩阵的分离距离。FWhite的非参数t检验分析(使用Benjamini-Hochberg对错误发现率进行p值校正)确定了低与高TMAO受体小鼠的特征。G)图示受体盲肠微生物中鉴定的三种分类群,其丰度与低(n=12)和高(n=13TMAO受体小鼠的血浆TMAO水平和梗死体积显著相关。xy方向上的值绘制为平均值±SEM显示稳定Hotelling T2测试的p值。

 
2 饮食中补充胆碱或TMAO会增加脑梗死面积和中风后运动功能缺陷
在另外的研究中,我们检验了饮食中补充胆碱(提高血浆TMAO)或直接TMAO喂养是否会影响中风的严重程度。常规饲养的C57BL/6小鼠分别饲喂对照饮食(0.08%总胆碱)、添加TMAO0.12% w/w)或添加胆碱(1% w/w)的饮食。动物饲喂各自指定的饮食3周,使用血栓缺血性中风模型进行脑损伤。在脑损伤后24小时评估血浆TMAO水平和梗死体积(图2A)。研究人员采用两种方法(独立实验)来检测和量化脑梗死体积:(1)计算机图像捕获的氯化三苯基四氮唑染色(TTC);(2)磁共振成像(MRIT2扫描。如图2B-2DTTC)和图2E-2GMRI T2)所示,补充TMAO和胆碱均显著升高小鼠血浆TMAO水平,同时显著增加脑梗死体积。此外,在两项研究中,所有饮食组小鼠的TMAO水平与中风严重程度(梗死体积)显著相关(TTC 定量 ρ =0.72p<0.0001,图2DMRI T2定量ρ=0.64p=0.01,图2G)。
在单独的研究中,为了探索胆碱-TMAO通路是否会加剧中风后功能缺陷,动物饲喂指定的饮食3周,然后在中风前、中风损伤后24小时和中风后5天(继续使用相同的饮食)进行各种功能分析。值得注意的是,中风前,与对照饮食组和TMAO添加饮食组相比,添加胆碱饮食组的平均运动速度和总运动距离明显略有增加(图S2A)。在比较不同饮食组中风前后的功能时,与中风后对照饮食组相比,补充TMAO和胆碱的中风后小鼠在所有运动活动指标上均显著降低(图S2A)。图2H显示了每一饮食组小鼠中风前后的功能对比,在检测时间点,对照饮食组小鼠中风前后的功能没有显著变化;对于监测的不同功能指标(露天试验中移动的总距离和平均速度,所有比较均为p≤0.03),胆碱饮食组和TMAO补充饮食组小鼠中风后功能均显著降低了20%-30%(图2H)。在另一项研究中,从中风前3周开始,将小鼠置于对照组(n=20)或补充胆碱(n=20)的饮食中,然后在中风前或中风后(13,和5天)进行埋珠实验(30分钟),在每个时间点对每一饮食组的5只小鼠进行试验。虽然中风前对照组和胆碱饮食组之间未观察到显著差异,但中风后胆碱饮食组小鼠埋珠数量显著减少(图S2B)。
 

图2 添加TMAO和胆碱可增加光化学缺血性中风模型的梗死体积和运动功能缺陷。(A)研究设计方案说明。(B-G)给小鼠喂食指定的饮食3周。在中风24小时后定量测定TMAO水平和脑梗死体积。(B)用TTC染色的2 mm连续脑切片的代表性图像。(C)定量测定梗死体积和血浆TMAO水平。(D)各组小鼠血浆TMAO水平与梗死体积之间的相关性(Spearman’s)。(E)MRI T2扫描的代表性图像。(F)定量测定梗死体积和血浆TMAO水平。(G)各组小鼠血浆TMAO水平与梗死体积的相关性(Spearman’s)。(H)采用露天试验评价中风后24 h的运动活动。移动的总距离(左)和平均速度(右)表示为每只老鼠中风前减少的百分比。条形和须状表示所示小鼠数量的平均值(±SEM)。显著性使用Mann-Whitney U test对两组进行比较。

 
在另一组研究中,我们检测了饮食添加胆碱提高TMAO水平是否会影响另一种中风模型- 大脑中动脉闭塞模型( MCAO)。将小鼠(雄性和雌性C57BL/6)分别饲喂对照饮食或添加胆碱的饮食3周,然后通过单丝插入颈内动脉诱发大脑中动脉中风(图3A)。在手术过程中,通过实时激光多普勒血流监测,脑血流下降(相对基线下降80%)证实了缺血。在中风损伤后(24小时),通过TTC染色评估血浆TMAO水平和脑梗死体积(对侧的%)。如图3B3C所示,胆碱补充可增加血浆TMAO水平,并导致脑梗死体积显著增加。值得注意的是,中风后24小时的食物摄入减少导致血浆TMAO水平相对较低。尽管如此,所有饮食组的雌雄小鼠中,血浆TMAO水平与中风严重程度(梗死体积)高度正相关(TTC定量ρ=0.51p=0.006,图3D)。为了探索MCAO术后较长时间内的功能恢复,我们评估了小鼠恢复/再灌注后10-15天内在开放领域, Barnes 迷宫和Y迷宫的表现。如图3E-3G所示,与对照组相比,通过野外测试进行评估发现添加胆碱饮食的小鼠运动功能恢复较慢;而通过Barnes迷宫(空间学习和记忆)和Y迷宫对不同组动物进行评估,该组小鼠认知恢复较差。中风损伤前对照组和胆碱饮食组之间无差异。
 

图3 胆碱饮食可提高MCAO中风模型中TMAO的生成和中风严重程度。(A)研究设计方案说明。(B)每组用TTC染色的2 mm连续脑切片的代表性图像。(C)定量测定血浆TMAO水平和梗死体积(%对侧)。显著性采用Mann-Whitney U检验。(D)各组小鼠血浆TMAO水平与梗死体积的相关性(Spearman’s)。(E-G)给C57BL/6雌性小鼠饲喂食指定饮食3周,MCAO中风后在指定时间进行多项功能测试。(E)露天实验。(F)Barnes迷宫。(G)Y迷宫。数据显示为表示小鼠数量的平均值(±SEM)。采用非参数单因素方差分析确定总体显著性(Kruskal-Wallis [K.W.])。通过Mann-Whitney U检验确定对照饮食组和胆碱饮食组之间的显著性。

 
3 肠道微生物CutC足以在宿主内传递升高的TMAO水平和中风严重程度(脑梗塞和功能缺陷)
在其他研究中,我们试图测试一种功能性肠道微生物CutC,一种主要的胆碱TMA裂解酶,是否能提高体内中风的严重程度。在这些研究中(图4A所示方案),添加胆碱饮食的无菌小鼠使用遗传上易于控制的合成细菌群落进行定植,这些细菌群落为人类肠道中的多种优势菌门,经证实缺乏产生TMA的能力(由直肠真杆菌、产气柯林斯菌、多形拟杆菌、卵形拟杆菌和粪便拟杆菌组成;并称为“core”)。此外,一个小鼠亚群还定植了core+ 野生型生孢梭菌 Cs),其中包含已知的功能性cutC(组称为core+Cs),另一个亚群定植了缺乏功能性CutC酶的core+Cs突变体(组称为core+ ΔcutC Cs)。正如预期的那样,只有以core+Cs群体定植的无菌小鼠血浆中TMAO水平升高,而core+ΔcutCCs定植的无菌小鼠血浆中TMAO水平最低(图4A4B)。值得注意的是,当各组小鼠使用血栓缺血性中风模型进行中风损伤后,TMAO水平升高的小鼠( core+Cs 受体)中风程度更严重(图4B)。使用埋珠实验对三种微生物群落的受试者进行中风后运动活动和一般认知功能评估,该试验非常适合用于无菌动物。在拥有最高TMAO水平的core+Cs群体中,动物埋珠数量明显少于corecore+ΔcutCCs群体(图4C)。进一步调查发现,在所有无菌受试者中,血浆TMAO与中风严重程度之间存在显著正相关关系( ρ =0.45p=0.008;图4D,左)。同样,TMAO水平与所有组小鼠埋珠数量呈负相关(ρ=-0.31p=0.08;图4D,右)。我们还发现,在所有组小鼠中,梗死体积与埋珠数量呈负相关(ρ=-0.48p=0.004;图4E)。
按照STAR方法评估受体小鼠的盲肠微生物组成。值得注意的是,虽然野生型生孢梭菌仅占整个肠道群落的一小部分(~0.004%,图4F,右图),但相对于缺乏TMA产生能力的群体定植小鼠,这仍足以促进循环TMAO水平和脑梗死体积的显著增加以及中风后宿主功能结果的降低(core,或core+ΔcutCCs;图4)。

图4 含有cutC/D的人类共体的无菌小鼠的微生物定植足以增强的中风严重程度。(A)总体研究设计方案,包括用指定的合成细菌群落对无菌小鼠进行定植。2周后,小鼠接受光化学中风损伤,然后按照STAR方法评估TMAO水平和中风严重程度。(B)TTC染色后定量测定梗死体积以及血浆TMAO水平图中显示的是小鼠数量的平均值(±SEM)。(C)指定组的埋珠试验(总共25个弹珠)。(D)各组小鼠的梗死体积与血浆TMAO水平(左图)或弹珠埋藏数量(右图)之间的相关性(Spearman’s)。(E)盲肠微生物群落组成。两组比较采用Mann-Whitney U检验,多组比较采用单因素方差分析。


讨论


总之,本文的结果表明,肠道微生物群,特别是微生物胆碱TMAO)途径,影响宿主中风严重程度和产生不良功能。值得注意的是,这些发现与许多最近的临床相关性研究一致,这些研究报告了短暂性脑缺血发作(TIA)或中风史受试者循环TMAO水平升高与中风风险升高和不良临床结局之间的相关性。使用两种独立的小鼠中风模型(血栓性缺血性中风模型和MCAO中风模型)观察到了类似的结果,并对中风严重程度和功能(梗死体积、开放视野活动度、埋珠、BarnesY迷宫)进行了测量。此外,饮食中补充胆碱(以及TMAO)既能增加脑梗死面积,又能导致中风后更严重的功能缺损,这也具有临床意义。众所周知,西方饮食和富含红肉的饮食都会显著提高TMAO水平,许多流行病学研究表明,这些饮食与中风风险之间存在显著关联。目前的研究与之前的临床研究相结合,将TMAO与中风风险联系起来,表明对中风风险高的受试者进行饮食干预值得进一步研究。
目前的研究增加了许多将肠道微生物群与人类健康和疾病易感性相关联的数据。循环中的TMAO是由微生物代谢TMA的前体,如磷脂酰胆碱和胆碱,西方饮食中通常富含这些前体。到目前为止,已经鉴定出多种产生TMA酶的复合物(cutC/DCntA/BYea W/X)可以代谢胆碱,其中cutC/D是最普遍和研究最充分的。在此进行的微生物移植研究表明,功能性肠道微生物CutC显著增加中风梗死面积,并恶化中风后的功能结果。此外,cutC的基因中断挽救了TMAO相关的中风严重程度。因此,有趣的是,最近的研究表明,在替代性动脉损伤模型中,以肠道微生物cutC和胆碱TMA裂解酶活性为药物靶点可以降低血栓形成风险。有必要进一步研究肠道微生物TMAO通路作为预防或治疗中风的潜在治疗靶点。此外,在低TMAO状态和高TMAO状态下,脑梗死体积和功能结果的差异是显著的,更好地理解TMAO驱动中风风险的潜在机制是一个非常有趣的领域。


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关键词:
TMAO,三甲胺,氧化物,微生物,肠道,科研,水平,体积

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