前沿观点 | Science：微生物群如何改善免疫治疗？

微生物群在免疫治疗中起辅助作用的最令人信服的证据之一来自最近的临床研究，该研究表明，相比于移植对程序性细胞死亡蛋白1 (programmed cell death protein 1，PD-1) 免疫检查点治疗无反应者的粪便微生物群，移植对PD-1免疫检查点治疗有反应的黑色素瘤患者的粪便微生物群更能提高这些PD-1抑制剂在既往治疗难治的黑色素瘤患者中的疗效^9-10。就目前来说，我们面临着一个巨大的挑战：确定已经被界定的微生物的作用机制，其中的原因在于微生物群非凡的多样性和迄今确定的致病微生物或途径各不相同^3-7。

Griffin等人将肠球菌属Enterococcus作为研究对象，因为Enterococcus是目前学者们描述的与接受免疫检查点治疗的患者反应相关的类群之一^5,6。通过研究，作者发现该属中的多个物种能够促进小鼠肿瘤模型中对PD-1配体1 (PD-1 ligand 1，PD-L1) 免疫治疗的反应。值得注意的是，免疫治疗活性肠球菌（immunotherapy-active enterococci）包括常见的人类共生粪肠球菌Enterococcus faecium，而其他物种如粪肠球菌E. faecalis不提供保护。作者在前人研究的指导下，对细菌细胞壁的主要结构成分粪肠肽聚糖 (E. faecium peptideglycan) 的独特组成进行了研究，并对免疫治疗活性和非活性肠球菌的肽聚糖结构进行比较，发现肽聚糖模式与免疫治疗反应增强相关。通过比较基因组分析，Griffin等人确定了一组肽聚糖水解酶，包括肽聚糖水解酶分泌抗原A (secreted antigen A，SagA)，这些酶在E. faecalis异位表达时足以产生应答。这依赖于先天免疫传感器核苷酸结合寡聚结构域含蛋白2 (nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2，NOD2)，它可以识别肽聚糖衍生的多肽。有趣的是，NOD配体与微生物群的免疫调节作用有关，包括造血作用、对疫苗的反应和对克罗恩病（Crohn’s disease，CD）的易感性^11-13。

Griffin等人在了解特定共生物种促进免疫治疗反应的机制方面迈出了关键一步，但目前尚不清楚NOD2配体的作用类型以及这些配体如何导致抗肿瘤免疫增强。虽然NOD1广泛表达，但NOD2的表达仅限于免疫细胞和某些非造血细胞群体，如肠上皮细胞（intestinal epithelial cells）¹³。发生该现象的一种可能是NOD2配体也作用于肿瘤微环境中的髓系细胞及其引流淋巴结，促进抗肿瘤适应性免疫。值得注意的是，最近的一项研究显示，基于NOD2配体的治疗方法可以调节骨髓的生成，导致髓系细胞的表观遗传重组，从而能够克服免疫抑制肿瘤微环境¹⁴。

Griffin等人在免疫检查点封锁的背景下，对能够提供微生物与其抗肿瘤作用之间的分子联系的少量研究进行了详细阐述^7,15（见以下示意图）。

微生物群加强免疫疗法示意图：微生物群可通过多种机制影响肿瘤免疫治疗的反应，包括与肿瘤细胞交叉反应的噬菌体抗原，细胞壁衍生的多肽，如谷氨酰基穆氨酰基二肽 (glutaminylmuramyl-dipeptide GMDP) 和共源肌苷（commensal-derived inosine），所有这些在免疫检查点封锁治疗的背景下集中于增强对肿瘤的1型免疫。

附缩写：APC, antigen-presenting cell（抗原呈递细胞）; CTLA-4, cytotoxic T-lymphocyte protein 4（细胞毒性T淋巴细胞蛋白4）; IFN-g, interferon-g（干扰素-g）; IL-12, interleukin-12（白细胞介素-12）; PD-1, programmed cell death protein 1（程序性细胞死亡蛋白1）; SagA, secreted antigen A（分泌抗原A）.

之前的一项研究发现，来自共生菌的肌苷是假长双歧杆菌Bifidobacterium pseudolongum和嗜粘蛋白-艾克曼菌Akkermansia muciniphila 的关键决定因素，通过促进1型免疫增强免疫检查点封锁的抗肿瘤疗效（一类T细胞介导的免疫反应，与对病原体的保护反应有关）⁷。同样，Griffin等人发现肠球菌Enterococcus-衍生的肽聚糖促进了肿瘤微环境中细胞毒性CD8⁺ T细胞的积累和相关的先天反应。已有研究在临床前模型和在癌症免疫治疗中有反应的患者中观察到微生物群和1型免疫增强之间的类似联系^2-6。综上所述，这些观察主张在免疫治疗辅助微生物可能作为一种中枢效应机制集中于1型免疫，但是单个微生物类群参与的上游途径可能是环境和微生物依赖的。

了解微生物群在改善免疫检查点治疗反应（immune checkpoint therapy）中的作用机制是我们能够利用它们进行靶向辅助治疗的关键。免疫检查点治疗的最佳反应可能涉及微生物群的许多非互斥和协同效应。例如，有研究证明肠球菌噬菌体（Enterococcus bacteriophage）和肿瘤抗原之间的共同抗原会促进在抗PD1治疗后与肿瘤抗原发生交叉反应的共体特异性T细胞生成¹⁵。此外，在免疫治疗的背景下，已被定义的保护性细菌也可以促进共体特异性的适应性免疫反应^3,6。这些共体特异性反应是否在抗肿瘤作用中发挥积极作用，或是否仅仅是这些细菌免疫刺激活动的副产物，仍有待确定。最后，共生体向肿瘤床的转移也被认为是一种潜在的抗肿瘤机制²，这可能会由于免疫治疗造成的屏障破坏而增强。

Griffin等人的研究通过设计重现微生物群效应的靶向疗法，为利用内源性佐剂治疗癌症开辟了一条途径。这项研究还进一步说明，研究重点需要从“大海捞针（needle-in-the-haystack）”的单一微生物作为致病因子转向可用药的规范途径和分子决定因素的识别。

癌症免疫疗法（Cancer immunotherapy）利用患者的免疫系统来阻止肿瘤的生长，并在治疗各种实体和血液肿瘤方面取得了临床成功。然而，患者对免疫检查点抑制剂的反应是可变的。检查点封锁的成功依赖于许多因素，包括恶性肿瘤的突变负担，成功的肿瘤抗原呈递，淋巴细胞的募集和浸润和肿瘤微环境中的信号线索。最近，肠道菌群已成为与抗CTLA4、抗PD-1和抗PD-L1癌症免疫疗法疗效相关的一个强有力的因素。在动物和人类队列中，特定微生物物种的存在与肿瘤对检查点封锁剂的反应性相关。这些微生物的抗肿瘤活性在共居、粪菌移植或直接接种的临床前小鼠模型中得到了重现，这表明相关微生物是改善治疗反应的直接病原体。然而，我们对免疫调节微生物的分子机制所知甚少。

为了解释在肠球菌属Enterococcus中观察到的种特异性差异，Griffin等人检查了它们免疫调节活性的可能来源，发现E. faecium具有独特的肽聚糖组成和重塑能力，以增强宿主对肠道病原体的耐受性。为了比较不同种类Enterococcus的肽聚糖组成，Griffin等人从每个种类的肠球菌中分离囊，使用高效液相色谱-质谱 (high-performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS) 分析消化的肽聚糖片段。所有4种免疫治疗活性肠球菌 (E. faecium, E. durans, E. hirae和E. mundtii) 都显示出类似的肽聚糖片段模式，与E. faecalis和E. gallinarum (Egm) 的非活性菌株截然不同。然而，所有4种免疫治疗活性菌株都显示出大量较小的、非交联的肽聚糖片段，这表明肽聚糖重塑和周转水平较高。通过分析，作者鉴定出NlpC/p60水解酶簇，该簇在所有活性肠球菌中高度保守。同时为了确定是否在接受癌症免疫治疗的人类患者中发现了这些类SagA酶，Griffin等人使用E. faecium Com15 SagA的NlpC/p60结构域对检查点封锁治疗前患者的临床宏基因组数据进行了序列比对，还通过比对SagA NlpC/p60结构域和人类微生物组计划中的基因组进一步证实了SagA在人类中存在同源性。

另外，除了抗PD - L1治疗B16-F10黑色素瘤，Griffin等人还探索了表达SagA的细菌是否也能提高其他检查点抗体对不同类型癌细胞的疗效--利用MCA205纤维肉瘤或MC38结直肠癌细胞在抗生素预处理、肠球菌定殖的动物体内建立皮下肿瘤，然后分别用抗PD-1或抗CTLA-4免疫治疗，证明当动物与表达SagA的肠球菌和检查点抑制剂共同治疗时，肿瘤生长显著下降。而为了更好地理解多肽增强检查点封锁的机制，Griffin等人使用单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 对B16黑色素瘤模型中肿瘤浸润白细胞进行了分析，发现用活性MDP-_L,D异构体治疗的肿瘤显示肿瘤内T淋巴细胞的比例显著增加。Griffin等人还观察到，在MDP-_L,D治疗后，骨髓细胞群发生了显著变化，所有巨噬细胞群减少，而以Cx3cr1和Nr4a1表达为特征的特定单核细胞群增加。正如预期的那样，在多个髓系人群中观察到少见但可检测到的NOD2表达。

该研究数据表明，具有独特NlpC/p60肽聚糖水解酶活性的肠球菌可以产生具有NOD2活性的胞壁肽，并在体内调节检查点封锁免疫治疗的效果。此外，Griffin等人的结果表明，肽聚糖重塑酶可能被作为一种新的治疗方法用于重组益生菌，以提高检查点封锁抑制剂的疗效。最后，该发现证实了大量新出现的证据，即通过MDP及其类似物刺激NOD2可以通过多种途径改变宿主免疫，包括直接激活巨噬细胞清除肿瘤细胞，单核细胞表观遗传重编程，产生传统的1型树突状细胞和激发树突状细胞交叉呈现到CD8⁺ T细胞，这两者都与训练免疫有关。因此，该研究强调微生物生产或合成的小分子可以激活肽聚糖模式识别受体，作为下一代免疫治疗的佐剂。

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