编译：微科盟韬儿，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
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导读
农业生态系统中，施用经抗生素处理的家畜粪肥可能会将抗生素、耐药性细菌和耐药性基因（ARGs）传播到土壤中。虽然抗生素耐药性的环境传播是人类健康的一个主要问题，但是很少有研究关注施用含抗生素的家畜粪便对土壤微生物群落的长期效应。我们向土壤中重复施用含抗生素的牛粪，持续三年，研究其对土壤微生物群落结构和ARG丰度的影响。牛粪施用改变土壤细菌和真菌群落，与施用不含抗生素的牛粪处理相比，施用含抗生素的牛粪改变了土壤细菌群落，但不改变真菌群落。另外，和不施用牛粪处理相比，施用不含抗生素的牛粪使ARGs丰度增加；但是，和施用不含抗生素的牛粪处理相比，施用含抗生素的牛粪不改变ARG丰度的总体分布。最后，虽然不同年份间的细菌和真菌群落结构和ARG丰度有差异，但是牛粪处理对它们的效应在三年内是持续的。综上，我们的结果表明，长期重复施用有机肥和和抗生素对土壤微生物群落结构有长期且持续的效应。此外，应对抗生素耐药性危机的土壤管理策略应该考虑更大的粪肥管理背景。
原名：Application of manure from cattle administered antibiotics has sustained multi-year impacts on soil resistome and microbial community structure
译名：施用含抗生素的牛粪对土壤耐药基因和微生物群落结构的持续影响
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：7.609
发表时间：2021.4.11
通讯作者：Sarah Shawver
通讯作者单位：美国弗吉尼亚理工大学植物与环境科学学院
该实验设置在弗吉尼亚理工大学肯特兰研究农场，研究位点没有放牧、使用粪肥或其它物质的历史。所采集的样品和使用的数据源于长期施用牛粪的草地（2014-2017年）。实验设置6个小区，每个小区4个处理，包括不施用牛粪的对照（NM），施用不含抗生素牛粪的对照（CON），施用含苄星头孢匹林的牛粪（CEPH），施用含吡利霉素盐酸盐的牛粪（PIR）。在牛服用抗生素2-3天后收集其粪便，每年收集一次，混匀后于-20oC保存备用；2014年11月开始，每月以648 g m-2的浓度施用牛粪，持续3年。第一次施肥后的8个月、1年和2年，在每个小区采集10 cm深的土样，共采集72个土样。通过标记基因扩增测序的方法分析微生物群落结构，qPCR测定每个样品的总细菌绝对丰度，用微流体qPCR （ mfqPCR）定量每个样品中47个不同基因的丰度，用以定 量ARGs的绝对丰度。
三年实验中，施用牛粪影响细菌（F3,68 =1.81，P = 0.001，图1A）和真菌（F3,71 =2.90，P = 0.001，图1B）群落结构。与不施用处理相比，施用不含抗生素的牛粪显著改变细菌（F1,44 = 1.58，P = 0.02）和真菌群落结构（F1,44 = 2.87，P = 0.01）。NM和CON处理间，16种细菌的OTUs丰度不同（图1C）。CON处理中，除Latescibacteria门的一种OTU外，所有其他响应的OTU都降低。大多数响应的OTUs都属于变形菌和拟杆菌。能鉴别到属水平的细菌包括拟杆菌门的黄杆菌，变形菌门的Cellvibrio、Dovosia和Methylotenera，疣微菌门的Luteolibacter。对于真菌，NM和CON之间有44个响应的OTUs，且大多数来自子囊菌门（图1D）。这些微生物中，子囊菌门的Preussia，Phialophora、Scedosporium和Chaetomium，担子菌门的Agrocybe和Panaeolus的丰度在CON处理中更高。NM处理中球囊菌门的Paraglomus和担子菌门的Psilocybe的丰度更高。与施用不含抗生素的牛粪处理相比，施用含抗生素的牛粪也改变细菌群落结构。CEPH和PIR处理中细菌群落结构与CON处理不同（CEPH和PIR处理下F和P值分别是F1,44 = 2.29，P = 0.003；F1,44 = 3.05，P = 0.003）。更重要的是，CEPH和PIR处理的细菌群落变化方向与NM和CON相反（图1A）。与NM和CON间的变化相似，大多数响应的OTUs丰度在CON与CEPH、PIR间不同，后两者的OTU属于变形菌和拟杆菌。另外，和CON相比，处理间大多数响应的OTUs都在施用含抗生素牛粪处理中增加，但有一些例外（图1C）。除主要的处理效应外，不同年份间的细菌群落结构不同（F2，68 = 2.20，P = 0.001），不同年份细菌群落结构也不同（所有P < 0.05，图1A）。年份对差异的解释度与处理相似（R2 = 0.060和0.075），但是与施牛粪处理相比，年际间响应的细菌OTUs很少。大多数响应的细菌OTUs都属于变形菌，大多数丰度变化都较小。和细菌相比，三年实验中，与不施用牛粪或含抗生素的牛粪相比，不同处理的真菌群落结构没有差异。虽然CEPH和PIR与NM处理的真菌群落不同（P < 0.05），但与CON处理没有差异（P = 0.035和0.44），这表明主要是牛粪施用，而不是抗生素处理引起真菌群落变化。年际间的真菌群落不同（F3，71 = 15.76，P = 0.001），且每一年也不一样（所有P < 0.05，图1B）。和细菌相比，年份对差异的解释量大于处理（R2 = 0.297和0.082）。2015年，大多数响应的真菌OTUs都不同，且主要属于子囊菌和担子菌。
图1. 土壤细菌（16S，A）/真菌（ITS，B）群落在处理和年际间相似性的主坐标分析。点表示每个处理和年份组合的中心，误差棒表示标准误。图例中标在上方的字母表示处理和年际间的显著差异（基于PERMANOVA方法）。处理对间的倍数变化在细菌（C）和真菌（D）处理对之间显著不同。括号中的百分数表示所有样品中每个属的平均相对丰度。每个点是一个OTU，用颜色代表门和属的分类。
在mfqPCR矩阵的47个ARGs中，至少有一个样品检测到33个，至少20%的样品检测到18个。大多数普遍存在的基因包括intI1，blaSHV，tet(W)和floR，其在样品检测到的比例分别是97%，96%，81%和80%。所有样品中ARGs丰度最高的是blaSHV，intI1，floR和mexB，每克土壤中分别有7.6±1.7，6.2±1.2，4.4±2.4和4.3±3.3（平均值±标准误）的指数拷贝数。因为mfqPCR技术能为许多ARGs提供数据，我们用两种方法来评估ARG丰度的变化。首先，我们用PCoA和PERMANOVA比较不同处理和年份间ARGs的组成。然而，ARG丰度的总体组成没有变化，但该结果并不能表明单个ARGs没有重要的生物学变化。因此，我们进一步用Mann-Whitney U检验来明确所有ARGs的丰度变化。当考虑ARG的绝对丰度时（每克土壤的拷贝数），不同处理间ARG丰度的总体组成不同（R2 = 0.53，F3,71 = 26.6，P = 0.001，图2A），但是年际间的差异非常小（R2 = 0.02，F3,71 = 2.80，P = 0.069，图2A）。处理间的成对差异，只有NM和其它三个处理显著（P < 0.05）。不管是牛粪是否含有抗生素，施用牛粪都增加了单个ARGs丰度（图2B）。基于Mann-Whitney U检验，施用牛粪的所有处理（CON、CEPH和PIR）中的11个基因（包括整合酶基因和四环素类、磺胺类和氨基糖苷类抗性基因）的丰度都比NM高。此外，CON处理中四环素耐受基因tet（A）丰度比NM高，CEPH和PIR处理的aadD和tet（L）丰度比NM高，PIR处理的merA丰度比NM高，但是blaSHV丰度却比NM低。总ARG谱没有明显变化，但并不能排除单个基因有重要的生物学差异。然而，当对CON、CEPH和PIR处理中的单个基因进行分析时，所检测到的唯一显著差异是PIR处理比CON有更高的tet（L）丰度。
图2. PCoA分析可视化mfqPCR定量的ARGs（A）在处理和年际间的相似性（A）。点表示每个处理和年份组合的中心，误差棒表示标准误。图例中标在上方的字母表示处理和年际间的显著差异（基于PERMANOVA方法）。在每个处理和年份的20%的样中所观察到CON、CEPH和PIR到NM基因的绝对丰度的Log2差异倍数（B）。所有样品基因共现性的Jaccard’s指数（C）。
年际（F2,71 = 1.68，P = 0.19）和处理间（F3,71 = 0.65，P = 0.58）的16S rRNA基因丰度没有差异。然而，当我们将ARG丰度标准化为16S rRNA基因丰度时，影响ARGs因素的重要性发生变化。施用牛粪处理对标准化的ARG组成的效应有微弱的显著性（F3,71 = 1.83，P = 0.078，图3）。但是对于处理间的成对比较，FDR矫正的P值小于0.05。相反地，年份对标准化的ARG组成的差异有更大的解释度（R2 = 0.10，F2,71 = 8.44，P = 0.001，图3），每年的ARG组成具有显著差异（P < 0.05）。当分析不同处理间单个基因差异时，结果几乎与绝对ARG丰度相同，例外的是，blaSHV在PIR和NM处理间，tet(L)在PIR和CON处理间没有显著差异（图3B）。最后，因为微流体
qPCR同时评估了几种基因的丰度，我们也能检测ARGs间的共现性。基于所有样品有或者没有的基因，我们用Jaccard’s指数量化所有可能的ARG对的共现性。几个基因（strB、sul1、sul2、florR和tet(W)）在相同样品中有共发生的趋势（Jaccard’s指数≥0.80，图2C）。另外intI1趋向于和florR、tet(W)共发生。同时，几个基因（cadA，merA，tet(A)和tet(L)）的Jaccard’s指数都较低，这表明它们不会和土壤中其它ARGs产生共现性。
图3. PCoA分析可视化用mfqPCR定量的总ARG谱（标准化为16S细菌丰度）在处理和年际间的相似性（A）。点表示每个处理和年份组合的中心，误差棒表示标准误。图例中标在上方的字母表示处理和年际间的显著差异（基于PERMANOVA方法）。在每个处理和年份的20%的样品中观察到CON、CEPH和PIR处理相对于NM处理每1×107个拷贝数ARG的Log2差异倍数（B）。本研究的一个关键结果是，含不同抗生素的牛粪对土壤微生物群落结构具有重要的影响，但是不同微生物群落的响应不同。这和之前的研究结果相似，施用牛粪改变细菌群落结构。营养和有机质施用很可能是影响土壤细菌和真菌群落的重要因素。例如，CON处理中的细菌OTUs增加，且大多是变形菌和拟杆菌，它们都是典型的富营养型细菌。同样地，土壤真菌群落对碳氮比和有机质输入很敏感。粪肥施用增加的真菌属包括Mortierella和Taphrinia，它们也是富营养真菌，以及Panaeolus和Preussia通常与粪肥相关。和施用不含抗生素的牛粪处理相比，含两种抗生素的牛粪（CEPH和PIR）施用改变了土壤细菌群落，且方向与NM处理相反（图1A）。这表明，不含和含抗生素的牛粪对细菌群落结构的影响存在明显差异不同。之前的研究还发现，粪肥施用或粪肥加抗生素共同施用下土壤微生物群落组成存在差异。在响应的类群落中，含两种抗生素的处理中相对丰度较高的两种细菌属与之前的研究显示的施用抗生素后相对丰度增加的细菌属相匹配，包括Leuteoliacter和Devosia。两个含抗生素的牛粪处理中的其他属（Salinibacterium和Cellvibrio）对不同化学扰动物质有耐受性。另外，我们识别了PIR处理中的几种细菌属的丰度比CON高，包括不可培养的Verrucomicrobia Da101、Adhaeribacter、Dokdonella，Candidatus Xiphinematobacter和Demequina，之前的研究都没有报道过它们对抗生素的响应。我们还观察到所有处理中细菌和真菌群落结构在年际间的时间动态变化，这一点很重要。虽然这个研究不是设计来识别微生物群落随时间变化的驱动因素，但是气候条件很可能是一个关键的影响因子。2015年取样前一周，当地气象站记录显示2015（3 mm）的总降雨比2016（24 mm）和2017年（34 mm）低，土壤湿度对土壤微生物群落结构的影响是已知的。本研究另外一个重要的发现是，不论牛粪是否含抗生素，土壤中ARG的组成都随牛粪施用而不同。这是出乎意料的，因为考虑到之前的研究已经报道过施用牛粪和抗生素的土壤ARG丰度比施用不含抗生素的牛粪高。然而，也有研究观察到施用不含抗生素的动物粪便使ARG丰度增加。同样需要注意的是，研究结果可能与特定的研究条件相关，还需要研究进一步明确这是否是一个普适效应。如果不含抗生素的牛粪对ARG丰度有很大的影响，那么要慎重考虑对AMR的管理。另外，虽然不施用牛粪的对照土壤中ARG丰度低，但是仍然可以检测到大量ARGs。抗生素和耐药性基因通常普遍存在于自然土壤中，因此，我们不能期望任何土壤中不含ARGs，即使是那些没有被扰动的生态系统。使用mfqPCR允许我们检测大范围的ARGs，基于抗生素治疗的应用，许多基因以意想不到的方式发生变化。和NM处理相比，牛粪处理中至少有一个处理有15个基因丰度增加，其中两个基因（
bl
aSHV和
ermF
）对我们研究中用的抗生素产生耐药性。另外，ermF对林可酰胺类抗生素具有耐药性，例如吡利霉素，但是和NM处理相比，所有施用牛粪的处理中ermF丰度更高。blaSHV对β-内酰胺具有耐药性，例如头孢匹林，它的响应跟我们普遍的认识不同，和PIR处理相比，它的丰度在NM处理中更高，但是它的丰度在NM和CEPH处理间没有差异。对于ARGs的增加，一个可能的解释是共选择，当在单个质粒上发现多个ARGs时会发生共选择。在这种情况下，接触一种抗生素可以增加对多种抗生素的耐药性。这也许可以帮助解释几种基因趋向于共发生的现象。虽然土壤中ARGs的绝对丰度可以作为AMR总量的指标，但是很难解释这种变化。ARG丰度是有问题的，因为他们会由于总细菌的增加或者个别细菌的选择而改变。对于后者，将ARG丰度标准化为总16S rRNA基因丰度可以作为细菌相对数量的更好指标。例如，我们发现，处理对ARG组成差异的解释更大，但是对标准化为16S rRNA基因丰度的解释较小。因此，ARG组成间的模式似乎和细菌丰度总体变化相关，但是我们的研究还不能解释，因为我们没有检测到处理间16S rRNA基因丰度的显著变化。尽管标准化为16S rRNA的ARG组成没有显著差异，单个ARGs的标准化丰度的变化有许多显著性差异。实际上，当比较标准化ARG丰度时，大多成对比较结果都具有显著差异。处理间的16S拷贝数没有显著差异，这表明施用牛粪增加ARG丰度是AMR选择的结果，不单是细菌丰度增加所致。细菌数量增加及对更多耐药性细菌的选择对于ARG丰度的数量和AMR的拼接都很重要。为了明确怎样才能最好地监测和管理土壤系统中的AMR，有必要开展更多的研究来明确人类健康和风险传播是否与其中的某种变化相关。调整土壤和粪肥管理来解决AMR危机需要更好的理解和方法。土壤微生物对含抗生素的粪肥的响应因微生物群落和时间而不同。我们发现，施用含不同抗生素的牛粪，土壤细菌和真菌的响应具有很大的差异。具体来说，与施用不含抗生素的牛粪和不施用牛粪处理相比，施用含抗生素的牛粪影响细菌群落结构。与之相比，不论牛粪是否含抗生素，真菌群落结构仅受牛粪施用的影响。极为重要的是，我们还发现，与不施用牛粪处理相比，施用不含抗生素的牛粪增加ARG丰度，但在是否含抗生素的牛粪处理间几乎没有差异。最后，我们观察到，微生物群落结构随时间变化，重复施用牛粪多年都能检测到这些变化。显然，我们需要更好地理解除抗生素以外的其他因素在更长的时间尺度上对AMR的影响。未来的研究应该1）进一步检测微生物碳底物可利用性、营养状态和环境因素对微生物群落响应抗生素和粪肥的潜在影响，2）更严格地检测多个控制因素间可能的相互作用。
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