科研 | 利用丁酸盐产生菌降低乙酰辅酶A途径是酒精诱导的小鼠功能性肠道微生物失调和肝脏疾病发展的关键致病特征

2021-09-26 17:04

我们的发现证实了产生丁酸盐细菌和丁酸盐基因的缺失是酒精诱导的微生物失调的标志特征，并且在酒精相关肝病的发展中起着重要的因果作用。

编译：微科盟郝恬，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

导读

最新的研究已经确立了肠-肝轴在酒精相关性肝病(ALD)发展中的关键作用。本研究采用16S rRNA测序和全基因组鸟枪法(WGS)宏基因组分析，结合修订的微生物数据集，全面详细地描述了长期酒精摄入对丁酸盐产生菌群落和相关丁酸盐代谢途径的影响。本研究数据表明，厚壁菌门中属于不同科的丁酸盐产生菌属的减少，是酒精诱导的生态失调的重要组成部分。围绕丁酸合成途径的全细菌基因组的WGS分析提供了与丁酸合成相关的微生物组的功能特征。数据显示，在对照组小鼠微生物组中，乙酰辅酶A (CoA)丁酸合成途径最为普遍，长期酒精摄入可显著最大限度地降低丁酸合成途径。进一步的WGS分析显示：i)通过识别两个关键基因的减少验证了酒精诱导的乙酰辅酶A途径的减少，这两种关键基因是将丁酰辅酶A脱氢酶转变为丁酸盐过程中编码末端酶的but（丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶）和buk（丁酸激酶），ii)检测含有but和buk基因的丁酸盐产生菌的特定分类群。值得注意的是，丁酸盐前药三丁酸甘油酯(Tb)，能显著阻止酒精诱导的丁酸盐产生菌减少，缓解肝脂肪变性、炎症和损伤。综上所述，我们的研究结果表明，通过乙酰辅酶A途径导致丁酸盐产生菌减少是酒精诱导的微生物失调和ALD的一个重要致病特征，可以针对其进行治疗。

论文ID

原名：Decrease inacetyl-CoA pathway utilizing butyrate-producing bacteria is a key pathogenic feature of alcohol-induced functional gut microbial dysbiosis and development of liver disease in mice

译名：利用丁酸盐产生菌降低乙酰辅酶A途径是酒精诱导的小鼠功能性肠道菌群失调和肝脏疾病发展的关键致病特征

期刊：Gut Microbes

IF：10.245

发表时间：2021.8.7

通讯作者：Shirish Barve

通讯作者单位：路易斯维尔大学医学院

实验设计

结果

1 长期酒精摄入导致肠道微生物多样性下降

评估了长期酒精摄入和口服Tb对肠道微生物多样性的影响。在长期酒精摄入的初始阶段（1周），代表样本内变异的α稀疏曲线在治疗组之间没有显著差异（图1a）。7周后，酒精摄入导致曲线饱和点低于对照，表明微生物多样性随着时间的推移而降低（图1a）。检验Tb给药对酒精诱导的肠道微生物群变化的影响，发现α稀疏曲线在对照组和酒精+Tb之间保持不变。这些数据表明，Tb可以阻止酒精诱导的微生物多样性减少。此外，α多样性指数Chao1（测量物种丰富度）和Shannon指数（测量物种均匀度）在第7周进行了检验。数据显示，与对照组相比，摄入酒精组的两种多样性指数都显著下降（图1b）。这种酒精诱导的多样性降低被Tb给药显著阻止（图1b）。总的来说，预测性α多样性指数表明，随着时间的推移，长期酒精摄入会显著降低微生物多样性，这可以通过服用Tb来抵消。

此外，利用PCA分析，通过检查治疗组之间微生物群落的差异来评估β多样性。第1周，PC图显示，服用Tb对酒精诱导的肠道微生物组成变化没有显著影响（图1c）。然而，在给药7周后，开始出现差异。这些数据表明，早在慢性酒精摄入的1周内，就能引起微生物组成的变动，这种变动在7周内持续增加。重要的是，通过服用Tb减轻了酒精引起的微生物群落的变化，阻止了随着时间（7周）的推移而严重的微生物生态失调。

图1. 通过16S分析在长期酒精摄入的小鼠中观察到微生物多样性降低和独特的微生物组成。A）摄入一周和七周后的α稀疏曲线，B）α多样性指数：测量物种丰富度的Chao1指数（左）和测量物种均匀度的Shannon指数（右）。

2 酒精诱导的生物失调的特征是丁酸盐产生菌减少

根据我们早期的工作，目前的数据表明，长期酒精摄入诱导的肠道微生物失调涉及厚壁菌门的显著减少（图2a）。重要的是，厚壁菌门包含很多产丁酸盐细菌属。已证明在肠道中，酒精会降低短链脂肪酸的水平，尤其是丁酸盐。由于丁酸盐的减少可能是由酒精诱导的肠道微生物失调引起的，比如厚壁菌门的减少，我们研究了该门产丁酸盐细菌群落的状况。在厚壁菌门所有产丁酸细菌中，我们发现酒精摄入导致最大的产丁酸细菌毛螺旋菌科大量减少（图2a）。此外，我们通过参考了其他文献综述提供的产丁酸菌目录，确定了长期酒精摄入对八个科的36个不同产丁酸菌属的影响。

与对照相比，长期酒精摄入导致4个科的13个潜在产丁酸菌属的相对丰度显著下降。具体来说，I）毛螺菌科—涉及Anaerostipes、Coprococcus、Roseburia、Dorea、Johnsonella、Shuttleworthia和Pseudobutyrivibrio，II）瘤胃球菌科—涉及Ruminococcus、Oscillibacter、Butyricicoccus，III）梭菌科—涉及Caminicella，IV）韦荣球菌科—涉及粪芽孢菌属（表1；酒精组与对照组）。有趣的是，与对照组相比，Tb除了起到丁酸盐前药的作用外，还阻止了酒精诱导的13个产丁酸盐细菌属中的12个菌属的减少（表1；酒精+Tb与对照组）。此外，酒精与酒精+Tb的比较（表1）也表明，酒精对产丁酸盐菌属的负面影响因Tb而减轻。总的来说，这些结果表明，酒精诱导的生物失调的一个重要组成部分涉及几种产丁酸盐菌属的减少，这可以通过补充Tb来预防。

图2. 在长期摄入酒精小鼠中观察到的产丁酸盐细菌分类群相对丰度降低。A）厚壁菌门（左）和毛螺菌科（右）的相对丰度显著降低。B）热图显示了不同组别（对照组、酒精组和酒精+Tb组）对16S测序鉴定的厚壁菌门36个不同产丁酸盐菌属的影响。

表1. 酒精诱导产丁酸盐细菌属的减少。

3 乙醇和三丁酸甘油酯对丁酸合成基因功能的预测

在分类分析之后，我们使用推断的宏基因组学研究了酒精和Tb对与丁酸盐合成相关的微生物组功能特征的影响。丁酸盐合成基因的预测是根据内部更新的丁酸盐基因清单（表SII）从PICRUSt输出获得的。预测分析显示，酒精处理后的动物肠道菌群中与四种丁酸合成途径即乙酰辅酶A、赖氨酸、4-氨基丁酸和戊二酸途径有关的丁酸合成基因丰度显著下降（图3a和表2）。此外，假设的三丁酸甘油酯酯酶（estA）基因水解Tb产生丁酸盐，也会因长期酒精摄入而显著减少，这表明酒精可能会降低肠道微生物组从膳食Tb中获得丁酸盐的能力（图3a和表2）。盲肠丁酸盐水平的降低证实了摄入酒精小鼠肠道微生物组合成丁酸能力下降（图S1）。此外，进行Taxa PICRUST分析定性地将减少的丁酸合成基因归类于不同的细菌属。该分析表明，毛螺菌科和瘤胃球菌科是酒精诱导的所有四种途径中丁酸合成基因减少的主要菌科（补充图S2）。Tb的补充显著阻止了酒精诱导的丁酸合成基因的减少（表2；补充图S2）。

图3. 长期酒精摄入小鼠中观察到的丁酸合成基因丰度的降低。

表2. 酒精诱导丁酸合成基因的减少。

4 乙醇和三丁酸甘油酯影响丁酸合成途径的全基因组鸟枪法（WGS）分析

PICRUSt分析提供了丁酸盐合成基因与相关分类群的假定关联后，我们采用WGS测序来量化和验证酒精对丁酸合成途径的影响。通过使用Vital等人2017年提供的丁酸盐产生菌数据库，以显示丁酸盐合成途径的细菌基因组总数的百分比，计算生产丁酸盐细菌的丰度百分比。结果表明，在对照组小鼠中，通过乙酰辅酶A途径产生丁酸盐的微生物组占25.1%，通过4-氨基丁酸、戊二酸、赖氨酸途径的微生物组占3.1%、2.9%和1.3%（图4a）。长期酒精摄入对参与乙酰辅酶A途径的细菌影响最大，服用Tb部分阻止了它们丰度的降低（图4b）。在乙酰辅酶A途径中，将丁酰辅酶A转化为丁酸盐所需的两种主要末端酶由but（丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶）和buk（丁酸激酶）编码，可作为生物标志物用于识别受酒精影响的产丁酸盐细菌（图4c）。对单个分类群的分析进一步表明，表现出but（例如，Oscillibacter、Pseudoflavonifractor和Flavonifractor）、buk（例如，Lachinospiraceae_Bacillus_28.4和Lachinospiraceae_Bacillus_10-1）和两种酶（Lachinospiraceae_Bacillus_A4、Lachinospiraceae_bacterium_COE1、Coprococcus、Clostridium Cluster XVIa和Clostridium_sp_KNHs209）的类群受到影响。对于这些产丁酸盐的分类群中的大多数而言，通过服用Tb可以阻止酒精诱导的减少（图4d）。

图4. 酒精诱导的丁酸盐合成途径显著减少。对所有三个组（对照组、酒精组和酒精+Tb组）进行了WGS分析。A&B）在微生物组中丁酸盐合成通路的细菌的百分比丰度和C）在乙酰辅酶A途径中观察到的两种主要末端酶but丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶和buk丁酸激酶的百分比丰度和D）最丰富的产丁酸盐分类群的百分比-buk，but或者两者都包含。

5 三丁酸甘油酯缓解了酒精介导的产丁酸细菌减少引起的脂肪性肝炎和肝损伤

除了改善产生丁酸细菌的减少之外，服用Tb还显著阻止了酒精诱导的血清内毒素水平的升高，内毒素水平能反应肠道通透性和微生物移位（图5a）。此外，我们还研究了服用Tb对肝脂肪变性、炎症和损伤的影响，这些是酒精诱导的肠道失调的主要病理后果。数据显示，Tb不仅与阻止产生丁酸盐细菌减少相关，还显著改善了宏观和微观的脂肪变性（H&E染色）、肝脏甘油三酯水平和脂质积聚（油红O染色）（图5b-C）。与肝脂肪变性相关，酒精+Tb治疗的动物中酒精诱导的肝炎症也显著缓解。Tb组F4/80+ Kupffer细胞/巨噬细胞明显减少（图5d），与ALD相关的促炎趋化因子CCl2的基因表达也减少（图5e）。此外，Tb组小鼠肝损伤标志物丙氨酸转氨酶（AST）和天冬氨酸转氨酶（ALT）的升高这个症状也得到了显著改善（图5f）。

图5. Tb缓解了酒精诱导的肠道和肝脏的改变。A）通过测量血清内毒素水平（EU/ml）来分析肠道通透性，B）通过H&E染色来评估宏观和微观肝脂肪变性的显微照片，C）通过油红O染色来描述肝脂质积聚的显微照片，D）通过Kupffer 细胞/巨噬细胞的F4/80⁺染色来描述肝炎症的显微照片，E）促炎趋化因子CCl2的基因表达（倍数变化）和F）肝损伤标记物ALT丙氨酸转氨酶和AST天冬氨酸转氨酶的水平（U/ml）。

结果

本研究的主要目的是阐明长期酒精摄入对微生物生物失调驱动的功能后果的影响，这可能与ALD发病机制有关。越来越多的人认识到，为了恢复肠-肝轴的功能，必须对酒精诱导的肠道微生物组的变化以及相关细菌基因和代谢物组成的特征进行分析。我们和其他人所做的工作表明，酒精诱导的功能性生物失调可能包括SCFAs的下降，特别是丁酸盐，会促进肝脏脂肪变性、炎症和损伤。重要的是，丁酸盐是结肠细胞的主要能源物，它能维持紧密连接蛋白、肠屏障完整性、肠内环境稳定和肝细胞增殖。丁酸盐还在肠固有层中表现出抗炎活性，并通过抑制组蛋白脱乙酰酶来调节基因表达。在目前的工作中，对小鼠肠道产丁酸盐细菌初步分类评估，从16S rRNA基因测序推断，长期酒精摄入导致厚壁菌门显著减少，其中大多数属于门内的不同科。重要的是，我们进一步利用充分证实的产生丁酸盐细菌的清单和宏基因组分析，确定了厚壁菌门中因长期摄入酒精而减少的产丁酸盐细菌群落。特别是，我们发现酒精诱导的异常生物效应主要导致毛螺菌科中产丁酸盐细菌的减少，毛螺菌科是厚壁菌门中最大的产丁酸盐细菌群落。相比之下，其他已知产丁酸盐细菌的科总体上没有明显下降；然而，其中包含的几个特定的产丁酸菌属由于长期的摄入酒精而显著减少。几个酒精引起的肝硬化和酒精相关性肝炎患者的临床报告也指出了毛螺菌科和疣微菌科的下降。这支持了我们临床前动物模型发现的临床相关性，该模型全面详细说明了长期摄入酒精对产丁酸菌属的影响。

全基因组鸟枪法测序（WGS）分析进一步提供了C57BL/6N小鼠肠道微生物组中受酒精影响的产丁酸盐细菌的更深入更详细的分类群评估和丰度估计。有趣的是，这些数据证明了人类和对照组C57BL/6N小鼠肠道微生物组中产生丁酸盐细菌类型的固有差异。特别是，大多数在人类肠道微生物中发现的产丁酸盐细菌在C57BL/6N小鼠肠道微生物组中没有观察到，在早期研究中也没有报道，如Eubacterium rectale、Faecalibacterium prausnitzii和Clostridium leptum。然而，重要的是，这些数据表明，在C57BL/6 N小鼠肠道微生物组中，观察到多个细菌科产丁酸盐细菌的减少，包含 i ）构成了总体多样性损失的主要组成部分，在长期酒精暴露后随着时间的推移多样性逐渐下降，ii）对应于丁酸盐合成功能的损失，如盲肠丁酸盐水平的降低。

16S rRNA基因测序和WGS宏基因组分析不仅全面详细描述了产丁酸盐的微生物群落，还详细描述了受长期酒精摄入影响的丁酸盐代谢途径。早期的研究表明，在产生丁酸盐的微生物群落中，靶向完整的途径是预测丁酸盐生成的更有说服力的方法。因此，我们对肠道微生物组丁酸盐生成进行宏基因组分析，确定乙酰辅酶A途径是酒精显著降低的主要途径。此外，酒精导致乙酰辅酶A途径减少的效应是丁酸盐产生减少和微生物组功能失调的一个非常重要和相关的组成部分，因为i）与赖氨酸、戊二酸和4-氨基丁酸途径相比，通过乙酰辅酶A途径产生丁酸盐更占优势，ii）乙酰辅酶A途径的减少不能被其他途径表达和丰度的增加充分补偿。值得注意的是，小鼠微生物组成与人类有相似之处，都是乙酰辅酶A是大多数产丁酸盐细菌合成丁酸盐的主要途径。综上所述，这些发现提供了一个代谢框架，这是研究ALD发病机制中受损的丁酸功能的一个重要的初始步骤。此外，WGS宏基因组分析表明酒精诱导but和buk基因的丰度降低，他们是编码乙酰辅酶A途径的关键末端丁酸酶（图S3）。利用这一关键信息，还鉴定了含有but和buk基因的最丰富分类群的百分比。

在 ALD，Tb给药有效缓解酒精诱导的产丁酸细菌减少和丁酸生成功能丧失的致病作用。肠-肝轴在ALD疾病的发展进程中的作用已得到公认。我们最近的研究表明，口服Tb增加了肝门静脉中丁酸盐的浓度，丁酸盐通过调节参与酒精诱导的肝脂肪变性和损伤的致病表观遗传机制对肝脏发挥保护作用。

重要的是，目前的研究表明，在7周的研究期间，通过服用Tb，酒精诱导的某些产丁酸盐细菌的减少显著减弱。这些数据表明，通过更长时间的补充Tb有可能进一步增加其他几种丁酸盐生产者的数量，导致丁酸盐合成关键基因（but和buk）的增加，从而增加乙酰辅酶A利用细菌的丰度。Tb，一种丁酸盐前体药物对产丁酸盐菌群的影响和保护作用是一个意外的发现，因为它提供了缓解饮酒引起的丁酸盐缺乏和肝脏问题。因此，这项研究揭示了Tb的一种新的肝保护作用，这种作用也包括减轻酒精诱导的肠道生态失调。

总之，我们的发现证实了产生丁酸盐细菌和丁酸盐基因的缺失是酒精诱导的微生物失调的标志特征，并且在酒精相关肝病的发展中起着重要的因果作用。重要的是，该研究确定了产丁酸盐细菌的相关性，该种细菌可作为潜在的益生菌用于治疗酒精诱导的肠道生态失调和肝病的发展。此外，进一步的研究可以将Tb作为基于营养的ALD预防性治疗策略的主要组成部分。这项研究的未来方向将是识别其他相关细菌种类以及结合酒精影响的功能结果，以制定针对ALD的治疗策略。